睪酮冰凍人血清國家標(biāo)準(zhǔn)品的研制

于 婷， 沈 敏， 曲守方， 孫 楠， 孫 晶， 黃 杰

（1. 中國食品藥品檢定研究院體外診斷試劑所非傳染病診斷試劑室，北京 100050；2. 美康生物參考實驗室，浙江 寧波 315104）

睪酮是一種重要的雄激素，主要來源于睪丸間質(zhì)細(xì)胞。在雄性睪丸、雌性卵巢以及腎上腺中均有分泌。睪酮在機體內(nèi)具有維持生殖功能和第二性征、增強肌肉強度與質(zhì)量、維持骨密度[1]等重要的生理作用。有研究結(jié)果表明，生理水平的睪酮對男性心血管系統(tǒng)有益，睪酮缺乏與心血管疾病的發(fā)生有關(guān)[2-3]。睪酮水平增高常見于尿毒癥、男性性早熟、先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥、前列腺腫瘤[4-5]等。睪酮水平降低常見于先天性睪丸發(fā)育不全或不發(fā)育、隱睪、性腺功能減退[6]等疾病。因此，準(zhǔn)確測定血清中的睪酮水平，對于疾病的診斷、監(jiān)測具有重要意義。目前，血清基質(zhì)的睪酮國際標(biāo)準(zhǔn)品購買周期較長，且費用較高，而我國僅國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗中心制備過冰凍人血清睪酮標(biāo)準(zhǔn)品，但數(shù)量較少，遠(yuǎn)不能滿足實際需求。因此，我們研制了人血清基質(zhì)的睪酮國家標(biāo)準(zhǔn)品，以促進(jìn)血清中睪酮測定的標(biāo)準(zhǔn)化。

1 材料和方法

1.1 主要儀器和試劑

S40 SevenMulti綜合測試儀、XS205DU電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；N-EVAP 24位氮吹儀（美國Organomation公司）；2XZ-1旋片式真空泵（臨海譚氏真空設(shè)備公司）；LC30AD-QTRAP5500超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、AB5500液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國ABSCIEX公司）；TQ-S高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Waters公司）；MS-C120全自動化學(xué)發(fā)光儀（寧波美康公司）；cobas 8000全自動免疫分析儀（瑞士羅氏公司）；IS1200全自動化學(xué)發(fā)光測定儀（四川邁克公司）。均勻性和穩(wěn)定性評價用試劑盒：睪酮檢測試劑盒（化學(xué)發(fā)光免疫分析法，批號20180725，寧波美康公司）?；ネㄐ栽u價用試劑盒：血清睪酮檢測試劑盒[電化學(xué)發(fā)光法，批號353201，羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司]、睪酮測定試劑盒（化學(xué)發(fā)光法，批號0919031，四川邁克公司）。

1.2 方法

1.2.1 侯選品制備 收集外觀透明、清澈，無脂血、溶血和黃疸的血清，同時檢測乙型肝炎病毒表面抗原、丙型肝炎病毒抗體、人類免疫缺陷病毒抗體和梅毒螺旋體抗體，取4種病毒抗體檢測均為陰性的血清樣本，按照睪酮濃度的高低合并成2個不同水平的大樣，分別混勻后，進(jìn)行多重過濾和除菌處理。將過濾后的血清按照0.5 mL分裝入1.5 mL棕色冷凍玻璃瓶。制備好的候選品于-70 ℃條件下保存。

1.2.2 均勻性分析 按照文獻(xiàn)[7-8]要求進(jìn)行均勻性分析。在分裝的前、中、后各抽取10支候選品，采用MS-C120全自動化學(xué)發(fā)光儀進(jìn)行測定，每支候選品均測定3次。

1.2.3 短期穩(wěn)定性分析 按照文獻(xiàn)[9]要求進(jìn)行短期穩(wěn)定性分析。分別于第1、2、3、5、7、12、20、30 d 8個時間點從候選品Ⅰ、Ⅱ中各隨機抽取6支，分別在-20 ℃、（2～8）℃、（20～25）℃條件下各放置2支，各時間點的取樣時間保持一致，采用MS-C120全自動化學(xué)發(fā)光儀進(jìn)行測定，每支候選品測定3次，求均值，中間穿插測定2個水平質(zhì)控品。以各時間點為橫坐標(biāo)，以候選品測定均值為縱坐標(biāo)作圖，采用Excel 2010軟件進(jìn)行線性擬合回歸分析，評價候選品穩(wěn)定性的趨勢性變化，并計算斜率（k）、截距（b）和斜率（k）的標(biāo)準(zhǔn)差（sk），計算公式為：

在置信水平p=0.95、自由度為n-2的條件下，查t-分布界值表，得到對應(yīng)的t（0.95，n-2）值。計算t（0.95，n-2）·sk的值，比較|k|值與t（0.95，n-2）·sk的值，如果|k|

1.2.4 聯(lián)合定值 要求參加定值的實驗室近2年睪酮項目參考實驗室外部質(zhì)量評價計劃（the International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine External Quality Assessment Scheme for Reference Laboratories in Laboratory Medicine，RELA）比對，或國內(nèi)參考實驗室室間比對結(jié)果達(dá)到國際或國內(nèi)參考實驗室及格標(biāo)準(zhǔn)，且數(shù)量不少于3家。定值方法均采用參考測量程序[10]。要求實驗前必須采用中國計量科學(xué)研究院純品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或其他有證參考物質(zhì)校準(zhǔn)參考測量程序，同時測定質(zhì)控物質(zhì)。實驗分3批（次）進(jìn)行。每批（次）分別依次測定有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)-質(zhì)控物質(zhì)-2個水平候選品，每批（次）每個樣本平行處理3份，每份重復(fù)檢測3次，每個樣本最后得到9個數(shù)據(jù)，3批（次）每個樣本共收集27個數(shù)據(jù)。按照以下標(biāo)準(zhǔn)判定數(shù)據(jù)是否有效：（1）樣本測定結(jié)果應(yīng)在±2s范圍內(nèi)，和s分別是指全部實驗室所有結(jié)果的和s，且室內(nèi)變異系數(shù)（coef ficient of variation，CV）≤5.0%；（2）質(zhì)控物質(zhì)測定結(jié)果應(yīng)在靶值±5.0%范圍內(nèi)，且室內(nèi)CV≤5.0%。不滿足要求的數(shù)據(jù)為無效數(shù)據(jù)，直接剔除，取各實驗室2個水平候選品的有效數(shù)據(jù)的均值，合并計算總均值，作為該樣本的最終靶值。

1.2.5 不確定度分析 以Guide to the Expression of Uncertainty in Measurement（GUM）為基礎(chǔ)，依據(jù)GB/T 15000.3—2008《標(biāo)準(zhǔn)樣品工作原則（3）標(biāo)準(zhǔn)樣品定值的一般原則和統(tǒng)計方法》進(jìn)行。不確定度來源包括均勻性、穩(wěn)定性和定值。候選品的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度（uCRM）的計算公式為：

式中uchar為定值引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度，ubb為均勻性引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度，us為穩(wěn)定性引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度。

1.2.6 互通性評估 依據(jù)文獻(xiàn)[11]，采用參考方法和常規(guī)方法同時對選定的一系列具有代表性的臨床血清樣本（通常不少于20份）和候選品進(jìn)行檢測，采用通過2種方法測定臨床樣本的結(jié)果建立數(shù)學(xué)回歸關(guān)系。以參考方法測定值為X，以常規(guī)方法測定值為Y，用Origin 8.0軟件繪制散點圖。如果候選品常規(guī)方法的測定均值在該區(qū)間內(nèi)，說明該候選品在該常規(guī)方法上無基質(zhì)效應(yīng)，其在參考方法和常規(guī)方法間具有互通性。

2 結(jié)果

2.1 均勻性分析結(jié)果

單因素方差分析結(jié)果顯示，睪酮候選品Ⅰ、Ⅱ的F值分別為1.448 5和1.569 6，均

表1 睪酮侯選品均勻性分析結(jié)果

2.2 穩(wěn)定性分析結(jié)果

對睪酮候選品Ⅰ、Ⅱ進(jìn)行3種溫度下30 d短期穩(wěn)定性評價，候選品Ⅰ、Ⅱ在20～25℃放置30 d均不穩(wěn)定，但在2～8 ℃及-20 ℃均可穩(wěn)定30 d。減少時間點繼續(xù)分析候選品在20～25 ℃的穩(wěn)定期限，結(jié)果顯示：20～25 ℃條件下，候選品Ⅰ可穩(wěn)定5 d，候選品Ⅱ可穩(wěn)定20 d。見表2、表3。

表2 睪酮候選品3種溫度短期穩(wěn)定性分析結(jié)果

表3 睪酮候選品20～25 ℃短期穩(wěn)定性分析結(jié)果

2.3 聯(lián)合定值結(jié)果

有3家實驗室參加了聯(lián)合定值。睪酮候選品Ⅰ、Ⅱ定值結(jié)果的實驗室內(nèi)CV分別不高于3.2%、2.3%，表明各實驗室建立的參考方法穩(wěn)定，數(shù)據(jù)可靠。見表4。

表4 睪酮候選品聯(lián)合定值結(jié)果

2.4 不確定度分析結(jié)果

2.4.1 定值引入的不確定度 定值引入的不確定度計算公式為：

式中s為全部實驗室測值的總s，p為實驗室總數(shù)。候選品I、Ⅱ定值引入的不確定度分別為0.007 5、0.032 2 ng/mL。

2.4.2 均勻性引入的不確定度 均勻性引入的不確定度計算公式為：

式中n為有效單元數(shù)。候選品I、Ⅱ均勻性引入的不確定度分別為0.019 1、0.035 6 ng/mL。

2.4.3 穩(wěn)定性引入的不確定度 穩(wěn)定性引入的不確定度計算公式為：

式中sk為穩(wěn)定性數(shù)據(jù)經(jīng)線性擬合得到方程的斜率（k）的s，x為候選品的有效期。睪酮候選品穩(wěn)定性引入的不確定度結(jié)果見表5。

表5 睪酮候選品穩(wěn)定性引入的不確定度

2.4.4 合成不確定度 候選品Ⅰ、Ⅱ的合成不確定度分別為0.025 1、0.078 1 ng/mL。經(jīng)聯(lián)合定值及不確定度分析，睪酮候選品Ⅰ、Ⅱ的定值結(jié)果分別為（0.22±0.05）ng/mL（k=2）、（3.67±0.16）ng/mL（k=2）。

2.4.5 互通性評估 采用參考方法和2個不同常規(guī)方法同時測定不少于25份新鮮血清樣本，通過新鮮臨床樣本測定結(jié)果得到線性回歸方程，將參考方法測定均值為X軸，計算睪酮候選品的95%可信區(qū)間，結(jié)果顯示，該候選品常規(guī)方法測定值均位于該區(qū)間范圍內(nèi)，侯選品具有良好的互通性。見表6。

表6 睪酮候選品的互通性評價結(jié)果

3 討論

樣本中睪酮的檢測方法包括氣相色譜、液相色譜、氣相色譜-質(zhì)譜、高效液相色譜、高效液相色譜-質(zhì)譜、同位素稀釋法。這些方法的檢出靈敏度很高，線性范圍較寬，但對操作人員、儀器等要求非常高；且耗時長，成本較高，因此并未在臨床上得到廣泛應(yīng)用。

目前，臨床上最常用的是基于抗原抗體反應(yīng)的化學(xué)發(fā)光法和酶聯(lián)免疫法，檢測速度快，且易于操作，已有幾十個品牌的商品化試劑盒。然而，各品牌試劑盒因溯源方法、校準(zhǔn)品基質(zhì)、抗原抗體等原料的選擇等不盡相同，測定值之間存在較大差異。同時，隨著睪酮臨床檢測的廣泛開展，以及我國對于試劑盒產(chǎn)品的溯源性要求越來越嚴(yán)格，市場對于睪酮標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的需求量較大，因此本研究制備了一批血清基質(zhì)睪酮候選品。該候選品以人源血清為基質(zhì)，不添加防腐劑和抗菌藥物，最大限度地保持了臨床樣本的特性。日常保存在-70 ℃條件下，運輸均采用干冰，從而可保證候選品的穩(wěn)定性。該候選品均勻性和穩(wěn)定性評價結(jié)果均為滿意，穩(wěn)定性在一定使用條件下滿足要求，且互通性良好。根據(jù)ISO導(dǎo)則35[12]和國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)規(guī)范，3個實驗室均采用參考方法對侯選品進(jìn)行聯(lián)合定值。測量前對儀器進(jìn)行校準(zhǔn)、驗證和維護(hù)，并且對建立的參考方法進(jìn)行了確認(rèn)，以確保維持檢測能力，從而保證結(jié)果測定的可靠性。

總之，本研究制備的睪酮冰凍人血清侯選品，穩(wěn)定性、均勻性、互通性良好，定值結(jié)果準(zhǔn)確，可以作為國家標(biāo)準(zhǔn)品使用。該血清睪酮標(biāo)準(zhǔn)品將主要用于試劑盒研發(fā)過程的量值溯源、試劑盒產(chǎn)品注冊以及臨床常規(guī)檢測系統(tǒng)的正確度評價等，將促進(jìn)臨床血清睪酮檢測結(jié)果的互認(rèn)以及睪酮檢測試劑盒的監(jiān)管。