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    檢測ClO-的近紅外熒光探針的合成及細胞成像

    2021-11-13 11:00:42王光躍張淑平
    廣州化學 2021年5期
    關鍵詞:次氯酸孵育探針

    王光躍, 張淑平

    (上海理工大學,上海 200093)

    次氯酸鹽(ClO)是生物體內最重要的活性氧物種之一[1-2]。在生物體內,ClO-由髓過氧化物酶(MPO)催化的活化中性粒細胞中的過氧化氫和氯離子生成[3-4]。次氯酸鹽的生產過量會導致組織損傷和一系列人類疾病,如動脈粥樣硬化、關節(jié)炎甚至癌癥等[5-6]。因此,快速、靈敏的檢測ClO-在生物體中相當重要。

    到目前為止,已經報道了許多檢測ClO-的方法,例如生物發(fā)光法[7]、比色分析法[8]、電化學分析法[9]、輻射法[10]、熒光法[11-13]等等。其中,熒光法具有較好的靈敏度和選擇性。分子熒光探針因其特點,可用作生物系統(tǒng)中跟蹤生物分子的有力工具[14]。小分子熒光探針具有成本低、毒性小等優(yōu)點,已經逐漸成為生物及醫(yī)學領域的主要研究方法[15-20]。近年來,已有多個科研團隊開發(fā)了多個熒光探針,并實現了良好的生物應用[21-23]。而這些已開發(fā)出的熒光探針分子,大多具有較短的發(fā)射波長(<650 nm),成像時會被生物樣品自身熒光信號所干擾,導致較差的靈敏性,從而不能準確地進行細胞內物種檢測。

    本文基于亞甲藍熒光團化學結構的逆向分析,首次合成出了化合物MB-nBu,并考察了化合物MB-nBu與ClO-反應的光譜變化及穩(wěn)定性。另外,在進行了化合物MB-nBu的細胞毒性探究實驗后,對化合物MB-nBu的生物適用性進行了探究。

    1 實驗

    1.1 試劑和儀器

    實驗藥品試劑如表1所示,實驗儀器如表2所示。

    表1 實驗藥品試劑

    表2 實驗儀器

    1.2 探針MB-nBu的制備

    探針MB-nBu的合成步驟,根據文獻[23-24],做少量調整(如圖1所示):

    圖1 探針MB-nBu的合成

    1)將亞甲基藍MB(1 mmol,384 mg)、碳酸鈉(4 mmol,424 mg)6 mL水和9 mL二氯甲烷混合,并在40℃攪拌,氮氣保護下注射加入連二亞硫酸鈉(4 mmol,696 mg),攪拌反應30分鐘,得到化合物1;

    2)向溶液中加入碳酸鈉(424 mg,4 mmol),置于冰浴中、氮氣保護,逐滴加入三光氣(TPG,113 mg,0.6 mmol)的DCM溶液,常溫下反應2 h。薄層色譜監(jiān)測反應完全,溶液呈黃色。反應結束用DCM/H2O萃取,收集有機相,得到化合物2;

    3)將正丁氨(65 μL,1 mmol)溶于3 mL無水二氯甲烷中,加入三乙胺(260 μL),于冰浴、氮氣保護下攪拌,注射滴加化合物2的二氯甲烷溶液。溶液變?yōu)榈t色。常溫反應8 h,薄層色譜監(jiān)測反應完全,反應結束溶液變?yōu)闇\紅色。用乙酸乙酯/水萃取反應液,有機相加無水硫酸鈉干燥,產物通過柱色譜純化(氧化鋁,EA/PE=1/8),得到灰白色固體MB-nBu(123 mg,Yield:32%)。

    MB-nBu:1H-NMR(500 MHz, DMSO-d6)δ7.26(d,J=8.8 Hz, 2H),6.72(d,J=2.7 Hz, 2H),6.68(dd,J=8.9, 2.9 Hz, 2H),5.96(t,J=5.7 Hz, 1H), 3.02(t,J=4.5 Hz, 2H), 2.90(s, 12H), 1.40~1.35(m,2H), 1.26~1.21(m, 4H), 0.88~0.86(m, 3H)。13C-NMR(101 MHz, CDCl3)δ156.14, 149.00, 134.24, 128.70,127.33, 111.39, 111.06, 40.84, 40.70, 32.21, 29.79, 20.17. HRMS(ESI):C21H28N4OS[M+H]+理論值:385.20174,實測值:385.20561。

    1.3 光譜測試

    將探針稀釋至10 μM,在不同的pH中探針的熒光穩(wěn)定性及不同濃度次氯酸存在時探針的光譜變化。在熒光發(fā)射光譜實驗中,測試所用激發(fā)和發(fā)射波長為λex/em=620 /680 nm,狹縫為10 nm,電壓為700 V。

    1.4 細胞成像

    用完全培養(yǎng)基稀釋探針溶液,使其終濃度為10 μmol/L,于CO2細胞培養(yǎng)箱中(37℃,含5%CO2,95%空氣)孵育HeLa細胞30 min。后分別在培養(yǎng)基中加入用完全培養(yǎng)基稀釋的終濃度為0、5 μM NaClO、2 μg/mL PMA(可誘導ClO-產生),在37℃繼續(xù)孵育1 h。最后利用激光共聚焦觀察成像結果(激發(fā)波長:620 nm;收集范圍:650~750 nm)。

    2 結果和討論

    2.1 探針MB-nBu的可能機理

    由探針與NaClO響應后的吸收光譜(圖2a)及高效液相色譜分析HPLC分析(圖2b)結果,探針自身沒有吸收,而后出現三個吸收峰291 nm、609 nm、668 nm,與已報道文獻[25]中亞甲基藍的最大吸收波長一致,證實了反應完全后亞甲基藍(MB)的生成。由此推斷探針MB-nBu對ClO-的反應,可能機理如圖3所示。

    圖2 (a)探針MB-nBu及與ClO-響應后的吸收光譜(280~800 nm);

    圖3 探針MB-nBu響應ClO-的可能機理

    2.2 探針MB-nBu對ClO-的響應光譜

    由于酰胺鍵的吸電子效應,MB-nBu自身無熒光發(fā)射。如圖4所示,隨著次氯酸的加入,酰胺鍵斷裂熒光團熒光恢復,MB的特征吸收迅速顯示,在680 nm處有一個峰,探針發(fā)出強烈的紅色熒光。探針在680 nm處的熒光發(fā)射峰強度不斷增高,熒光強度變大。當加入10 μM的ClO-時,熒光強度增強約100倍(從7到670),且當加入次氯酸10 μM時,探針的熒光發(fā)射基本達到平衡。另外,探針的熒光強度與0-10 μM的次氯酸濃度呈完美的線性關系(FL=62.39[ClO-]+23.99,R2=0.998 1),檢測限為29.7 nM。低的檢測限表明該探針滿足于細胞等生理狀態(tài)中次氯酸的濃度(10-8~10-6M)檢測。

    圖4 不同梯度濃度ClO-下(0~25 μM):(a)探針MB-nBu的熒光發(fā)射光譜(640 nm~750 nm);

    2.3 探針的穩(wěn)定性測試

    為了研究探針的穩(wěn)定性,測試了探針在不同酸堿度條件下的熒光強度,如圖5a所示。可以看出,該探針在6.5~8.5的酸堿度范圍內相對穩(wěn)定,因此該探針具有在體內檢測ClO-的潛力??紤]到這一點,選擇了pH 7.4作為以后的實驗。然后,測量了探針在不同濃度ClO-中的熒光強度隨時間的變化。圖5b顯示,加入不同濃度的ClO-后,熒光強度立即增加到最大值(<1s),然后保持相對穩(wěn)定。在隨后的120 s內,熒光強度保持穩(wěn)定在最大值。極短的響應時間更適合對生物體中的ClO-物質進行實時成像。

    圖5 (a)不同pH條件,探針MB-nBu及有添加10 μM ClO-后的熒光強度;

    2.4 探針的選擇性測試

    為了評估探針對ClO-的檢測選擇性,在加入各種干擾劑后,進一步研究了MB-nBu的和熒光響應光譜(圖6),所述干擾劑包括: Blank、H2O2、ONOO-、·OH、NO、t-BuOO-、K+、Na+、Li+、Ag+、Mg2+、Ca2+、Zn2+、Ca2+、Fe2+、Fe3+、Al3+、NH4+、Cl-、CH3COO-、Br-、NO3-、I-、CO32-、SO42-、ClO4-、F-、S2O32-、S2O42-、Cys、GSH、Gly。加入50 μM的其他物種后,探針的熒光強度基本沒有發(fā)生變化。結果表明該探針MB-nBu對ClO-的檢測具有高選擇性。

    圖6 (a)探針MB-nBu對不同分析物最大發(fā)射強度柱狀圖;

    2.5 細胞毒性

    這里通過MTT法來確定探針MB-nBu的細胞毒性,以0-100 μM的梯度濃度的探針溶液對HeLa細胞進行孵育24 h,觀察24 h后細胞的存活率。如圖4b所示,當探針的濃度在12.5 μM以內時,HeLa細胞能維持在90%以上的存活率。當孵育的探針濃度達到100 μM時,HeLa細胞的存活率依然在80%以上。結果表明,探針MB-nBu具有較低的細胞毒性,具有細胞水平成像應用的潛力。

    2.6 細胞成像

    由于探針MB-nBu具有對次氯酸較好的的識別性能、低的細胞毒性,進一步研究了探針在細胞中的成像能力。發(fā)現當僅用探針MB-nBu孵育細胞,基本沒有觀察到可見的熒光(a~c)。如圖7所示,而當加入外源性ClO-(5 μM)孵育有探針的HeLa細胞時,通過細胞成像儀觀察到有明顯的紅色熒光產生(d~f)。結果表明探針MB-nBu可在活細胞中檢測ClO-濃度。在加入2 μg/mL 的PMA培育細胞后,細胞中出現明亮的紅色熒光現象(g~i)。這證明了探針MB-nBu的細胞通透性良好,以及在活細胞中識別次氯酸的能力,可用于細胞內外源性及內源性ClO-的成像。

    圖7 共聚焦成像:細胞中只加入探針MB-nBu(a~c)、加入探針及次氯酸(d~f)、加入探針及PMA(g~i)

    3 結論

    以亞甲基藍為熒光團,設計并合成出了一種具有高靈敏度、高選擇性的ClO-熒光探針。探針MB-nBu對ClO-具有超快速(<1s)、高特異性、低檢測限、良好的熒光穩(wěn)定性等優(yōu)點,以及低的細胞毒性,并成功應用于HeLa細胞中的內源性和外源性ClO-的細胞成像。總之,探針MB-nBu在環(huán)境和生物學領域特異性檢測ClO-方面有很好的應用前景。

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