藍狐母系起源及譜系重建

聶子涵 武曉宇 孫 鍇 樊 攀 魏 來 劉志平* 李 波，3，4*

(1.東北林業(yè)大學野生動物與自然保護地學院，哈爾濱，150040；2.哈爾濱華隆藍狐育種有限公司，哈爾濱，150129；3.國家林業(yè)和草原局野生動植物檢測中心，哈爾濱，150040；4.國家林業(yè)和草原局野生動物保護與利用工程技術研究中心，哈爾濱，150040)

藍狐是圈養(yǎng)北極狐(Vulpexlagopus)的主要品種，我國自1956年從芬蘭引種進行人工飼養(yǎng)，2005年飼養(yǎng)量已達1 000萬只[1]，2011年狐皮產(chǎn)量已占世界總產(chǎn)量的38%[2]。但由于缺乏有效的管理措施，種獸后代逐年退化，因而無法擺脫重復引種的局面。據(jù)統(tǒng)計，1996—2006年，我國從芬蘭引進的種公狐超6萬只，占我國種狐數(shù)量的5%[3]。不斷地引進種源只能滿足一時之需，通過科學有效的遺傳管理來保持我國藍狐的優(yōu)良性狀才是根本的解決辦法。目前，圈養(yǎng)種群的遺傳管理普遍基于譜系，同時利用遺傳標記進行親權(quán)鑒定來檢驗譜系信息。宗文麗[4]利用9個微衛(wèi)星位點對北極狐進行親權(quán)鑒定，結(jié)果顯示，微衛(wèi)星累積排除率可達99.99%。白玉妍[5]利用微衛(wèi)星標記對藍狐進行單親親權(quán)鑒定，找出了4個譜系丟失子代的母本，同時發(fā)現(xiàn)譜系記錄中2只子代的記錄錯誤。劉麗等[6]利用微衛(wèi)星分子標記，根據(jù)后代遺傳質(zhì)量的預測判定最佳的配對方案，為圈養(yǎng)北極狐遺傳管理提供參考。此外，Sacks等[7]利用微衛(wèi)星和線粒體D-Loop兩種分子標記成功鑒別了圈養(yǎng)和野生北極狐種群。Dalén等[8]利用線粒體高變區(qū)部分序列分析北極狐種群的遺傳關系，確定了種群間的基因交流。本研究選用犬科試劑盒(Canine ISAG STR Parentage Kit)對藍狐樣本進行擴增，通過復合擴增可以在短時間內(nèi)獲得多個基因座的分型結(jié)果，具有高檢測效率、低成本、低耗材等優(yōu)勢；利用線粒體D-Loop序列分析追溯藍狐種群的母系起源，同時利用試劑盒中的微衛(wèi)星位點鑒別藍狐個體親緣關系，為藍狐種群的管理和繁育提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

選取哈爾濱華隆藍狐育種有限公司2016、2017年從芬蘭中南部引進的原種芬蘭藍狐繁育后代122只，其中涉及親權(quán)鑒定的53只(表1)，其余為隨機選取。利用非損傷法采集帶有毛囊的毛樣本為試驗材料，樣本涵蓋原種藍狐繁殖的第1代、第2代和第3代。親子鑒定部分樣本見表1。所選母狐采用2種人工授精模式：“A-B-A”模式(即第1次、第3次輸精選用同一只種公狐精液，第2次選用另一只)和“A-B/A-B-C”模式(第2和第3次均選用不同種公狐精液進行輸精)。

表1 藍狐親權(quán)鑒定部分樣本Tab.1 Parentage identification of some blue fox samples

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取

利用基因組提取試劑盒(上海百賽生物工程技術有限公司)對樣本基因組DNA進行提取，所有操作均按照說明書要求進行。提取的DNA原液于-20℃保存。

1.2.2 PCR擴增與測序

使用引物VVProf/VVCRR2[9]擴增線粒體D-Loop部分序列。PCR擴增體系為50.0 μL，包括2×EasyTaqSuperMix(Transgen，北京)25.0 μL，正反向引物各0.5 μL(10 μmol/L)，ddH2O 19.0 μL，DNA模板5.0 μL。擴增采用DNA擴增儀PE-9700型和2400型(PE，美國)，反應程序為：94℃預變性5 min；94℃變性45 s，55℃退火30 s，72℃延伸70 s，40個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物用質(zhì)量分數(shù)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分離(220 V，25 min)。后將PCR產(chǎn)物送至哈爾濱擎科生物有限公司，采用原引物進行雙向測序。

利用Canine ISAG STR Parentage Kit犬科試劑盒擴增具有親緣關系的53個藍狐樣本，PCR擴增程序為：98℃預變性3 min；98℃變性15 s，60℃退火75 s，72℃延伸30 s，30個循環(huán)；72℃再延伸5 min，4℃終止反應。PCR擴增體系為10.0 μL，包括DNA模板(15 ng/μL)1.0 μL，Canine STR Master Mix 4.5 μL，Canine 22 STR Primer Panel 4.5 μL。后將PCR產(chǎn)物用ABI3100 Genetic Anslyzer檢測分型(上海生工生物工程股份有限公司)。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

從GenBank下載產(chǎn)于西伯利亞(AF365961—AF365966)和瑞典(AF365967—AF365968)北極狐的10個mtDNA D-Loop單倍型序列，以及北極狐(KP200876.1)、赤狐(Vulpesvulpes，AF098155)和貉(Nyctereutesprocyonoides，MG256392.1)全基因序列。在系統(tǒng)發(fā)育分析中采用貉作為外群。本研究所用的全部序列信息詳見表2。

表2 藍狐系統(tǒng)發(fā)育分析采用的物種序列信息Tab.2 Species sequence information used in phylogenetic analysis of blue fox

將試驗所得序列用DNAstar軟件包中的SeqMan程序進行拼接，根據(jù)峰圖對序列內(nèi)部位點進行人工校對。利用Clustal X軟件對序列進行比對。利用MEGA 5.2軟件計算堿基組成[12]。利用DnaSP 6軟件確定單倍型并計算單倍型多樣性(Hd)、核苷酸多樣性(Pi)及平均核苷酸差異(K)等[13]。

選用最大似然法(ML)和貝葉斯推論法(BBI)進行系統(tǒng)發(fā)育分析。在MEGA 5.2軟件中計算核苷酸最佳替代模型，并根據(jù)貝葉斯信息準則(BIC)選擇最佳模型Hasegawa-Kishino-Yano+G(HKY+G)[14]。利用IQ-TREE構(gòu)建ML樹[15]；使用MrBayes.2.1構(gòu)建貝葉斯樹[16]。

微衛(wèi)星數(shù)據(jù)利用Cervus軟件計算每個位點的基因頻率(P)及多態(tài)信息含量(PIC)。為保證微衛(wèi)星標記提供的遺傳信息可靠，在篩選時，將等位基因數(shù)≥4，多態(tài)信息含量≥0.5作為選擇標準[17-18]。篩選出可用的微衛(wèi)星位點后，統(tǒng)計各位點的等位基因數(shù)(Na)、觀察雜合度(Ho)、期望雜合度(He)、排除概率(EP)等信息。微衛(wèi)星位點存在著突變，因此為確保其準確性，在進行親權(quán)鑒定時要使用多個遺傳標記系統(tǒng)，根據(jù)公式求得累計非父排除概率(CPE)。

式中：n為遺傳標記數(shù)，EPi為第i系統(tǒng)的非父排除概率。

根據(jù)微衛(wèi)星位點等位基因的片段大小，參照配種記錄，利用Cervus軟件對父子關系不清的后代進行分析，以確定這些后代的生物學父親。

2 結(jié)果與分析

2.1 母系世系

122份樣本共測得116條線粒體D-Loop區(qū)序列，其中8份測序結(jié)果出現(xiàn)雜峰或信號弱的問題而被舍棄。序列分析僅定義了1個單倍型?；诰€粒體D-Loop區(qū)序列單倍型構(gòu)建最大似然樹及貝葉斯樹，2種樹的拓撲結(jié)構(gòu)大致相同。線粒體D-Loop區(qū)的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)表明，瑞典單倍型Swe1、Swe2彼此分離，未被歸在同一世系中，說明世系的劃分與種群所在地點間無必然聯(lián)系，也表明瑞典種群與西伯利亞種群之間存在緊密聯(lián)系。樣本單倍型hap_1與西伯利亞Sib2及瑞典圈養(yǎng)種群FF1單倍型聚集在同一分支中，說明圈養(yǎng)建群者部分個體可能來源于西伯利亞野生種群。

2.2 微衛(wèi)星位點篩選和應用

利用犬科試劑盒和Cervus軟件計算篩選適應于藍狐種群的微衛(wèi)星位點，結(jié)果表明，4個位點無擴增產(chǎn)物；1個位點片段分布范圍內(nèi)有多個強度接近的信號峰，難以準確分型；3個位點的等位基因數(shù)小于4；另有3個位點的多態(tài)信息含量在0.5以下。舍棄以上位點后共篩選出11個位點用于后續(xù)分析。經(jīng)分型的53份樣本中，3份由于峰圖效果不好被舍棄，其余50只藍狐個體各微衛(wèi)星位點特征見表3，位點多態(tài)性參數(shù)見表4。

由表3得知，各位點的等位基因數(shù)為4—9個，11個位點共有等位基因67個，平均等位基因數(shù)為6.09個。各位點基因頻率有差異，部分位點的等位基因頻率偏低，例如：位點AHTk211中的B片段、REN54P11中的C片段和INU030中的D片段的頻率僅為0.010 0；位點FH2054中的A、C、D片段和REN162C04中的A、C片段的頻率也僅為0.010 2。

表3 藍狐各位點等位基因及等位基因頻率Tab.3 The allele and the allele frequency of each locus in blue fox

由表4可知，該群體有高的多態(tài)性，表現(xiàn)為有較高的雜合度。樣本群體在不同的微衛(wèi)星位點期望雜合度范圍是0.575 4—0.806 1，平均0.676 9；觀察雜合度的變動范圍為0.200 0—0.880 0，平均0.649 2；期望雜合度和觀察雜合度的最大差值為0.396 8，最小差值為0.007 0。將各標記的觀察值與期望值的差值同觀察值作比得到一個比值，該比值最大為1.984 0，最小為0.010 6，除INU030位點比值大于0.5外，其余10個位點比值均小于0.5，占位點總數(shù)的90.91%。觀察值與期望值的差異較小，能進一步說明微衛(wèi)星位點選取的合理性。此外，多態(tài)信息含量0.514 7—0.767 4，平均0.623 9。多態(tài)信息含量越大，意味著在一個群體中，該位點上的雜合子比例就越大，提供的遺傳信息就越多。在母子關系不清的情況下，單個微衛(wèi)星標記排除概率為0.579 3—0.823 3，累計排除概率為0.999 999；在母子關系確定的條件下，單個微衛(wèi)星標記排除概率為0.401 1—0.682 8，累計排除概率為0.999 912。

表4 藍狐微衛(wèi)星位點的多態(tài)性參數(shù)Tab.4 Polymorphic parameters of microsatellite locus in blue fox

基于配種記錄和個體微衛(wèi)星分型結(jié)果，進行父子關系不清的父權(quán)排除，結(jié)果見表5。個體53、60、109、110由于候選父親樣本不全，未成功找到真實父親，其余11只仔狐成功找到生物學父親。配種母狐中，9只采用“A-B-A”方式進行配種，從其后代選取的11只仔狐中，4只為“A”種公狐的后代，5只為“B”種公狐的后代；通過排除法可知109和110的真父為“B”種公狐。因此，真父為B種公狐的子代為7只，占子代數(shù)目的64%。采用“A-B/A-B-C”方式配種的母狐子代，由于數(shù)量較少，未做統(tǒng)計。通過子代61和110可知，在同一窩中，存在多重父權(quán)的現(xiàn)象。

表5 藍狐親權(quán)鑒定的結(jié)果Tab.5 Results of paternity test of blue fox

3 討論

系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，樣本種群與瑞典圈養(yǎng)種群及西伯利亞野生種群有緊密聯(lián)系。本研究所選藍狐皆由從芬蘭中南部城市引進的原種芬蘭藍狐繁育而成，在20世紀五六十年代，芬蘭因養(yǎng)殖需求曾從挪威購買狐種獸[19]，因為當時芬諾斯堪底亞(Fennoscandia)地區(qū)養(yǎng)狐業(yè)特別興旺發(fā)達[20]。此前的研究[8]確定了芬諾斯堪底亞種群與西伯利亞種群間的關聯(lián)，2個種群在科拉半島可能存在一個基因交流接觸帶。由此推斷，樣本種群與瑞典圈養(yǎng)種群起源于西伯利亞野生種群。

本研究通過等位基因數(shù)和多態(tài)信息含量2項標準共篩選出11個可用位點，多態(tài)信息含量均大于0.5，等位基因數(shù)為4—9個。部分等位基因的頻率較低，從群體遺傳學的角度來看，這些低頻的等位基因在群體中可能沒有起到作用，如果進一步近親交配，會導致這些基因逐漸消失；伴隨著基因的減少，群體生存能力可能會下降[4]。經(jīng)計算，11個微衛(wèi)星位點的累計排除概率為99.99%，達到鄭秀芬[21]衡量用于親權(quán)鑒定的分子標記的標準。由親權(quán)鑒定結(jié)果可知，“A-B-A”授精模式下，母狐經(jīng)2次輸精后成功受孕的概率為64%。這是因為在發(fā)情測試儀數(shù)字化的直觀顯示下，藍狐交配或人工授精時間在陰道電阻達到最大值后24—48 h內(nèi)達到最佳點[19]。在實踐中，母藍狐的輸精時間可以相應拖遲0.5—1.0 d以達到更好的效果。母狐的受孕率受種狐的選育、精液的品質(zhì)、人工授精的時機和技術、精子的體外保存等多重因素影響[22]。依據(jù)親權(quán)鑒定結(jié)果、母狐平均妊娠期(52 d)、結(jié)合母狐產(chǎn)仔日期及輸精時間等因素來推斷其余4只母狐受孕時間，初步得到此種模式下母狐經(jīng)1次、3次輸精成功受孕的概率相等，均為18%。同時，研究發(fā)現(xiàn)在同一窩仔狐中存在多重父權(quán)的現(xiàn)象。在多胎動物中，如果雌性在一個發(fā)情周期中排出多枚卵子，并與多個雄性輪替交配，就可能產(chǎn)生多重父權(quán)[23-26]。但藍狐為季節(jié)性單次發(fā)情動物，在人工授精過程中，對發(fā)情母狐每天僅采用1只公狐的精液進行輸精，不存在混合輸精的情況。有關母狐的排卵時間的持續(xù)性目前尚無準確的說法，但劉志平[22]曾分別使用藍狐、銀狐(Vulpesvulpesfulva)精液在不同日期為同只母藍狐進行輸精，其后代在同一窩仔中既出現(xiàn)了雜種藍霜狐，又出現(xiàn)了純種藍狐。宗文麗[4]對北極狐進行父權(quán)排除后也發(fā)現(xiàn)，在同一窩中，存在一母多父的現(xiàn)象。同時布隆斯泰特等[19]提出，在經(jīng)2次輸精后受孕的雌狐產(chǎn)下的一窩仔狐中，仔狐的父本可能不同，不應該按照慣例把第2次提供精液的公狐當作仔狐的唯一父本。此種情況雖為個別現(xiàn)象，但在育種過程中，應盡量避免人為因素產(chǎn)生的影響。

綜上，藍狐種群僅存在一個單倍型，血統(tǒng)單一。結(jié)合已知親緣關系資料對不明確的親權(quán)關系進行親權(quán)鑒定，可以建立準確的譜系，有助于開展科學的選種選育、降低近交的概率，進而保持種群的優(yōu)良性狀。