Fe3O4納米粒子的仿生修飾及葉酸靶向功能化研究

劉曉迪， 張寒思， 宋新峰

（1. 德州學院 醫(yī)藥與護理學院，山東 德州 253023；2. 華東師范大學 研究生院，上海 200062）

四氧化三鐵（Fe3O4）納米顆粒具有優(yōu)良的磁學性能、量子隧道效應、比表面積高、粒徑小、分布均勻、易于滲透和易被網(wǎng)狀內皮系統(tǒng)吞噬等的特性，能明顯增強的T2造影效應；并且，在外加磁場作用下Fe3O4將電磁能轉化為熱能，隨磁場變化產(chǎn)生熱效應，被用于疾病的熱療。因此，F(xiàn)e3O4已被廣泛地應用于生物醫(yī)學領域[1]。但是，由于Fe3O4納米顆粒粒徑小、比表面能大，裸露的納米粒子有強烈的聚集傾向，導致粒徑尺寸大、分布寬，影響了在溶液中的分散性和生物相容性，無法滿足生物醫(yī)學的應用標準[2]。

通常通過對超順磁性納米粒子進行表面修飾，降低表面能，增強粒子抗氧化能力，提高粒子的分散性、溶解性和生物相容性。已有不少Fe3O4納米顆粒的成功修飾方法，如徐光輝等[3]通過超聲處理－化學鍍法，利用正硅酸乙酯、AgNO3修飾制備Fe3O4@SiO2-Ag核殼納米粒子。因貽貝類動物的粘附性蛋白超強粘附性能，美國西北大學的Messersmith等[4]提出一種利用多巴胺（DOPA）氧化聚合以及聚多巴胺沉積的新型仿生修飾方法，對聚四氟乙烯或聚乙烯等材料的表面改性。

受此啟發(fā)，本文用一種溫和、簡易、環(huán)保的DOPA仿生修飾Fe3O4方法。

葉酸（FA）是人體必須的維生素，具有分子小、無毒且免疫原性低，滲透快等優(yōu)點，能特異性地結合于腫瘤細胞表面過度表達的葉酸受體（Folate Receptor，F(xiàn)R）。FR在一些惡性腫瘤（如肝癌、卵巢、鼻咽、子宮內膜和肺癌等）高度表達，而正常的細胞不表達，使FR在腫瘤細胞的檢測和靶向治療方面發(fā)揮優(yōu)勢[5]。因此，本文將葉酸與磁性納米粒子結合可以增加納米材料在腫瘤部位的富集性，并且誘導腫瘤組織內的網(wǎng)狀內皮系統(tǒng)的內吞作用，因此不僅作為靶向造影劑，還可進行靶向治療。

1 實驗

1.1 試劑與儀器

FeCl3·6H2O、FeSO4·7H2O （天津市耀華化工廠），多巴胺亞酸鹽（北京百靈威科技有限公司），葉酸 （上海麥克林生化有限公司），RAW 264.7細胞（中國協(xié)和醫(yī)科大學基礎醫(yī)學研究所細胞中心）。

馬爾文粒度儀（英國馬爾文儀器有限公司），熱重-差示量熱掃描儀（美國梅特勒-托利多公司），振動樣品磁強計（南京南大儀器有限公司），傅立葉變換-紅外光譜儀（美國賽默飛公司），掃描電鏡（德國卡爾蔡司公司），SDD能譜儀（牛津儀器（上海）有限公司）。

1.2 SPIONs@PDA-FA制備

參考崔生等[6]采用共沉淀法制備Fe3O4磁性納米顆粒。

按照Fe2+/2Fe3+＝1∶2摩爾比，精確稱量FeCl3·6H2O和FeSO4·7H2O超聲溶解分散于去離子水中。將上述溶液轉入三口瓶中，氮氣保護，常溫（25℃）條件下，機械攪拌10 min（800 r/min），混勻。緩慢滴加濃度25% 氨水，使反應液pH值在9.85，氮氣保護，常溫（25℃）條件下，機械攪拌10 min（800 r/min）。

在上述反應結束，參考Lee H等[4]向反應液中滴加3.6%的鹽酸溶液，調pH值至8.5，隨后氮氣保護下加入現(xiàn)配的多巴胺鹽酸鹽溶液；在25℃、有氧條件下，機械攪拌30 min（500 r/min）；反應完畢后，利用外加磁場分離、去離子水洗滌3遍，制得SPIONs@PDA。

稱取已經(jīng)制備好的SPIONs-PDA 0.3 g溶解到50 mL的無水吡啶，再加入0.5 g NHS-folate，在室溫、避光條件下，機械攪拌24 h（200 r/min）；反應結束后，利用外加磁場分離產(chǎn)物，依次用乙醇-正己烷混合液、無水乙醇、去離子水洗滌3 次，然后將產(chǎn)物部分用真空干燥，制得SPIONs@PDA-FA顆粒。

1.3 三種磁性納米粒子的表征及評價

對制備的SPIONs、SPIONs@PDA、SPIONs@PDA-FA三種納米粒子按照測試要求進行處理，分別用掃描電鏡、馬爾文粒度儀、振動樣品磁強計、差示-熱重分析儀以及傅里葉紅外光譜等對其形貌、粒徑大小及分布磁學性能、化學組成等進行了表征，并考察了對體外巨噬細胞的內吞效應的影響。

2 結果與討論

2.1 三種磁性納米粒子的形貌分析

SPIONs、SPIONs@PDA、SPIONs@PDA-FA三種磁性納米粒子的掃描電鏡結果如圖 1所示，SPIONs納米粒子形態(tài)規(guī)則成球形結構，大小分布均勻，粒徑在 20～30 nm之間（圖1 A）；而SPIONs@PDA和SPIONs@PDA-FA兩種納米粒子的粒徑較SPIONs裸粒子有所增加，粒子粒徑約為30～40 nm（圖1 B、圖1 C），推斷是由于DOPA包覆在SPIONs納米粒子表面所致；因為 FA為小分子，在SPIONs@PDA納米粒子表面鍵合的量有限，所以，其粒徑無沒明顯變化。

圖1 SPIONs（A）、SPIONs@PDA（B）、SPIONs@PDA-FA（C）納米粒子的電鏡圖

2.2 三種磁性納米粒子的粒徑分析

SPIONs、SPIONs@PDA、SPIONs@PDA-FA三種磁性納米粒子的粒徑如圖2所示，均呈單峰分布，分布范圍較窄，其平均粒徑依次為315.1 nm、384.7 nm、398.4 nm，表明三種磁性納米粒子大小均一。另外，SPIONs、SPIONs@PDA、SPIONs@PDA-FA納米粒子的馬爾文粒徑測量結果均比掃描電鏡大，分析主要原因可能是Fe3O4在水中發(fā)生了團聚，導致SPIONs偏大；而Fe3O4表面被的DOPA、FA修飾后，增強了水合效應，從而使SPIONs@PDA、SPIONs@PDA-FA納米粒子的粒徑增大。

圖2 SPIONs（A）、SPIONs@PDA（B）、SPIONs@PDA-FA（C）納米粒子的粒徑分布圖

2.3 三種磁性納米粒子的成分分析

大面積SDD能譜儀檢測結果，如圖3 A所示，SPIONs納米粒子中含有Fe、O兩種元素，提示Fe3O4。仿生修飾DOPA后，SPIONs@PDA納米粒子中又出現(xiàn)了C、N兩種元素，表明DOPA成功包覆在SPIONs納米粒子表面。鍵合FA后的SPIONs@PDA-FA納米粒子也出現(xiàn)了C、N兩種元素，且這兩種元素的含量增加，表明FA鍵合在SPIONs@PDA納米粒子表面。

圖3 SPIONs（A）、SPIONs@PDA（B）、SPIONs@PDA-FA（C）納米粒子的大面積SDD能譜元素測定圖

2.4 三種磁性納米粒子的結構分析

由圖4 A可見，在578 cm-1處的吸收峰對應于 SPIONs中 Fe-O 鍵的振動；圖4 B表明，芳香環(huán)官能團 C=C 伸縮振動的吸收峰出現(xiàn)在1457 cm-1和1760 cm-1處，而3253 cm-1處的吸收峰對應芳香環(huán)的 O-H伸縮振動，表明聚多巴胺已在SPIONs表面生成；如圖4 C所示，SPIONs@PDA-FA出現(xiàn)了特征性的苯環(huán)峰值3050 cm-1，葉酸中的亞甲基（-CH2）的特征吸收峰出現(xiàn)在2929 cm-1處，于1644 cm-1和1490 cm-1處 出現(xiàn)由葉酸的蝶啶環(huán)和苯甲?；炜s震動產(chǎn)生的葉酸特征峰，這表明FA已成功鍵合到SPIONs表面，與潘廣伯等[11]的研究結果一致。

圖4 SPIONs（A）、SPIONs@PDA（B）、SPIONs@PDA-FA（C）納米粒子的紅外分析譜圖

2.5 三種磁性納米粒子的組份測定結果

由圖5中曲線A可知，從25℃升至150℃，純 SPIONs納米粒子的失重率約為5.03%，是 SPIONs納米粒子表面吸附的水揮發(fā)所致，隨著溫度的升高，SPIONs納米粒子發(fā)生相變而成為 Fe2O3。由圖5中B可知，SPIONs@PDA納米粒子的總失重率約為45.75%，除去表面吸附的水，還有包覆的DOPA。其中，在25～150℃的范圍內主要是除去SPIONs@PDA納米粒子表面吸附水，失重率約為10.02%；當溫度高于150℃以后，隨著溫度的升高，包覆的DOPA開始緩慢分解并被除去，同時SPIONs納米粒子發(fā)生相變而成為 Fe2O3。從這些數(shù)據(jù)看，DOPA修飾SPIONs的納米粒子的含量約為35.73%。圖5中C表明，SPIONs@PDA-FA納米粒子的總失重率達到57.80%，其中從25℃升至150℃，主要是SPIONs@PDA-FA納米粒子表面吸附的水，失重率約為11.53%；當溫度高于150℃以后，隨著溫度的升高，包覆的DOPA、FA開始緩慢分解并被除去，同時SPIONs納米粒子發(fā)生相變而成為 Fe2O3。由此，表明在SPIONs納米粒子表面包覆的DOPA和鍵合的FA總量約為46.27%。再結合SPIONs@PDA納米粒子的總失重情況，可以推斷FA已經(jīng)成功鍵合到DOPA包覆的SPIONs納米粒子表面。

圖5 SPIONs（A）、SPIONs@PDA（B）、SPIONs@PDA-FA（C）納米粒子的熱重分析圖

2.6 三種磁性納米粒子的磁飽和強度測定結果

由圖6中所示A、B、C三條磁滯回線顯示，SPIONs、SPIONs@PDA、SPIONs@PDA-FA三種磁性納米粒子均幾乎沒有剩磁和頑磁，矯頑力接近0，說明本實驗制備的納米粒子具有超順磁性。另外，A、B、C三條磁滯回線也顯示三種磁性納米粒子有較好的磁飽和強度，其中SPIONs磁性納米粒子的平均飽和磁矩值為52.30 emu/g，經(jīng)多巴胺修飾后，SPIONs@PDA納米粒子的飽和磁矩值降為46.60 emu/g，磁化強度下降，主要是多巴胺為無磁性的高分子物質，修飾在SPIONs納米粒子表面，對其磁性造成影響，在多巴胺修飾的SPION納米粒子表面鍵合FA后，SPIONs@PDA-FA納米粒子的飽和磁矩值為39.43 emu/g，下降不明顯，仍具有較好的的磁學性能，符合MRI成像要求[12]。

圖6 SPIONs（A）、SPIONs@PDA（B）、SPIONs@PDA-FA（C）納米粒子的磁性檢測

2.7 三種磁性納米粒子的體外巨噬細胞攝取實驗結果

將制備好的SPIONs、SPIONs@PDA、SPIONs@PDA-FA三種納米粒子分別與小鼠巨噬細胞孵育24 h，結果如圖7所示與A空白細胞比較，小鼠巨噬細胞對SPIONs、SPIONs@PDA、SPIONs@PDA-FA三種磁性納米粒子均具有吞噬效應，而其中SPIONs@PDA-FA納米粒子的吞噬效應略微優(yōu)于其他兩種納米粒子。另外，三種納米粒子的濃度梯度實驗也表明隨著納米粒子濃度的增加，會提高小鼠巨噬細胞的內吞效果。

圖7 空白細胞（A），分別吞噬SPIONs（B）、SPIONs@PDA（C）、SPIONs@PDA-FA（D）納米粒子的細胞圖

3 結論

本實驗利用多巴胺的氧化自聚原理，實現(xiàn)了SPIONs納米粒子的仿生修飾，并耦合FA賦予納米粒子腫瘤靶向，形成了超順磁性氧化鐵-多巴胺-葉酸（SPIONs@PDA-FA）納米復合物，建立一種溫和的SPIONs仿生修飾方法，具有一定的創(chuàng)新性。多巴胺分子中羥基、氨基等親水性官能團，改善SPIONs的水溶性及其生物相容性，該設計思路較為新穎。

利用DOPA作為連接體，將FA分子成功地與SPIONs納米粒子偶聯(lián)，實現(xiàn)了SPIONs粒子的靶向功能化，該化合物具有腫瘤細胞的靶向介導功能，且毒性小，擴大了在生物醫(yī)學領域應用，如靶向給藥、核磁共振成像、腫瘤細胞示蹤等，具有重要的意義。功能化的SPIONs制備成功，一方面，降低SPIONs的高比表面能，改善粒子的聚沉，保持納米顆粒單分散性，獲得有良好水分散性、生物相容性，為其在生物學的廣泛應用奠定基礎；另一方面，提高了在腫瘤部位的富集，實現(xiàn)SPIONs造影劑腫瘤靶向性。