不同保存條件及反復(fù)凍融對(duì)血清HCV抗體檢測(cè)的影響

江雅平， 李智慧， 李志艷， 王玎玲

（北京大學(xué)第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100034）

丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）抗體的準(zhǔn)確測(cè)定是診斷丙型肝炎的關(guān)鍵，全面質(zhì)量管理是獲得準(zhǔn)確測(cè)定結(jié)果的重要保證。樣本分析全過程的不當(dāng)處理均會(huì)影響檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性[1]。分析前產(chǎn)生的誤差占整體誤差的60%以上[2]。分析前影響因素包括樣本的采集、前處理、儲(chǔ)存等[3]。樣本儲(chǔ)存時(shí)，血細(xì)胞的各種代謝活動(dòng)均會(huì)直接影響樣本的質(zhì)量[4]。采集的血清樣本應(yīng)及時(shí)檢測(cè)，但在實(shí)際工作中，待測(cè)樣本常在常溫或4 ℃條件下運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室；由于基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)血樣本不是集中采集，血清常置于低溫保存一定時(shí)間后檢測(cè)；科研所用樣本通常凍存于-80 ℃后進(jìn)行批量檢測(cè)，因此不可避免地會(huì)在反復(fù)凍融后檢測(cè)。我們?cè)趯?shí)際工作中發(fā)現(xiàn)，留取的HCV抗體陽性（S/CO值≥1）血清樣本凍存后再次檢測(cè)，HCV抗體水平較之前會(huì)大幅下降。查閱文獻(xiàn)，未能找到不同儲(chǔ)存條件和反復(fù)凍融對(duì)血清HCV抗體檢測(cè)結(jié)果影響的相關(guān)研究。為此，本研究在進(jìn)行嚴(yán)格質(zhì)量控制的前提下，分析HCV抗體的最優(yōu)儲(chǔ)存條件，為分析前的質(zhì)量控制提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 樣本來源

采用分離膠真空采血管采集北京大學(xué)第一醫(yī)院門診及住院患者的靜脈血，2 290×g離心10 min，分離血清，肉眼觀察均無脂血、黃疸和溶血。將當(dāng)天采集、當(dāng)天檢測(cè)的50份血清樣本用于探討不同保存溫度、保存時(shí)長(zhǎng)對(duì)血清樣本HCV抗體測(cè)定結(jié)果的影響。將HCV抗體基線S/CO值<1的15例樣本、S/CO值為1～<2的17例樣本、S/CO值為2～<5的14例樣本、S/CO值≥5的15例樣本用于分析反復(fù)凍融對(duì)HCV抗體檢測(cè)的影響。

1.2 方法

1.2.1 HCV抗體檢測(cè) 所有樣本均采用ARCHITECT i2000SR全自動(dòng)免疫分析系統(tǒng)（美國雅培公司）及配套試劑由同一名工作人員完成檢測(cè)。HCV抗體質(zhì)控檢測(cè)當(dāng)天均在控，保證檢測(cè)數(shù)據(jù)穩(wěn)定、可靠。以S/CO值≥1判定為HCV抗體陽性。

1.2.2 不同保存溫度對(duì)HCV抗體的影響 將收集的50份血清樣本中的每份均分為4份，分裝于2.0 mL螺口凍存管（美國Nunc公司）中，及時(shí)蓋蓋，防止血清樣本蒸發(fā)。分裝后立即將4份樣本分別置于常溫、4 ℃、-20 ℃及-80 ℃條件保存，分別在保存后1、3、5、7 d再次取出檢測(cè)HCV抗體水平。將50份血清樣本當(dāng)天檢測(cè)的HCV抗體結(jié)果作為基線水平。

1.2.3 反復(fù)凍融對(duì)HCV抗體的影響 將收集的61份血清樣本中的每份樣本均分為2份，分裝于2.0 mL螺口凍存管（美國Nunc公司）中，分別置于-20 ℃和-80 ℃凍存，2 h后解凍，并檢測(cè)HCV抗體，測(cè)定完成后立即凍存2 h，反復(fù)凍融4次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。呈非正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)以中位數(shù)（M）[四分位數(shù)（P25～P75）]表示，多組間比較采用相關(guān)變量非參數(shù)Friedman檢驗(yàn)，兩兩比較采用配對(duì)樣本W(wǎng)ilcoxon檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 50份血清樣本不同溫度不同保存時(shí)間HCV抗體水平

以當(dāng)天檢測(cè)的50份血清樣本HCV抗體結(jié)果作為基線水平，S/CO值為0.59～6.12，M（P25～P75）為0.86（0.78～0.94），其中有9份血清樣本HCV抗體陽性（S/CO值為1～<2的6份，≥2的3份。與基線水平比較，常溫和4 ℃保存1、3、5、7 d的HCV抗體水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；-20 ℃和-80 ℃保存1 d的HCV抗體水平顯著降低（P<0.05），且保存時(shí)間越長(zhǎng)，HCV抗體水平下降幅度越大。在保存天數(shù)相同的情況下，-20 ℃和-80 ℃保存的HCV抗體結(jié)果低于常溫和4 ℃保存（P<0.001）。見表1。

表1 不同溫度不同保存時(shí)間血清HCV抗體水平（S/CO）值比較 M（P25～P75）

2.2 不同保存溫度和保存時(shí)間50份血清樣本HCV抗體陽性情況

50份血清樣本中，有9份（18%）HCV抗體陽性，其中S/CO值為1～<2的6份，≥2的3份。常溫和4 ℃保存1、3、5、7 d的HCV抗體陽性率無變化。-20 ℃和-80 ℃保存1 d，6份S/CO值為1～<2的陽性樣本中分別有3份和4份轉(zhuǎn)為陰性；保存3 d，6份S/CO值為1～<2的陽性樣本均轉(zhuǎn)為陰性；S/CO值≥2的3份陽性樣本-20 ℃和-80 ℃保存1、3、5、7 d結(jié)果無變化。見表2。

表2 不同保存溫度、不同保存時(shí)間血清樣本HCV抗體陽性的變化

2.3 反復(fù)凍融對(duì)HCV抗體檢測(cè)的影響

與基線水平比較，61份血清樣本的HCV抗體檢測(cè)結(jié)果隨凍融次數(shù)的增加而逐漸降低（P<0.001）。在凍融次數(shù)相同的情況下，-20 ℃與-80 ℃保存的樣本HCV抗體檢測(cè)結(jié)果之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表3。

表3 反復(fù)凍融后血清樣本HCV抗體檢測(cè)結(jié)果（S/CO）值的變化 M（P25～P75）

2.4 不同凍融次數(shù)對(duì)HCV抗體陽性率的影響

61份血清樣本-20 ℃和-80 ℃凍融2次后分別有8份、9份樣本的HCV抗體結(jié)果由陽性轉(zhuǎn)變?yōu)殛幮?；凍?次分別有9份、10份轉(zhuǎn)變?yōu)殛幮?；凍?次分別有11份、11份轉(zhuǎn)變?yōu)殛幮浴?/p>

2.5 不同S/CO值樣本反復(fù)凍融后HCV抗體S/CO值的變化

對(duì)于基線S/CO值<1的血清樣本，-20 ℃和-80 ℃凍融1次，S/CO值下降均>40%；凍融3次，S/CO值下降均>50%。對(duì)于基線S/CO值為1～<2的血清樣本，-20 ℃和-80 ℃凍融1～4次，S/CO值分別下降36.84%～46.05%和36.91%～46.10%。對(duì)于基線S/CO值為2～<5的血清樣本，-20 ℃和-80 ℃凍融1～4次，S/CO值分別下降30.92%～49.80%和30.90%～49.78%。對(duì)于基線S/CO值≥5的血清樣本，-20 ℃和-80 ℃凍融1次，S/CO值分別下降9.99%和8.94%；凍融4次，S/CO值下降均<20%。見表4。

表4 不同溫度反復(fù)凍融后HCV抗體S/CO值的下降百分比 %

3 討論

HCV抗體是HCV感染篩查的主要指標(biāo)。HCV感染可導(dǎo)致肝臟發(fā)生慢性炎癥和纖維化，部分患者可發(fā)展為肝硬化甚至肝癌。由于部分基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)每天的樣本量有限，難以做到即刻檢驗(yàn)，需將樣本低溫保存后統(tǒng)一檢測(cè)；還有一些實(shí)驗(yàn)室出于日后復(fù)查或科研的考慮，對(duì)一些已完成檢測(cè)的樣本進(jìn)行低溫保存，因此有些檢測(cè)結(jié)果可能會(huì)受保存條件或反復(fù)凍融的影響[5]。

關(guān)于血清樣本反復(fù)凍融對(duì)各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)的影響，國內(nèi)外已有報(bào)道。GUNASEKARA等[6]的研究結(jié)果顯示，血清總膽固醇和三酰甘油反復(fù)凍融10次以上，檢測(cè)值與初始值相比無顯著變化（P>0.05）。CUHADAR等[7]的研究結(jié)果顯示，反復(fù)凍融1～10次對(duì)血清尿素氮、尿酸、總蛋白、白蛋白、乳酸脫氫酶等有顯著影響，對(duì)天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和γ-谷氨酰基轉(zhuǎn)移酶等指標(biāo)無顯著影響。余國慶[8]等的研究結(jié)果顯示，血清胃蛋白酶原Ⅰ水平在-20 ℃凍融2次后顯著降低，胃蛋白酶原Ⅱ水平在凍融3次后顯著下降。HILLEBRAND等[9]的研究結(jié)果顯示，血漿腎素活性在-20 ℃凍融2次后升高，促腎上腺皮質(zhì)激素水平在凍融3次后顯著降低，而總?cè)饧谞钕僭彼幔╰otal triiodothyronine，TT3）、總甲狀腺素（total thyroxine，TT4）、反三碘甲狀腺原氨酸（reverse triiodothyronine，rT3）、游離甲狀腺素（free thyroxine，F(xiàn)T4）、促甲狀腺素（thyroid stimulating hormone，TSH）、甲狀腺球蛋白、胰高血糖素水平在凍融3次后無明顯變化。然而，司學(xué)眾等[10]的研究結(jié)果顯示，與基線水平比較，血清樣本-25 ℃凍融1次，除TSH外，TT3、TT4、游離三碘甲狀腺原氨酸（free triiodothyronine，F(xiàn)T3）和FT4水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；凍融 2次后，TT3、TT4、FT3、FT4和TSH水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。導(dǎo)致研究結(jié)果不一致的原因可能與凍存溫度、檢測(cè)系統(tǒng)[HILLEBRAND等使用的是AutoDelfia時(shí)間分辨熒光免疫分析儀（芬蘭珀金埃爾默公司），司學(xué)眾等使用的是ARCHITECT i2000SR全自動(dòng)免疫分析系統(tǒng)]、檢測(cè)方法等不同有關(guān)。國內(nèi)已有關(guān)于不同儲(chǔ)存條件和時(shí)間對(duì)HCV RNA檢測(cè)結(jié)果影響的報(bào)道[11]，但尚未見對(duì)HCV抗體檢測(cè)影響的報(bào)道。為此，本研究探討了保存條件和反復(fù)凍融對(duì)HCV抗體檢測(cè)結(jié)果的影響。

本研究設(shè)常溫、4 ℃、-20 ℃和-80 ℃ 4種儲(chǔ)存溫度，在相同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)，消除了放置時(shí)間對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，結(jié)果顯示，血清樣本在常溫或4 ℃保存7 d，HCV抗體的S/CO值未發(fā)生顯著變化（P>0.05）；但-20 ℃和-80 ℃保存1 d，HCV抗體水平即顯著下降（P<0.001），凍存時(shí)間越長(zhǎng)，HCV抗體水平下降幅度越大。反復(fù)凍融實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，基線S/CO值越低的樣本反復(fù)凍融后S/CO值的下降百分比越大。對(duì)于基線S/CO值<1的血清樣本，不論是-20 ℃，還是-80 ℃保存，凍融1次后HCV抗體檢測(cè)結(jié)果即顯著下降，下降幅度>40%；凍融3次后HCV抗體檢測(cè)結(jié)果下降>50%。對(duì)于基線S/CO值為1～<2的血清樣本，-20 ℃和-80 ℃凍融1～4次，S/CO值分別下降36.84%～46.05%和36.91%～46.10%。凍融次數(shù)越多，HCV抗體檢測(cè)結(jié)果下降幅度越大。因此，對(duì)于S/CO值為1～<2的血清樣本，冷凍保存后極易使HCV抗體由陽性轉(zhuǎn)變?yōu)殛幮?，?dǎo)致漏診。這可能是由于反復(fù)凍融導(dǎo)致血清樣本中生物分子降解、活性發(fā)生改變或產(chǎn)生不溶性沉淀物，進(jìn)而導(dǎo)致血清HCV抗體檢測(cè)結(jié)果下降。

綜上所述，HCV抗體檢測(cè)應(yīng)盡量在采血當(dāng)天完成，如果無法當(dāng)天完成，短期宜4 ℃保存，不宜冷凍保存，也不宜凍融。如果需要復(fù)測(cè)，應(yīng)在4 ℃保存7 d內(nèi)完成復(fù)測(cè)。冷凍保存會(huì)對(duì)HCV抗體檢測(cè)產(chǎn)生較大影響，使HCV的檢出率下降，進(jìn)而影響對(duì)患者病情的判斷。