中國產(chǎn)托京褐扁顱蝠分類地位的探討

梁曉玲 李彥男 謝慧嫻 張惠光 詹麗英 吳 毅 周 全* 余文華*

(1.廣州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣州，510006；2.武夷山國家公園科研監(jiān)測中心，南平，353000)

翼手目(Chiroptera)俗稱蝙蝠，是唯一具飛行能力的夜行性哺乳動(dòng)物，該類群在我國有8科140多種[1]，其中福建省已記錄的翼手目種類數(shù)量為6科46種[2]。武夷山位于福建北部，屬典型的中亞熱帶濕潤季風(fēng)性氣候[3]，為生物學(xué)多樣性熱點(diǎn)區(qū)域，已記錄具有較高的翼手目物種多樣性[4]。其中扁顱蝠屬(Tylonycteris，也稱“竹蝠”)為翼手類中極為特化的類群，在具狹縫的竹節(jié)洞內(nèi)棲息，特化出腦顱扁平、體型小且第1指基部具肉墊的特征[5]。雖然武夷山具有豐富的竹類資源[3]，但該地區(qū)至今未見扁顱蝠分布的相關(guān)報(bào)道。

2004年前傳統(tǒng)蝙蝠分類學(xué)者認(rèn)為扁顱蝠屬全世界僅2種，即：扁顱蝠(T.pachypus)，體型較小，體重常為3—4 g，毛色偏向棕黃色、茶褐色；褐扁顱蝠(T.robustula)，體型較大，體重通常大于4 g，毛色偏向暗褐色[5-6]。兩者的分布區(qū)均從中國南部一直延伸至東南亞各島嶼[7-8]。隨著野外調(diào)查強(qiáng)度的加大、標(biāo)本的積累及分子系統(tǒng)學(xué)研究的開展，該屬分類體系不斷完善。Feng等[9]根據(jù)云南西雙版納標(biāo)本，描述了1種體型更小的“竹蝠”形態(tài)特征：體重約3 g，前臂長23.90—25.61 mm，顱全長7.64—8.50 mm，命名為小扁顱蝠(T.pygmaea)。其后，Huang等[10]通過核型分析、形態(tài)學(xué)、系統(tǒng)發(fā)育和種群遺傳結(jié)構(gòu)分析等方法，將中國區(qū)域的扁顱蝠華南亞種(T.pachypusfulvida)提升為種，即華南扁顱蝠(T.fulvida)。最近Tu等[11]基于形態(tài)學(xué)、系統(tǒng)發(fā)育學(xué)、生物地理學(xué)等證據(jù)，進(jìn)一步揭示扁顱蝠屬中存在多個(gè)隱種，分布于蘇門答臘島的褐扁顱蝠保留原種名不變，將分布在馬來西亞半島、中南半島南部和印度北部的原褐扁顱蝠馬來亞亞種提升為種——馬來褐扁顱蝠(T.malayana)，將分布于中南半島北部的“褐扁顱蝠”新命名為托京褐扁顱蝠(T.tonkinensis)，并提出在中國分布的“褐扁顱蝠”有待進(jìn)一步核實(shí)。綜上所述，目前扁顱蝠屬實(shí)含6個(gè)有效種，分別為小扁顱蝠、扁顱蝠、華南扁顱蝠、褐扁顱蝠、馬來褐扁顱蝠、托京褐扁顱蝠[12]。

物種分類訂正對區(qū)域內(nèi)本底狀況的明確、生態(tài)保護(hù)統(tǒng)籌規(guī)劃及后續(xù)生物學(xué)研究準(zhǔn)確開展尤為重要。為進(jìn)一步厘定“褐扁顱蝠”物種，明確其國內(nèi)分布種類及種群歷史動(dòng)態(tài)，對館藏于廣州大學(xué)華南生物多樣性保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的“褐扁顱蝠”標(biāo)本進(jìn)行形態(tài)學(xué)、分子系統(tǒng)發(fā)育學(xué)及種群遺傳學(xué)初步分析。同時(shí)，對2020年6月在福建武夷山采集的2只“竹蝠”進(jìn)行了外部形態(tài)、頭骨特征及分子系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析，將其鑒定為托京褐扁顱蝠，為福建省翼手目分布的新紀(jì)錄。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本采集

于2020年6月8—19日在福建省武夷山妙蓮古寺半山步道(27°41′16″N，117°56′4″E，海拔266 m)和止止庵東入口林道竹林附近(27°38′39″N，117°57′40″E，海拔210 m)，使用蝙蝠豎琴網(wǎng)采集到2只小型蝙蝠(標(biāo)本號：GZHU 20048，♂；GZHU 20050，♀)，上述標(biāo)本現(xiàn)保存在廣州大學(xué)華南生物多樣性保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。同時(shí)，分析使用了歷年采集的“褐扁顱蝠”材料(合計(jì)形態(tài)標(biāo)本75號、分子樣品21號)，采集地覆蓋福建、江西、海南、廣東、廣西、貴州、云南、四川等省份。

1.2 外形及頭骨測量

使用數(shù)顯式電子天平(MH-Series Pocket Scale，昆明諾金科技有限公司，精度0.1 g)稱量標(biāo)本的體重(body mass，MASS)。參照哺乳動(dòng)物測量標(biāo)準(zhǔn)[13]，用數(shù)顯游標(biāo)卡尺(MNT-150，上海美耐特實(shí)業(yè)有限公司，精度0.01 mm)對其外形及頭骨指標(biāo)進(jìn)行測量，外形指標(biāo)包括，前臂長(forearm length，F(xiàn)A)、頭體長(head and body length，HB)、尾長(tail length，T)、耳長(ear length，E)、脛骨長(tibia length，Tib)及后足長(hindfoot length，HF)；頭骨測量指標(biāo)包括，顱全長(greatest length of skull，GTL)、枕犬長(condylo-canine length，CCL)、顴寬(zygomatic width，ZW)、腦顱寬(breadth of braincase，BB)、眶間寬(interorbital of width，IOW)、腭橋長(palatal bridge length，PL)、上齒列長(maxillary tooth row length，C1-M3)、上犬齒間寬(upper canine width，C1-C1)、上第3臼齒間寬(upper third molar width，M3-M3)、下齒列長(mandibular tooth row length，C1-M3)、下頜長(mandibular length，ML)。

1.3 COⅠ和Cyt b基因目的片段的擴(kuò)增

取標(biāo)本的肌肉或肝臟組織，使用DNA試劑盒(AG通用型基因組AG21009，艾科瑞生物)提取其總DNA。然后應(yīng)用引物[14]COⅠ-F：5′-TTC TCA ACC AAC CAC AAA GAC ATT GG-3′和COⅠ-R：5′-TAG ACT TCT GGG TGG CCA AAG AAT CA-3′；Cytb-F：5′-CCC TTY TCT GGT TTA CAA GAC C-3′和Cytb-R：5′-AAY CAC CGT TGT AYT TCA ACT A-3′，擴(kuò)增COⅠ和Cytb基因的部分序列。COⅠ的PCR反應(yīng)總體系50 μL，其中PremixTaqTM25 μL，引物1 μL，模板DNA 3 μL，ddH2O 20 μL；程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3 min；94℃變性45 s，53℃退火45 s，72℃延伸90 s，37個(gè)循環(huán)；最終72℃延伸5 min。Cytb的PCR反應(yīng)總體系30 μL，PremixTaqTM15 μL，引物1 μL，模板DNA 4 μL，ddH2O 9 μL；程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性45 s，46℃退火45 s，72℃延伸60 s，37個(gè)循環(huán)；最終72℃延伸10 min。

1.4 系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析

測序結(jié)果使用Geneious v5.6[15]進(jìn)行人工拼接與校對。將拼接好的序列與從NCBI-nt數(shù)據(jù)庫中下載的已有扁顱蝠屬物種的部分序列進(jìn)行排序比對(序列號見附錄1和附錄2)。ModelFinder[16]明確最佳核苷酸替換模型為HKY+F+G4(COⅠ)和TPM2+F+G4(Cytb)，IQ-TREE[17]構(gòu)建極似然樹，自展(bootstrap)1 000次估計(jì)節(jié)點(diǎn)支持度。MrModeltest v2[18]明確最佳核苷酸替換模型，COⅠ和Cytb均為GTR+G，MrBayes 3.2[19]構(gòu)建貝葉斯樹，總抽樣代數(shù)為10 000 000，抽樣頻率為1 000，丟棄前25%數(shù)據(jù)。2種方法均將圓耳管鼻蝠(Murinacyclotis)設(shè)置為外群。

附錄1 用于扁顱蝠屬系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建的COⅠ序列號Appendix 1 COⅠ sequence numbers included in phylogenetic reconstructions

附錄2 用于扁顱蝠系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建的Cyt b序列號Appendix 2 Cyt b sequence numbers included in phylogenetic reconstructions

1.5 種群遺傳結(jié)構(gòu)及歷史動(dòng)態(tài)分析

用于種群遺傳結(jié)構(gòu)及歷史動(dòng)態(tài)分析的托京褐扁顱蝠COⅠ和Cytb序列分別為30、21個(gè)。國內(nèi)種群包括四川、云南、貴州、廣西、廣東、海南、江西、福建，國外種群包括越南、老撾。DnaSP 6[20]計(jì)算托京褐扁顱蝠種群序列遺傳多樣性指數(shù)。PopArt 1.7[21]構(gòu)建TCS單倍型網(wǎng)絡(luò)圖。Arlequin v3.5[22]進(jìn)行分子變異分析(AMOVA)，估算遺傳分化指數(shù)(F-statistics，F(xiàn)st)，排列測驗(yàn)法(Permutation test)檢驗(yàn)Fst的顯著性，重復(fù)次數(shù)為1 000。

由于現(xiàn)有的托京褐扁顱蝠序列并未體現(xiàn)明顯種群遺傳結(jié)構(gòu)，故將各種群予以合并。通常，F(xiàn)u’sFs檢測呈現(xiàn)顯著負(fù)值并且錯(cuò)配分布圖呈泊松分布的單峰型，說明種群趨于發(fā)生種群擴(kuò)張[23]。DnaSP 6[20]中進(jìn)行Tajima’sD檢驗(yàn)和Fu’sFs檢驗(yàn)，判斷該群體的進(jìn)化是否符合中性進(jìn)化假說[24]，錯(cuò)配分布檢驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證是否經(jīng)歷歷史擴(kuò)張。BEAST 2[25]繪制貝葉斯天際線，COⅠ基因核苷酸替換率[11]設(shè)置為(0.015±0.005)subst/site/Myr(每百萬年突變1%—2%)和(0.020±0.005)subst/site/Myr(每百萬年突變1.5%—2.5%)，Cytb基因核苷酸突變率設(shè)置為(0.020±0.005)subst/site/Myr(每百萬年突變1.5%—2.5%)和(0.025±0.005)subst/site/Myr(每百萬年突變2%—3%)，上述分析均使用HKY核苷酸替換模型和嚴(yán)格分子鐘模式(Strict Clock，rate：1.0)，運(yùn)行1 000萬代MCMC，每1 000代進(jìn)行一次抽樣。Tracer 2[26]匯總抽樣數(shù)據(jù)和繪制天際線圖。

2 結(jié)果

2.1 外形特征

研究標(biāo)本為小型蝙蝠種類，前臂長為24.76—29.59 mm，與描述的托京褐扁顱蝠新種25.10—27.80 mm及馬來褐扁顱蝠25.50—27.50 mm相重疊，三者外形難以區(qū)分(表1)，其中福建2個(gè)標(biāo)本(GZHU 20048，♂；GZHU 20050，♀)前臂長分別為28.41、27.16 mm。這些標(biāo)本鼻吻部較短；耳短小，呈三角形，尖端寬且圓，耳屏短鈍；頭部和背部毛發(fā)呈棕褐色，面部和耳呈黑褐色，頸部和腹部毛色較淺，呈淡褐色；第1指基部和足部均具有明顯的肉質(zhì)墊，拇指的肉墊近橢圓形且較小，后肢的肉墊呈掌形，第3掌骨和第4掌骨長度較為接近，第5掌骨較短(福建標(biāo)本，圖1)。這些特征均與Tu等[11]描述的托京褐扁顱蝠相吻合。

2.2 頭骨特征

標(biāo)本顱全長10.64—12.55 mm，其頭骨度量學(xué)指標(biāo)與托京褐扁顱蝠及馬來褐扁顱蝠均相近。以福建標(biāo)本為例(圖1)，其頭骨特征如下：頭骨小，顱全長為10.64—11.99 mm，極扁平且寬；眼眶前緣具尖端突起；矢狀嵴不發(fā)達(dá)，人字嵴較為明顯。顴弓發(fā)達(dá)，顴寬7.42—10.51 mm。齒式為2.1.1.3/3.1.2.3=32。第1上門齒(I1)明顯低于第2上門齒(I2)，后者為雙尖形；第1上臼齒(M1)和第2上臼齒(M2)均具有發(fā)達(dá)的中附尖，咬合面呈“W”型，第3上臼齒(M3)有退化跡象。下犬齒(C1)高度是第1下前臼齒(Pm2)的2倍，第1下臼齒(M1)前尖低于后尖，第2下臼齒(M2)、第3下臼齒(M3)前尖均高于后尖。

2.3 種群遺傳結(jié)構(gòu)

托京褐扁顱蝠的COⅠ序列檢測到24個(gè)變異位點(diǎn)，其中單一信息位點(diǎn)有18個(gè)，簡約信息位點(diǎn)為6個(gè)，定義出16種單倍型，單倍型多樣性為0.862，核苷酸多樣性為0.004，其中Tt_H9、Tt_H13、Tt_H16為優(yōu)勢單倍型，分布最為廣泛，為2個(gè)群體所共享，占個(gè)體數(shù)53.33%(16/30)(圖2C、D)。Cytb分子標(biāo)記檢測到41個(gè)變異位點(diǎn)，單一信息位點(diǎn)有28個(gè)，簡約信息位點(diǎn)為13個(gè)，可定義18個(gè)單倍型，單倍型多樣性為0.986，核苷酸多樣性為0.006，缺少共享單倍型。

依據(jù)619 bp的COⅠ序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，這些標(biāo)本與從NCBI-nt數(shù)據(jù)庫中下載的已有扁顱蝠屬物種中的托京褐扁顱蝠[11]聚為高支持度的一支(貝葉斯法的后驗(yàn)概率為1.0，最大似然法支持度為98)，支持將該批標(biāo)本鑒定為托京褐扁顱蝠而非馬來褐扁顱蝠或褐扁顱蝠(圖2A)。而基于1 105 bp的Cytb序列系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果同樣支持該批標(biāo)本為托京褐扁顱蝠(圖2B，貝葉斯法的后驗(yàn)概率為1.0，最大似然法支持度為100)。在支系內(nèi)關(guān)系中，2種分子標(biāo)記的結(jié)果均提示國內(nèi)外的托京褐扁顱蝠似乎源于一個(gè)大的混雜種群，無明顯種群遺傳結(jié)構(gòu)。該結(jié)果也與單倍型網(wǎng)絡(luò)圖結(jié)果相吻合(圖2C、D)，COⅠ基因的TCS網(wǎng)絡(luò)圖整體呈星狀，單倍型Tt_H9為中心單倍型；基于Cytb基因TCS網(wǎng)絡(luò)圖整體呈現(xiàn)雙星狀，缺少共享單倍型。2種分子標(biāo)記的AMOVA分析顯示：遺傳變異主要來源于種群內(nèi)，分別占遺傳變異的99.46%(COⅠ)和99.36%(Cytb)，高于種群間變異(表4)。種群間的遺傳分化指數(shù)(Fst)均為0.01(P>0.01)，表明群體間未存在顯著性遺傳差異(表4)。這些結(jié)果均提示現(xiàn)有的分子標(biāo)記顯示國內(nèi)外的托京褐扁顱蝠似乎源于一大的混合有效種群，無明顯種群遺傳結(jié)構(gòu)。

表3 托京褐扁顱蝠的遺傳多樣性參數(shù)Tab.3 Genetic diversity parameters of Tylonycteris tonkinensis

表4 基于COⅠ和Cyt b基因的分子方差分析Tab.4 Analysis of molecular variance(AMOVA)based on COⅠ and Cyt b gene segments

2.4 群體歷史動(dòng)態(tài)

由表3可見，基于COⅠ的托京褐扁顱蝠種群整體Fu’sFs為顯著負(fù)值(P<0.05)，基于COⅠ和Cytb種群整體Tajima’sD為顯著負(fù)值(P<0.01；P<0.05)，且核苷酸錯(cuò)配分布圖呈現(xiàn)或近似單峰型，表明有種群擴(kuò)張的歷史，與貝葉斯天際線的結(jié)果基本吻合。不同的核苷酸替換速率設(shè)置下其擴(kuò)張的時(shí)間并不一致(圖3)，基于COⅠ的貝葉斯天際線顯示，2—4百萬年前種群有微小的擴(kuò)張趨勢，而基于Cytb的貝葉斯天際線顯示2—3百萬年前該種群有擴(kuò)張歷史。

3 討論

Tu等[11]基于系統(tǒng)發(fā)育學(xué)、系統(tǒng)地理學(xué)，結(jié)合生物地理史和古氣候竹林變遷狀況進(jìn)行分析提出，由于褐扁顱蝠祖先對竹林生存的依賴性，故更新世時(shí)期冰川往復(fù)消融導(dǎo)致竹林區(qū)域變遷，促進(jìn)了該類群進(jìn)一步種化進(jìn)程，最終形成現(xiàn)階段的3個(gè)獨(dú)立種，即褐扁顱蝠(蘇門答臘島)、馬來褐扁顱蝠(東南亞大陸南部和西部)、托京褐扁顱蝠(中南半島北部)，同時(shí)冰期的反復(fù)消融也可能是地理種群不斷融合擴(kuò)散的成因，故本研究中托京褐扁顱蝠未見明顯的種群遺傳結(jié)構(gòu)(圖2)。根據(jù)Tu等[11]研究，托京褐扁顱蝠分布在老撾東北部、越南北部，但中國是否分布尚存疑。本研究通過對本課題組館藏標(biāo)本展開重新分類厘定，結(jié)果提示其前臂長、顱全長等形態(tài)特征與托京褐扁顱蝠(模式標(biāo)本)、馬來褐扁顱蝠和褐扁顱蝠(蘇門答臘島)重疊，三者在外形上難以區(qū)分(表1)，提示分子鑒定是現(xiàn)階段對上述3種進(jìn)行分類的可行手段。同時(shí)本研究取樣盡量覆蓋了“褐扁顱蝠”在中國的歷史分布省份，分子系統(tǒng)學(xué)結(jié)果支持我國上述省份來源標(biāo)本均為托京褐扁顱蝠，而非馬來褐扁顱蝠或褐扁顱蝠，且前2種之間為姐妹群關(guān)系(圖2)。

在缺乏分子序列數(shù)據(jù)以前，國內(nèi)扁顱蝠屬物種鑒定根據(jù)形態(tài)及毛色進(jìn)行判別[6，27-29]，而“褐扁顱蝠”復(fù)合種中分類厘定的滯后、外部形態(tài)和頭骨特征的相似，及模式標(biāo)本或地模標(biāo)本數(shù)據(jù)缺乏，常常導(dǎo)致物種鑒定誤判。基因序列數(shù)據(jù)為物種鑒定另辟新徑，但三者的真實(shí)分布界限，是否存在雜交區(qū)，種化的歷程與機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。而親緣地理學(xué)結(jié)果提示，中國與越南、老撾的托京褐扁顱蝠單倍型混雜，種群間無顯著性遺傳差異，也進(jìn)一步確證了國內(nèi)“褐扁顱蝠”實(shí)為托京褐扁顱蝠。

綜上所述，我國扁顱蝠屬現(xiàn)包括小扁顱蝠、華南扁顱蝠和托京褐扁顱蝠3種。托京褐扁顱蝠(原褐扁顱蝠)在中國最早的記錄出現(xiàn)在云南和廣西[30]，隨后在海南、貴州、四川、江西、廣東等地被發(fā)現(xiàn)[6，27-29，31-32]。對于國內(nèi)扁顱蝠屬的物種鑒定，托京褐扁顱蝠與國內(nèi)的小扁顱蝠和華南扁顱蝠2個(gè)物種在形態(tài)上區(qū)別明顯，前者體重相對較大(4—5 g)，前臂較長(26—28 mm)，毛色偏暗為深褐色；華南扁顱蝠形態(tài)大小居中，毛色大體為金黃色；小扁顱蝠最小，毛色為暗棕色[1，9]。為方便后續(xù)分類鑒定工作，編制了扁顱蝠屬形態(tài)特征檢索表(附錄3)。

附錄3 國內(nèi)扁顱蝠屬物種檢索表Appendix 3 A key to species of the genus Tylonycteris in China

從中國、越南和老撾托京褐扁顱蝠種群的歷史動(dòng)態(tài)研究結(jié)果可知，該種群存在種群擴(kuò)張歷史，隨后有效種群數(shù)量保持穩(wěn)定狀態(tài)。這可能源于上新世(5.3—2.6百萬年前)氣候溫暖及更新世(2.60—0.01百萬年前)雖存在冰川期和間冰期往復(fù)[11]，但東南亞仍是竹林豐富的區(qū)域之一，可作為托京褐扁顱蝠的良好避難所，故有效種群保持較為穩(wěn)定擴(kuò)張狀態(tài)(圖3)。迄今，國內(nèi)托京褐扁顱蝠在華南地區(qū)分布廣泛，本次在福建武夷山發(fā)現(xiàn)托京褐扁顱蝠的分布，豐富了福建武夷山的哺乳動(dòng)物物種多樣性，也使該種在華南地區(qū)自四川到福建形成連續(xù)分布區(qū)。四川[6]、海南[27，33]分別為目前該種國內(nèi)的最北、最南分布界限，而湖南、重慶是否存在分布有待進(jìn)一步研究。

通過本底調(diào)查的持續(xù)加強(qiáng)及國家對相關(guān)研究工作的重視，近年我國的翼手目研究取得長足的發(fā)展，現(xiàn)記錄合計(jì)有8科140多種[1]，但其本底信息仍未明確，更妄論其種群動(dòng)態(tài)、年度及季節(jié)規(guī)律等。其中福建省一直是生物多樣性熱點(diǎn)區(qū)域，吸引眾多國內(nèi)外專家學(xué)者前往調(diào)查研究，翼手目物種達(dá)6科46種[2]，但通過調(diào)查工具的更新及資源調(diào)查的補(bǔ)充仍有新紀(jì)錄種被發(fā)現(xiàn)[34]。該發(fā)現(xiàn)提示本底調(diào)查是一項(xiàng)需長期持續(xù)的工作，需國家政府層面予以長期性支持，尤其對分類疑難眾多的小型脊椎動(dòng)物類群而言。

基于分子序列已是解決疑難種或復(fù)合群物種鑒定的重要手段，但必須警惕數(shù)據(jù)中物種鑒定存誤的序列信息，此外，中國分布序列信息較少也制約相關(guān)的研究工作的開展。本研究中NCBI序列號為MN366287的標(biāo)本原鑒定為褐扁顱蝠，然而基于Cytb序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，該標(biāo)本序列與托京褐扁顱蝠聚為高支持度的一支(1/100)，故實(shí)為托京褐扁顱蝠，序列KX467593的標(biāo)本原鑒定為扁顱蝠實(shí)為華南扁顱蝠。故在分子鑒定上必須對序列來源及物種鑒定信息予以勘別，且作者需附錄備注所使用的序列信息。

致謝：在野外調(diào)查及試驗(yàn)期間，得到廣州大學(xué)碩士研究生張翰博、李潮韋和本科生張欣、鐘韋凌的幫助，在此致以誠摯的謝意。