SCN2B在APP/PS1小鼠腦組織中對APP加工處理的作用

趙浩然，李 珊，嚴國紀，董曉函，習楊彥彬

(昆明醫(yī)科大學 基礎(chǔ)醫(yī)學院神經(jīng)科學研究所，云南 昆明 650500)

隨著我國老年人口的不斷增長，人口老齡化所帶來的健康問題也日益嚴峻。隨著年齡的增加，腦老化導致包括學習記憶、感覺運動和認知能力等一系列大腦機能衰退[1]。隨著認知功能的持續(xù)下降，很有可能進一步發(fā)展為以學習記憶能力嚴重減退為主要表現(xiàn)的阿爾茲海默病(Alzheimer disease，AD)。AD作為一種隱匿的進行性神經(jīng)退行性疾病，是目前導致老年人最終發(fā)生失智或癡呆(Dementia)的主要原因。Aβ產(chǎn)生的一個關(guān)鍵因素是淀粉樣前體蛋白(Amyloid precursor protein，APP)被蛋白酶水解成不同活性的片段。目前,AD的病理學改變主要為β淀粉樣蛋白(Amyloid-β，Aβ)在功能腦區(qū)的過度生成和累積，這是神經(jīng)纖維纏結(jié)產(chǎn)生、神經(jīng)變性以及神經(jīng)炎癥的主要因素[2]。目前，針對AD多以對癥、支持治療為主，缺乏有效的治療手段。而對AD發(fā)病機制，尤其是對AD病理進程中Aβ產(chǎn)生的機制做進一步闡明，可為疾病的精準治療指引正確方向。

最近一系列研究表明，電壓門控性鈉離子通道(Sodium channel-voltage-gated，VGSC)作為中樞神經(jīng)元動作電位產(chǎn)生和傳遞的基礎(chǔ)，在心臟傳導相關(guān)疾病、癲癇、神經(jīng)性疼痛、神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病等中扮演著重要的角色[3]。神經(jīng)元動作電位的產(chǎn)生通常由電壓門控鈉離子通道去極化介導，鈉離子通道由一個核心α亞基和兩個輔助β亞基(β1和β2)共同組成蛋白質(zhì)復(fù)合體，通過腦內(nèi)的SCN1A、SCN1B和SCN2B等基因編碼產(chǎn)生。其中輔助β亞基雖然不直接參與離子通道開放或失活等主要生物學功能組成，但在細胞信號傳遞、維持細胞膜穩(wěn)定性、調(diào)節(jié)部分離子通道門控特異性等方面的作用同樣不可忽視?，F(xiàn)有研究表明這些鈉離子通道蛋白結(jié)構(gòu)與功能的變化導致的鈉離子內(nèi)流改變在神經(jīng)退行性相關(guān)疾病中起著關(guān)鍵作用[4]，這些研究提示鈉離子通道干預(yù)藥物可能在AD治療中是一個潛在的作用靶點。

本研究通過分析電壓門控性鈉離子通道二型β亞基(Sodium channel-voltage-gated-beta2，SCN2B)在AD模式動物腦內(nèi)參與APP介導的Aβ加工和處理中發(fā)揮的作用，以闡述AD疾病中的一種潛在的調(diào)控機制，進一步驗證SCN2B與AD病理性APP代謝途徑、Aβ沉積之間的可能關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物APPswe/PS1ΔE9 (APP/PS1) 轉(zhuǎn)基因小鼠由合作伙伴澳大利亞莫納什大學肖志誠教授惠贈。SCN2B-/-、SCN2B+/- 及SCN2B+/+ 三種轉(zhuǎn)基因小鼠均由協(xié)和醫(yī)科大學中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所張連峰教授實驗室團隊提供。分別選取6～8周齡的不同性別的APP/PS1分別與SCN2B-/-、SCN2B+/- 及SCN2B+/+轉(zhuǎn)基因小鼠按照(2雌1雄)方式合籠雜交，獲得APP+SCNB2-/-(APP/PS1SCN2B低表達純合子)、APP+SCN2B+/-(APP/PS1SCN2B雜合子)和APP+SCN2B+/+(APP/PS1SCN2B過表達純合子)3種轉(zhuǎn)基因小鼠。小鼠均在昆明醫(yī)科大學SPF級實驗動物房飼養(yǎng)，溫度控制在22°C左右，每日12 h光照、12 h黑暗，自由攝食和飲水。

1.2 主要試劑 DEME購買于以色列BI公司(biological industries);胎牛血清及Neurobasal購買于GIBCO公司；鼠尾DNA檢測試劑盒購買于北京全式金公司；Trizol試劑盒購自biosharp公司；Revert AidcDNA試劑盒購買于美國fermentas公司；SCN2B抗體購買于以色列Alomone Labs公司；抗鼠抗體和GAPDH1抗體(sc47724和sc516132)購買于Santa Cruz公司；ELISA 試劑盒購自于美國Andygene公司。

1.3 轉(zhuǎn)基因小鼠基因型檢測 取3～7 d新生小鼠，每只約剪0.5 cm鼠尾組織，使用鼠尾DNA檢測試劑盒按步驟提取總DNA，樣本置于﹣80°C保存，特異性引物序列(見表1)。分別加入PCR Mix10 μL，PCR上下游引物各0.6 μL，DNA5 μL，雙蒸水3.8 μL構(gòu)成PCR總反應(yīng)體系，樣本置于PCR儀進行擴增。反應(yīng)條件為:循環(huán)35次，94℃變性1 min，59℃退火30 s，72℃延伸1 min，結(jié)束后置于4℃保存。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳，用紫外凝膠成像儀(Bio-Gel,Bio-red)進行可視化分析。獲得相應(yīng)的目的片段即為所需該品系轉(zhuǎn)基因小鼠。

1.4 RT-PCR檢測轉(zhuǎn)基因小鼠腦腦皮質(zhì)與海馬中SCN2B的表達 分別選取5種品系轉(zhuǎn)基因小鼠，用戊巴比妥按照(1 mL/kg)進行腹腔注射麻醉,后取出腦組織并分離出海馬組織和腦皮質(zhì)部分。使用Trizol試劑盒提取總RNA。利用primer 6.0設(shè)計引物(見表1)。使用Revert AidcDNA合成試劑盒(Fermentas Company)合成cDNA。然后加入PCR Master Mix Kit置于PCR儀進行PCR 擴增，反應(yīng)條件為：循環(huán)35次，94°C下變性1 min、退火1 min，72℃下延伸1 min。獲得的PCR產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠中電泳，用紫外凝膠成像儀(Bio-Gel，Bio-Rad)進行可視化分析。使用Imager J 6.0軟件進行圖像分析。

表1 引物序列

1.5 Western blot檢測轉(zhuǎn)基因小鼠腦腦皮質(zhì)與海馬中SCN2B的表達 戊巴比妥按照(1 mL/kg)進行腹腔注射以麻醉小鼠,取出腦組織，收集海馬和腦皮質(zhì)部分置于1.5 mL離心管中，分別加入10 mM Tris-HCl緩沖液(pH 7.4)，10 mM EDTA，30%Triton-1000、10%SDS，蛋白酶抑制劑混合物(Roche)和NaCl,在冰盒上使用勻漿機進行勻漿。隨后置于離心機中以12 000 rpm/min，4°C條件下離心30 min。配置10%SDS-PAGE凝膠進行電泳，保留目的蛋白一并蛋白質(zhì)印跡分析。轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，將膜放入5%脫脂奶粉封閉1 h，隨后將PVDF膜與抗SCN2B抗體(1∶800)和抗GAPDH(1∶500)一起孵育抗體在4℃過夜。TBST洗滌后，再將膜與抗鼠抗體(1∶1 000)在25°C條件下孵育2 h。Image J 6.0軟件計算蛋白質(zhì)條帶的密度。

1.6 細胞培養(yǎng)及分組 選用新生的5種品系小鼠，包括野生型(WT)、APP/PS1+、APP/PS1+SCNB2-/-、APP/PS1+SCN2B+/- 、APP/PS1+SCN2B+/+。每個品系各5只，斷頸處死后，手術(shù)器械剝離顱骨與硬腦膜后迅速分離腦皮質(zhì)與海馬組織放入完全培養(yǎng)基，經(jīng)木瓜酶消化20 min，過濾后收集細胞懸浮液進行神經(jīng)原代培養(yǎng)；第1天12 h全量更換神經(jīng)元培養(yǎng)基，隨后每24小時半量更換神經(jīng)元培養(yǎng)基。

1.7 ELISA檢測Aβ40和Aβ42的水平 神經(jīng)元培養(yǎng)5d后取培養(yǎng)基與細胞溶解產(chǎn)物。按照Aβ40ELISA 試劑盒(AD2170MO)、Aβ42ELISA試劑盒(AD2169MO)的說明書指示將標準品梯度稀釋，繪制標準曲線。1 500 rmp/min離心10 min后收集細胞上清液樣品按照每孔加入50 μL含酶試劑樣品至酶標板，封板膜封板37°C恒溫箱孵育30 min，靜置1 min后棄液，重復(fù)5次，酶標儀設(shè)置為450 nm后依次測量各孔OD值。比較各品系轉(zhuǎn)基因小鼠神經(jīng)元細胞中的Aβ40和Aβ42的表達水平。

1.8 Western blot檢測蛋白含量 收集細胞懸浮液，除去殘留的培養(yǎng)基并離心，后加入裂解液提取總蛋白。配置10%SDS-PAGE凝膠進行電泳，保留目的蛋白部分轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，將膜放入5%脫脂奶粉封閉1 h。在4°C下分別與sAPPα(1∶100)、sAPPβ(1∶500)、APP C-Terminal(APPβ-CTF,1∶500)、AICD(1∶1 000)抗體孵育過夜，隨后用Image J 6.0軟件測量條帶密度。

事實上,當{xn}關(guān)于度量d收斂到0時,對任意的ε>0,存在N,使得d(xn,0)=xn<ε。此時ρ0(xn,0)=1-(xn→0)∧(0→xn)=1-(1-xn)=xn>ε。此時ρ0(xn,0)=1-(xn→0)∧(0→xn)=1-(1-xn)=xn

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)基因小鼠基因型鑒定 分別選取SCN2B-/-、SCN2B+/-及SCN2B+/+轉(zhuǎn)基因鼠與APP/PS1小鼠交配，運用特異性引物對各品系轉(zhuǎn)基因小鼠后代鼠尾組織提取的DNA進行PCR檢測，獲得相應(yīng)目的片段的樣品對應(yīng)為該品系轉(zhuǎn)基因小鼠。由此篩選出APP/PS1遺傳背景的APP/PS1+SCN2B-/-、APP/PS1+SCN2B+/-、APP/PS1+SCN2B+/+轉(zhuǎn)基因鼠小鼠，后將F1代同胞兄妹交配持續(xù)擴大繁殖數(shù)量，PCR檢測結(jié)果如圖1所示。結(jié)果顯示SCN2B-/-轉(zhuǎn)基因組新生小鼠均表達SCN2B-/-敲除插入的300bp片段(A)；SCN2B+/-轉(zhuǎn)基因組新生小鼠均表達SCN2B+/-部分敲除插入的456bp片段(B)；SCN2B+/+轉(zhuǎn)基因組新生小鼠均表達SCN2B+/-部分敲除插入的250bp片段(C)；說明本實驗按照預(yù)期獲得了相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因小鼠品系(見圖1)。

2.2 轉(zhuǎn)基因小鼠腦皮質(zhì)海馬中SCN2B的表達檢測 為驗證APP/PS1+SCN2B-/-、APP/PS1+SCN2B+/-、APP/PS1+SCN2B+/+各品系轉(zhuǎn)基因小鼠SCN2B的轉(zhuǎn)基因干預(yù)和過表達效率，分別取各品系小鼠腦皮質(zhì)及海馬進行檢測，每組5例(n=5)，檢測方法為實時熒光定量PCR及Western blot。結(jié)果顯示，APP/PS1+SCN2B-/-轉(zhuǎn)基因小鼠組海馬及腦皮質(zhì)組織中SCN2B的表達量幾乎檢測不到，而APP/PS1+SCN2B+/+小鼠與野生型相比，SCN2B的表達顯著增加，幾乎增加了2.2倍；APP/PS1+SCN2B+/-小鼠中表達則為APP/PS1+SCN2B+/+轉(zhuǎn)基因小鼠的60%左右。檢測結(jié)果證實，成功構(gòu)建APP/PS1+SCN2B-/-，APP/PS1+SCN2B+/-以及APP/PS1+SCN2B+/+轉(zhuǎn)基因小鼠(見圖2)。

A：與WT型比，P<0.05，n=5；SCN2B在上述各品系轉(zhuǎn)基因小鼠腦皮質(zhì)中的表達蛋白質(zhì)印記條帶；B：與WT型比，P<0.05，n=5；SCN2B在上述各品系轉(zhuǎn)基因小鼠海馬中的表達蛋白印跡條帶。 圖2 SCN2B在APP/PS1遺傳背景的SCN2B-/-，SCN2B+/-以及SCN2B+/+轉(zhuǎn)基因小鼠腦皮質(zhì)和海馬中表達的蛋白印跡結(jié)果

A：APP/PS1+SCN2B-/-轉(zhuǎn)基因小鼠基因型檢測；Lane 1:DNA MarkerDL 2,000 (從上到下分別為:2 000 bp，1 000 bp，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp)。Lane 2-7:轉(zhuǎn)基因鼠的鼠尾DNA PCR擴增產(chǎn)物，Lane 8:WT；B：APP/PS1+SCN2B+/-轉(zhuǎn)基因小鼠基因型檢測；Lane 2-7:轉(zhuǎn)基因鼠的鼠尾DNA PCR擴增產(chǎn)物，Lane 8:WT；C：APP/PS1+SCN2B+/+轉(zhuǎn)基因小鼠基因型檢測：Lane 2-7:轉(zhuǎn)基因鼠的鼠尾DNA PCR擴增產(chǎn)物，Lane 8:WT。 圖1 APP/PS1+SCN2B-/-，APP/PS1+SCN2B+/-以及APP/PS1+SCN2B+/+轉(zhuǎn)基因小鼠基因型檢測

2.3 Aβ40和 Aβ42在不同原代培養(yǎng)神經(jīng)元中的表達水平APP/PS1+組小鼠腦皮質(zhì)海馬神經(jīng)元中的Aβ40和Aβ42含量與APP/PS1+SCN2B-/-、APP/PS1+SCN2B+/-、APP/PS1+SCN2B+/+3種品系小鼠比較明顯降低(P<0.05)。APP/PS1+SCN2B+/+小鼠與APP/PS1+SCN2B-/-、APP/PS1+SCN2B+/- 組相比，Aβ40和 Aβ42含量相比明顯升高(P<0.05)。提示SCN2B基因過表達具有促進Aβ生成的作用(見圖3)。

*：與APP/PS1+組比,P<0.05,n=4;&：與APP/PS1+ SCN2B+/+組比較,P<0.05,n=4。 圖3 β40 和 Aβ42在各組細胞培養(yǎng)溶解產(chǎn)物中的表達水平

2.4SCN2B對不同品系轉(zhuǎn)基因小鼠細胞中APP酶解產(chǎn)物sAPPα，sAPPβ，APP-APPβ-CTF及AICD的表達水平 與APP/PS1+SCN2B+/+組小鼠相比較，WT組小鼠sAPPα，sAPPβ含量均升高，但APPβ-CTF與AICD片段含量處于相反的趨勢(P<0.05)；在APP/PS1+SCN2B+/-組小鼠中，sAPPα、sAPPβ含量呈現(xiàn)減少的趨勢，APP-APPβ-CTF與AICD表達顯著增加(P<0.05)；而與APP/PS1+組小鼠對比，sAPPα、sAPPβ含量表現(xiàn)出隨SCN2B的表達增加而減少，而APPβ-CTF與AICD片段含量則隨SCN2B的表達增加而增加(P<0.05)。此結(jié)果提示SCN2B基因?qū)APPα、sAPPβ、APPβ-CTF和AICD的合成具有一定的調(diào)控作用(見圖4)。

*：與APP/PS1+ SCN2B+/+組比較，P<0.05,n=4；&：與WT組比較，P<0.05；#：與APP/PS1+組比較，P<0.05,n=4。 圖4 各品系細胞培養(yǎng)基中sAPPα，sAPPβ，APP-APPβ-CTF及AICD表達的蛋白印跡結(jié)果

3 討論

AD的主要病理改變以淀粉樣蛋白(Aβ)在正常腦區(qū)異常聚集形成的老年斑塊為特征，此過程與APP蛋白的酶解過程密切相關(guān)[6]。APP的代謝途徑主要有兩條：淀粉樣代謝途徑及非淀粉樣代謝途徑。APP經(jīng)由淀粉樣代謝途徑降解的過程如下：APP被β-分泌酶水解切割成可溶性APPβ片段(sAPPβ)，C-末端片段(APPβ-CTF)，隨后被位于細胞膜上的γ-分泌酶分解釋放出Aβ[7]。Aβ主要由40個和42個淀粉樣肽殘基(Aβ40和Aβ42)組成，Aβ寡聚體形成是導致AD患者的記憶能力衰退和神經(jīng)系統(tǒng)毒性的關(guān)鍵因素，不同長度Aβ的相互聚集形成Aβ寡聚體進而表現(xiàn)出對神經(jīng)元的毒性損傷作用[8]。而在非淀粉樣蛋白途徑中，APP可被α-分泌酶切割，釋放可溶性片段(sAPPα)，經(jīng)微循環(huán)代謝排出，加速Aβ溶解并減輕Aβ對神經(jīng)元的持續(xù)性損傷[9-10]。由此，對APP代謝過程及其代謝產(chǎn)物的監(jiān)測有助于觀察疾病進展及藥物療效評估。

已有研究發(fā)現(xiàn)SCN2B作為參與AD及腦老化的相關(guān)基因，雖不直接參與離子通道的組成，但在調(diào)節(jié)功能性亞基功能蛋白在細胞膜的表達和穩(wěn)定性、信號傳導、通道的激活與失活中具有重要作用[11]。SCN2B可通過調(diào)控鈉離子通道結(jié)構(gòu)，從而影響神經(jīng)元的鈉離子內(nèi)流及電生理特性改變。近年來，隨著研究的不斷深入，還發(fā)現(xiàn)SCN2B可間接調(diào)控質(zhì)膜中的鈉通道的數(shù)量，增加鈉離子峰值電流的密度提高去極化速度，從而提高鈉通道從激活向失活狀態(tài)的恢復(fù)效率[12]。越來越多的證據(jù)表明，SCN2B編碼的鈉離子通道亞基蛋白上的Ig結(jié)構(gòu)域可以與其他細胞黏附分子相互作用，發(fā)揮類似細胞粘附功能[13]。但是，關(guān)于它們在老化相關(guān)的分子機制與病理性改變，尤其是與學習記憶相關(guān)功能衰退過程中的作用及機制卻鮮有報道。筆者在前期研究中準備了SCN2B基因敲低小鼠模型，表型檢測結(jié)果顯示SCN2B基因下調(diào)60.68%可以顯著改善轉(zhuǎn)基因小鼠空間認知記憶能力[14]，提示SCN2B可能與小鼠認知功能相關(guān)。APP/PS1小鼠在6月齡左右可表現(xiàn)出空間記憶能力喪失及AD相關(guān)癥狀，是目前國內(nèi)外研究AD的使用疾病模型[15]。

本研究通過制作APP/PS1+SCN2B-/-、APP/PS1+SCN2B+/-、APP/PS1+SCN2B+/+ 3種轉(zhuǎn)基因小鼠疾病模型，發(fā)現(xiàn)在5月齡會表現(xiàn)出與APP/PS1+轉(zhuǎn)基因小鼠相似的認知功能障礙癥狀，通過實時熒光定量PCR及免疫印跡檢測3種轉(zhuǎn)基因動物SCN2BmRNA和蛋白表達量，結(jié)果顯示APP/PS1+SCN2B-/-組海馬及腦皮質(zhì)組織中SCN2B表達量幾乎檢測不到，但與野生型相比，SCN2B+/+組小鼠的SCN2BmRNA和蛋白表達量均顯著增加，幾乎增加了2.2倍，而SCN2B+/-組SCN2B的表達則為野生型的60%左右。結(jié)果表明，筆者基于APP/PS1小鼠的遺傳背景成功構(gòu)建了SCN2B-/-(敲除)、SCN2B+/-(敲低)以及SCN2B+/+(過表達)轉(zhuǎn)基因小鼠。接下來，本研究用ELISA法檢測了Aβ在各組轉(zhuǎn)基因小鼠腦皮質(zhì)與海馬神經(jīng)元細胞中的表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)APP/PS1+SCN2B+/+組腦內(nèi)Aβ含量較APP/PS1+SCN2B-/-組顯著增多，且當動物體內(nèi)SCN2B表達增加時，Aβ含量呈現(xiàn)隨SCN2B增加而增加的趨勢；還發(fā)現(xiàn)過表達SCN2B可以促進APP向致病性片段Aβ40和Aβ42的分解過程，而將SCN2B敲除可以顯著抑制這一過程。隨后，通過驗證SCN2B在APP不同酶解途徑中的調(diào)控作用，證實了過表達SCN2B可以促進APP更多的通過β-分泌酶途徑分解為致病性的APPβ-APPβ-CTF、AICD以及sAPPβ片段，減少經(jīng)α-分泌酶途徑酶解為水溶性可代謝的sAPPα片段。結(jié)果提示敲低SCN2B可以影響APP酶解過程，有利于APP向生成可溶性Aβ的方向發(fā)展，減少不溶性神經(jīng)毒性的Aβ在正常腦區(qū)的過度聚集。

筆者前期在對APP/PS1小鼠進行SCN2B基因敲低處理后，發(fā)現(xiàn)其可誘導腦啡肽酶(Neprilysin，NEP)的活性增高和表達水平增加，增強NEP與APP致病性代謝產(chǎn)物AICD的結(jié)合，進而促進APP/PS1小鼠腦內(nèi)淀粉樣蛋白的清除[16]。還有研究表明SCN2B基因敲低可上調(diào)Nav1.2、Nav1.6在軸突中的表達，對神經(jīng)電位傳導恢復(fù)具有一定促進作用，Nav1.1雖然也檢測到表達變化，但在神經(jīng)元中的具體作用還不清楚[17]。盡管β2亞基不直接影響Na電流水平，但它的存在對維持神經(jīng)元細胞結(jié)構(gòu)和通道蛋白的穩(wěn)定性是必需的。同時，β2亞基與α亞基共價結(jié)合形成復(fù)合物也是發(fā)揮限制功能性Na+通道電流速率的關(guān)鍵因素，SCN2B在神經(jīng)元興奮性調(diào)節(jié)，Na通道密度和細胞膜定位等方面起著十分重要的作用[18]。接下來對β4亞基的氨基酸序列研究發(fā)現(xiàn)它與β2亞基的氨基酸序列同源性>35%，提示兩種亞基在參與Na通道蛋白形成過程中存在相似作用，所以其在神經(jīng)元穩(wěn)定性方面的作用不可忽視。這一系列研究表明，SCN2B可能是基于調(diào)控神經(jīng)元軸突Na通道的密度與結(jié)構(gòu)表達來發(fā)揮相應(yīng)生物學功能。

結(jié)合文獻報道以及本研究的發(fā)現(xiàn)，敲低SCN2B有利于推動APP向生成可溶性Aβ的方向酶解，減少不溶性神經(jīng)毒性的Aβ在正常腦區(qū)的過度聚集，從而發(fā)揮神經(jīng)保護作用。本研究部分揭示了SCN2B在對APP 加工處理及Aβ產(chǎn)生中的作用,為神經(jīng)保護特別是AD藥物的研發(fā)提供了潛在作用靶點。但SCN2B調(diào)控APP的酶解進程是否有助于認知功能改善還有待進行更深入的研究證實。