我國(guó)東北地區(qū)鼩鼱屬物種的系統(tǒng)發(fā)生地位COⅠ和16S rRNA分析
——基于線粒體

李金旭 李博琦 趙鑫旭 姜雪婷 張玉紅 張雋晟 蔡 赫 田新民，2 金志民，2 劉 鑄*

(1.牡丹江師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，牡丹江，157011；2.東北林業(yè)大學(xué)野生動(dòng)物與自然保護(hù)地學(xué)院，哈爾濱，150040)

鼩鼱屬(Sorex)隸屬于鼩形目(Soricomorpha)，鼩鼱科(Soricidae)，鼩鼱亞科(Soricinae)。鼩鼱屬是鼩鼱亞科中既能分布于古北區(qū)又能分布于新北區(qū)的唯一屬，該屬是鼩鼱亞科中具有最多物種數(shù)量的屬，包括至少77個(gè)物種[1]。Hoffmann[2]認(rèn)為我國(guó)具有14個(gè)物種分布。近些年，鼩鼱屬物種在國(guó)內(nèi)分布的首證不斷被報(bào)道[3-4]。蔣志剛等[5]認(rèn)為有20個(gè)物種分布。我國(guó)東北地區(qū)鼩鼱屬物種豐富，據(jù)調(diào)查[6]，東北地區(qū)具有9個(gè)鼩鼱屬物種，即大鼩鼱(S.mirabilis)、中鼩鼱(S.caecutiens)、遠(yuǎn)東鼩鼱(S.isodon)、苔原鼩鼱(S.tundrensis)、長(zhǎng)爪鼩鼱(S.unguiculatus)、栗齒鼩鼱(S.daphaenodon)、細(xì)鼩鼱(S.gracillimus)、扁顱鼩鼱(S.roboratus)和姬鼩鼱(S.minutissimus)。

鼩鼱屬動(dòng)物分布廣泛且與人類接觸密切，但其較難捕獲導(dǎo)致其系統(tǒng)分化關(guān)系并不明確。已有報(bào)道顯示核型的變化反映了鼩鼱屬物種之間的系統(tǒng)分化關(guān)系[7]，但其核型變化與其外觀分類竟不能一一對(duì)應(yīng)，甚至通過(guò)外觀分類與核型分類結(jié)果不甚相同[8]，是一種罕見的情況[1]。所以無(wú)法單純地通過(guò)外觀進(jìn)行分類學(xué)鑒定，并且鼩鼱屬的亞屬分化問(wèn)題也一直存在爭(zhēng)議[9]，鑒于這些系統(tǒng)發(fā)生分歧，分子系統(tǒng)發(fā)生學(xué)開始利用線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)序列作為分子標(biāo)記對(duì)鼩鼱屬進(jìn)行分析。而相對(duì)來(lái)說(shuō)，近年來(lái)鼩鼱屬的動(dòng)物并沒(méi)有太大的進(jìn)化改變[10]。鼩鼱屬的系統(tǒng)發(fā)生分化和分類學(xué)利用的分子標(biāo)記主要是mtDNA的Cytb基因片段。期初利用較短的片段(402 bp)對(duì)東亞地區(qū)鼩鼱屬物種的分子系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系進(jìn)行了分析[11]。之后利用較長(zhǎng)的Cytb基因片段(1 011 bp)探討了分布于東北亞地區(qū)的5種鼩鼱(中鼩鼱、遠(yuǎn)東鼩鼱、苔原鼩鼱、長(zhǎng)爪鼩鼱、姬鼩鼱)的分子系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系[12]。近些年，主要是利用mtDNA的Cytb基因全序列(1 140 bp)對(duì)鼩鼱屬的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系進(jìn)行分析[13-14]。但以上的研究均使用單一的Cytb基因序列分子標(biāo)記，本研究期望使用線粒體COⅠ和16S rRNA做以嘗試，分析我國(guó)東北地區(qū)鼩鼱屬物種的系統(tǒng)發(fā)生地位。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本采集

主要利用陷阱法，在大興安嶺山脈呼中地區(qū)和呼倫湖地區(qū)，小興安嶺山脈蘿北地區(qū)，長(zhǎng)白山山脈橫道河子地區(qū)、牡丹峰地區(qū)和鳳凰山地區(qū)采集標(biāo)本。根據(jù)形態(tài)學(xué)測(cè)量數(shù)據(jù)，利用檢索表進(jìn)行物種分類確定[2，6，14]，發(fā)現(xiàn)共捕捉到9個(gè)物種，分別選取通過(guò)外部形態(tài)初步鑒定為成體的9種鼩鼱標(biāo)本各1只(表1)。

表1 鼩鼱屬分子系統(tǒng)學(xué)研究的樣本(采集樣本)Tab.1 A sample table of molecular systematics of Sorex(collected samples)

1.2 試驗(yàn)方法

利用酚-氯仿法對(duì)鼩鼱標(biāo)本的肌肉組織進(jìn)行基因組DNA提取。mtDNA的COⅠ和16S rRNA基因全序列PCR反應(yīng)體系為50 μL，含200 μmol/L的dNTP，1.5 mmol/L的MgCl2，COⅠ基因上游引物L(fēng)為5′-CCTACTCRGCCATTTTACCTATG-3′，下游引物R為5′-ATCTCTGGGTGTCCAAAGAATCA-3′；16S rRNA上游F為5′-AAGACGAGAA GACCCTTGGACTTTA-3′，下游引物R為5′-GATTGCGCTGTTATCCCTAGGGTA-3′。各10 pmol，TaqDNA polymerase 2.5 U(大連寶生物)，模板為250 ng。擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)變性3 min；94℃變性45 s，50℃退火50 s，72℃延伸45 s，30個(gè)循環(huán)；72℃再延伸7 min，4℃終止反應(yīng)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化回收，進(jìn)行測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

首先對(duì)9種鼩鼱分別進(jìn)行COⅠ單基因序列和16S rRNA單基因序列測(cè)序(表1)，然后從GenBank上下載8種鼩鼱屬動(dòng)物的COⅠ序列和13種鼩鼱屬動(dòng)物的16S rRNA序列(表2)共同進(jìn)行分析。序列使用了ClustalX軟件進(jìn)行分析對(duì)比，并使用MEGA7.0軟件進(jìn)行裁剪以及計(jì)算Kimura-2參數(shù)校正的遺傳距離，使用鄰接法(Neighbor-joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，使用黑線倉(cāng)鼠(Cricetulusbarabensis)為外群，創(chuàng)建分子系統(tǒng)發(fā)生樹，分別表示為CricetulusbarabensisCOⅠ和Cricetulusbarabensis16S。

表2 鼩鼱屬分子系統(tǒng)學(xué)研究的GenBank下載樣本Tab.2 The samples of molecular systematics of Sorex downloaded from the GenBank

2 結(jié)果與分析

2.1 COⅠ基因分析

2.1.1 遺傳距離

根據(jù)分析結(jié)果并使用MEGA 7.0軟件創(chuàng)建遺傳距離表(表3)，建立分組，將每種樣本的鼩鼱合并為一組進(jìn)行種間的遺傳距離分析，結(jié)果表明，種間差距為0.050—0.199，差別最大的是紋背鼩鼱(S.cylindri-cauda)和沼澤鼩鼱(S.palustris)，差別最小的是苔原鼩鼱和栗齒鼩鼱，遺傳距離為0.050。

表3 基于COⅠ基因計(jì)算鼩鼱屬物種的遺傳距離Tab.3 Genetic distance of Sorex based on COⅠ genes

2.1.2 系統(tǒng)發(fā)育重建

從系統(tǒng)發(fā)生樹(圖1)可見，相同物種的不同樣本序列都聚集在系統(tǒng)發(fā)生樹的1個(gè)小分支上，說(shuō)明種內(nèi)分化很小。除外群外的系統(tǒng)發(fā)生樹分化成1個(gè)小分支和1個(gè)大分支，小分支是由沼澤鼩鼱構(gòu)成的，說(shuō)明沼澤鼩鼱與其他鼩鼱系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系較遠(yuǎn)。在大分支上首先分化出來(lái)的是紋背鼩鼱分支，可見紋背鼩鼱與其他鼩鼱具有較大分化。除紋背鼩鼱分支外的大分支分化為2個(gè)分支，第1個(gè)分支是由栗齒鼩鼱、苔原鼩鼱、普通鼩鼱(S.araneus)、北極鼩鼱(S.arcticus)、大鼩鼱(S.mirabilis)和扁顱鼩鼱構(gòu)成；第2個(gè)分支是由長(zhǎng)爪鼩鼱、遠(yuǎn)東鼩鼱、中鼩鼱、姬鼩鼱、細(xì)鼩鼱和小鼩鼱(S.minutus)構(gòu)成。在第1個(gè)分支中，又可以分為2個(gè)部分，第1部分是由栗齒鼩鼱、苔原鼩鼱、普通鼩鼱和北極鼩鼱構(gòu)成，其中北極鼩鼱又區(qū)別另外3種鼩鼱在另一分支中，說(shuō)明相比之下栗齒鼩鼱與苔原鼩鼱和普通鼩鼱之間的親緣關(guān)系更近，北極鼩鼱僅次于這三者；而另一部分由大鼩鼱和扁顱鼩鼱構(gòu)成，說(shuō)明這2種鼩鼱的親緣關(guān)系較近。第2個(gè)分支中也同樣分為2個(gè)部分，第1部分是由長(zhǎng)爪鼩鼱、遠(yuǎn)東鼩鼱和中鼩鼱構(gòu)成，說(shuō)明這3種鼩鼱的親緣關(guān)系更近；而另一部分則是由姬鼩鼱、細(xì)鼩鼱以及小鼩鼱構(gòu)成的，說(shuō)明這3種鼩鼱的親緣關(guān)系更近。

2.2 16S rRNA基因全序列的組成與變異

2.2.1 遺傳距離

根據(jù)分析結(jié)果并使用MEGA 7.0軟件創(chuàng)建了遺傳距離表(表4)，并建立分組，將每種樣本的鼩鼱合并為一組并進(jìn)行種間遺傳距離分析，結(jié)果表明，種間遺傳距離為0.012—0.128，其中扁顱鼩鼱與煙熏鼩鼱(S.fumeus)之間的遺傳距離最大，為0.128；普通鼩鼱和西班牙鼩鼱(S.granarius)的遺傳距離最小，為0.012。

表4 基于16S rRNA基因計(jì)算的鼩鼱屬物種遺傳距離Tab.4 Genetic distance of Sorex based on 16S rRNA genes

2.2.2 系統(tǒng)發(fā)育重建

由NJ法創(chuàng)建的系統(tǒng)發(fā)生樹(圖2)的分析可知，無(wú)論是GenBank下載樣本還是采集的試驗(yàn)樣本，相同物種的不同樣本序列都聚集在系統(tǒng)發(fā)生樹的1個(gè)小分支上，說(shuō)明種內(nèi)分化很小。除外群外的系統(tǒng)發(fā)生樹分化成1個(gè)小分支和1個(gè)大分支：小分支是由假面鼩鼱(S.cinereus)、煙熏鼩鼱以及索緒爾鼩鼱(S.saussurei)構(gòu)成的，說(shuō)明這3種鼩鼱與其他鼩鼱系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系較遠(yuǎn)；在大分支上首先分化出來(lái)的是高山鼩鼱(S.alpinus)分支，可見其與其他鼩鼱具有較大分化。除高山鼩鼱分支外的大分支分化為2個(gè)分支：第1個(gè)分支是由遠(yuǎn)東鼩鼱、長(zhǎng)爪鼩鼱、中鼩鼱、姬鼩鼱、細(xì)鼩鼱、杜氏鼩鼱(S.raddei)、小紋背鼩鼱(S.bedfordiae)和云南鼩鼱(S.excelsus)構(gòu)成；第2個(gè)分支是由小鼩鼱、沃氏鼩鼱(S.volnuchini)、大鼩鼱、扁顱鼩鼱、苔原鼩鼱、栗齒鼩鼱、普通鼩鼱以及西班牙鼩鼱構(gòu)成。在第1個(gè)分支中又分成了2大部分：第1部分是由遠(yuǎn)東鼩鼱、長(zhǎng)爪鼩鼱、中鼩鼱和姬鼩鼱構(gòu)成的，說(shuō)明這幾種鼩鼱在親緣關(guān)系上更近一些；第二部分是由細(xì)鼩鼱、杜氏鼩鼱、小紋背鼩鼱和云南鼩鼱構(gòu)成的，說(shuō)明這幾種鼩鼱在親緣關(guān)系上更近一些。在第2個(gè)分支中又分成了2大部分：第1部分是由小鼩鼱、沃氏鼩鼱和大鼩鼱構(gòu)成，說(shuō)明這3種鼩鼱的親緣關(guān)系更近；第2部分是由扁顱鼩鼱、苔原鼩鼱、栗齒鼩鼱、普通鼩鼱以及西班牙鼩鼱構(gòu)成的，說(shuō)明這幾種鼩鼱的親緣關(guān)系更近。

3 討論

3.1 鼩鼱屬的分布與分化

鼩鼱屬的亞屬分類一直都是比較有爭(zhēng)議的，基于形態(tài)學(xué)研究認(rèn)為應(yīng)將鼩鼱屬分為3個(gè)亞屬：Sorex、Microsorex和Otisorex[15]；基于核型分析認(rèn)為鼩鼱屬應(yīng)分為3個(gè)亞屬，一個(gè)是XY1Y2性染色體復(fù)雜群體(Sorexaraneus-arcticusgroup)，另一個(gè)為新北區(qū)群(Otisorex)，第三個(gè)是除去性染色體復(fù)雜外的古北區(qū)群體(Homalurus)[16]；基于同工酶分析和免疫學(xué)分析認(rèn)為鼩鼱屬應(yīng)分為3個(gè)亞屬，一個(gè)是分布于古北區(qū)的亞屬(Sorex)，另一個(gè)為分布于新北區(qū)的亞屬，第三個(gè)是包括特氏鼩鼱(S.trowbridgii)在內(nèi)的未命名亞屬[17]。本研究根據(jù)系統(tǒng)發(fā)生樹以及遺傳距離發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是基于COⅠ的結(jié)果還是基于16S rRNA的方法，都將所有樣本分成了2個(gè)大分類，即古北區(qū)物種和新北區(qū)物種，進(jìn)一步支持分布于古北區(qū)的亞屬和分布于新北區(qū)的亞屬的分化。通常我國(guó)學(xué)者研究的鼩鼱屬種類以古北區(qū)亞屬為主，但古北區(qū)由于氣候原因?qū)ζ渖鷳B(tài)位有一定的影響，這也是導(dǎo)致古北區(qū)鼩鼱屬物種進(jìn)化，以及與其他區(qū)間的鼩鼱屬物種產(chǎn)生差異的根本原因[18-20]。對(duì)于氣候變化，鼩鼱屬物種做出了一定的適應(yīng)，使得其在古北區(qū)更容易生存[21-22]。通過(guò)對(duì)基于COⅠ創(chuàng)建的系統(tǒng)發(fā)生樹進(jìn)行分析，可以發(fā)現(xiàn)分布于新北區(qū)的沼澤鼩鼱與分布于古北區(qū)的物種有著很大差異，遺傳距離也相對(duì)很大，這與張雋晟等[23]的研究結(jié)果相同。此外，基于16S rRNA基因創(chuàng)建的系統(tǒng)發(fā)生樹分析，也可以將分布于新北區(qū)的假面鼩鼱、煙熏鼩鼱以及索緒爾鼩鼱區(qū)分出來(lái)，這其實(shí)足以證明古北區(qū)與新北區(qū)的物種是有著很大差異的。

本研究中有3個(gè)較為特殊的物種，即北極鼩鼱、姬鼩鼱和苔原鼩鼱。北極鼩鼱來(lái)源于新北區(qū)的加拿大，但是基于16S rRNA基因的系統(tǒng)發(fā)生樹和遺傳距離結(jié)果都表現(xiàn)出與古北區(qū)類群有著更加近的親緣關(guān)系，這與張雋晟等[23]利用mtDNA的Cytb基因的研究結(jié)果相同。姬鼩鼱和苔原鼩鼱為全北區(qū)物種，已有報(bào)道證實(shí)新北區(qū)種群與古北區(qū)種群存在著緊密的親緣關(guān)系[24]。由于更新世冰川的作用，全球海平面開始下降，個(gè)別海平面甚至下降了75 m[25]。由此產(chǎn)生的海平面變化和臨時(shí)陸橋的建立導(dǎo)致了新北區(qū)和古北區(qū)之間可以通過(guò)白令海峽而進(jìn)行洲際交流[26]。推測(cè)在這個(gè)時(shí)期姬鼩鼱和苔原鼩鼱從古北區(qū)擴(kuò)散到了新北區(qū)。但是北極鼩鼱到目前為止還沒(méi)有找到在古北區(qū)的分布，推測(cè)位于古北區(qū)的東北亞地區(qū)應(yīng)該有與其親緣關(guān)系很近的物種存在。

3.2 東北地區(qū)鼩鼱屬物種的系統(tǒng)發(fā)生地位

我國(guó)東北分布的9個(gè)物種完全聚在古北區(qū)的亞屬內(nèi)部，與地理分布是完全相符的。本研究采集的樣本與張雋晟等[23]采集的部分樣本相同，由此筆者進(jìn)行了橫向?qū)Ρ确治觥?種分子標(biāo)記在一些物種的系統(tǒng)分化地位上，表現(xiàn)出了一致的結(jié)果：長(zhǎng)爪鼩鼱與遠(yuǎn)東鼩鼱親緣關(guān)系很近，這與以往的研究結(jié)果是一致的，曾經(jīng)認(rèn)為長(zhǎng)爪鼩鼱是遠(yuǎn)東鼩鼱的亞種[14]，并且兩者的核型分析結(jié)果很相似(2n=42；NF=68)[27]；苔原鼩鼱和栗齒鼩鼱親緣關(guān)系很近，都聚在XY1Y2性染色體復(fù)雜群體，已有研究[28-29]表明這2個(gè)物種的確是性染色體復(fù)雜物種；扁顱鼩鼱在系統(tǒng)發(fā)生地位上較為特化，都表現(xiàn)出了與性染色體復(fù)雜群體分支具有一定的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系，但其不屬于性染色體復(fù)雜物種。3種分子標(biāo)記在一些物種的系統(tǒng)分化地位上，表現(xiàn)出了略有分歧的結(jié)果：在細(xì)鼩鼱、姬鼩鼱和中鼩鼱的系統(tǒng)分化關(guān)系上存在不一致的情況，目前形態(tài)學(xué)研究結(jié)果顯示，細(xì)鼩鼱和中鼩鼱都具有顱骨近圓形以及單尖齒整體形態(tài)表現(xiàn)為排列緊密，高度較低，每個(gè)單尖齒寬度大于高度的共同特征，形態(tài)學(xué)研究結(jié)果支持Cytb基因的試驗(yàn)結(jié)果[6，30]；基于Cytb基因和16S rRNA基因的研究結(jié)果是一致的，表現(xiàn)為大鼩鼱是十分特化的一個(gè)物種，而基于COⅠ基因的試驗(yàn)結(jié)果將其聚類于性染色體復(fù)雜群體分支?；诒狙芯拷Y(jié)果，鼩鼱屬一些物種的系統(tǒng)分化地位還存在一定歧異，建議今后利用mtDNA基因組結(jié)合多個(gè)核基因位點(diǎn)進(jìn)行進(jìn)一步分析。