基于網(wǎng)絡藥理學研究雷公藤抗肝癌的分子機制及初步驗證

劉 澍 盧建東 呂祎彤 喻長遠* 熊國良*

(1.深圳市中醫(yī)院， 深圳 518005； 2.北京化工大學 生命科學與技術學院, 北京 100029)

引 言

肝癌是最常見的肝臟惡性腫瘤，致其發(fā)生的主要因素包括慢性病毒性肝炎、肝硬化、脂肪性肝病等[1]。近年來，肝癌的發(fā)病率和死亡率逐年上升，已經(jīng)成為威脅人類健康和妨礙社會發(fā)展的主要疾病之一，因此肝癌的預防與治療成為人們研究的熱點。對于肝癌的有效治療方案主要包括手術、化療等手段，索拉非尼和瑞格拉非尼是美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準的治療肝癌晚期的藥物，盡管這類化學藥物提高了癌癥的治愈率，但它們具有較大的毒副作用及耐藥性[2]。因此，探索與開發(fā)新的肝癌治療藥物是很有必要的。

癌癥的早期發(fā)生和發(fā)展與多數(shù)的炎癥反應密切相關，細胞的凋亡代謝又受自身免疫性疾病等多種疾病的影響。中藥具有多靶點、不易產(chǎn)生耐藥性等特點，可通過多途徑抑制肝癌細胞的生長、增殖，因此日益受到人們的關注。雷公藤(TripterygiumwilfordiiHook F.)作為一種傳統(tǒng)中藥，用于治療免疫系統(tǒng)疾病及炎性疾病已有數(shù)百年的歷史。研究表明，雷公藤可用于胃癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌等多種癌癥的治療[3]，雷公藤的提取物(如雷公藤甲素和雷公藤紅素)可通過促進肝癌細胞的凋亡和誘導分化而發(fā)揮抗肝癌療效[4]。

在雷公藤有效成分的抗癌機制研究中，Sun等[5]發(fā)現(xiàn)雷公藤甲素可以激活抑癌基因P53，誘導肝癌細胞凋亡。Li等[6]發(fā)現(xiàn)雷公藤紅素可以通過激活線粒體凋亡途徑，誘導肝癌Bel-7402細胞的凋亡。張乙川等[7]發(fā)現(xiàn)雷公藤紅素通過激活caspase-3及抑制NF-κB通路來誘導人肝癌SMMC-7721細胞的凋亡。目前，對雷公藤抗肝癌機制的研究大多局限于單一成分的分析，尚未全面系統(tǒng)地闡述雷公藤的藥效機制和作用靶點。本文運用網(wǎng)絡分析方法，借助中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP)并結合多個疾病數(shù)據(jù)庫，分析現(xiàn)有的相關信息資料(包括藥物、疾病、基因組、蛋白組等相關數(shù)據(jù)庫)，多層次地建立“藥物-靶點”網(wǎng)絡以及蛋白互作網(wǎng)絡(PPI)，利用計算機解析軟件全面展示藥物與靶點、靶點與疾病之間的關系，從網(wǎng)絡層面研究雷公藤對肝癌的干預和影響，揭示雷公藤治療肝癌的分子作用機制，為肝癌的進一步治療研究提供有力的理論依據(jù)。

1 網(wǎng)絡分析

1.1 雷公藤藥效成分數(shù)據(jù)庫的構建

從TCMSP平臺(http://www.tcmspw.com/tcmsp.php)中獲取雷公藤的活性成分藥理信息[8]，以藥代動力學(ADME)參數(shù)中的口服生物利用度(OB)≥30%和藥物相似性(DL)≥0.18作為篩選條件，確定雷公藤在人體內(nèi)生物活性較高的關鍵成分。同時結合文獻收集雷公藤的藥效成分信息，對其進行補充。

利用PubChem化學結構數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nl-m.nih.gov/)確認上述所得化合物的分子結構，將這些化合物轉化為標準的Canonical SMILES格式，以 sdf格式儲存。

1.2 雷公藤關鍵成分抗癌差異靶點的篩選

在TCMSP平臺的Targets Information中搜集獲取已確定藥物成分的靶點蛋白。使用Swiss Target Prediction平臺進行化合物靶點預測，補充上述藥物的靶點信息，屬性設置為“homo sapiens”，其余參數(shù)設置均為默認。

利用GeneCards、OMIM、Drugbank等數(shù)據(jù)庫以“l(fā)iver cancer”、“hepatocellular carcinoma”為關鍵詞檢索，收集人類肝癌的疾病基因。從GEO數(shù)據(jù)庫中挑選數(shù)據(jù)集GSE33006，以此為肝細胞癌(HCC)組織樣本和相鄰的正常肝組織的基因表達特征數(shù)據(jù)，以GEO2R工具對此樣本進行差異性表達分析，使用Rstudio 3.6.2軟件以|log2FC|>1(FC為倍數(shù)變化)及P<0.05為篩選條件作火山圖，獲得肝癌差異基因。

1.3 基因標準化和比對

通過Uniprot數(shù)據(jù)庫(http://www.Uniprot.org/)下載“homo sapiens”的所有基因數(shù)據(jù)，整理所得靶點蛋白和基因信息并對其進行標準化校正。將TCMSP中的靶點蛋白信息與Swiss Target Prediction的預測結果和主要成分信息進行去重校對，剔除無靶點的活性成分，完善雷公藤的藥效成分數(shù)據(jù)庫。將雷公藤藥物靶點與挖掘到的肝癌相關基因進行映射篩選，確定雷公藤中關鍵成分的抗癌作用靶點。

1.4 藥效成分- 靶點(C- T)網(wǎng)絡構建

通過Cytoscape 3.7.2軟件建立雷公藤藥效成分-肝癌靶點網(wǎng)絡，并使用network analyzer插件對該網(wǎng)絡進行拓撲學特征分析。網(wǎng)絡中的節(jié)點代表成分、靶點，節(jié)點的度值(degree value)越大，靶點的生物學重要性的權重越大，說明該節(jié)點越重要，越有可能是雷公藤作用的關鍵靶點，因此我們對度值較大的活性成分重點關注。

1.5 蛋白互作網(wǎng)絡構建

為了更好地分析雷公藤抗肝癌靶點間的相互作用，將雷公藤抗癌靶點導入STRING數(shù)據(jù)庫，利用Multiple proteins模塊工具進行蛋白質-蛋白質相互作用分析，參數(shù)“organism” 設置為“homo sapiens”， 參數(shù)“minimum required interaction score”設置為“medium confidence(0.400)”，參數(shù)“network display options”設置為“hide disconnected nodes in the network”，其余參數(shù)設置均為系統(tǒng)默認。以此建立蛋白互作網(wǎng)絡，并將結果存為TSV格式文件。導入Cytoscape 3.7.2軟件，去除游離蛋白，進行可視化拓撲分析。

1.6 生物過程和代謝通路富集分析

為了進一步了解核心靶點的功能及在信號通路中的作用，將篩選的抗癌靶點導入DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)，將所有靶基因ID類型校正為官方名稱，輸入靶基因名稱列表，限定物種為“homo sapiens”，設定人類全基因組為背景參照，經(jīng)DAVID數(shù)據(jù)庫的檢索和轉化操作，獲得gene ontology(GO)生物學過程富集分析和Kyoto encyclopedia of genes and genomes(KEGG)信號通路富集分析，然后使用Rstudio 3.6.2軟件包對結果進行可視化加工。

1.7 分子對接模擬驗證

選取重要的藥效成分和關鍵靶點進行分子對接驗證。通過PDB數(shù)據(jù)庫搜索蛋白靶點來選擇最佳的晶體結構，導入Pymol軟件進行去水、除雜，保存為pdb格式文件。使用AutoDock 4.2軟件進行對接，使用藥物配體與蛋白受體的pdbqt格式文件，進行加氫，計算電荷，設置原子類型[9]。選定受體結構確定中心進行畫盒，設置構象搜索方法等對接參數(shù)進行分子對接計算。

蛋白結構根據(jù)以下條件進行篩選[10-11]：1)物種選擇“homo sapiens”；2)試驗方法中選擇通過X晶體衍射法獲取的蛋白結構；3)蛋白的晶體分辨率選擇2.0～3.0 ?，因為使用分辨率過低的晶體結構可能使對接結果不理想；4)優(yōu)先選擇已有文獻報道的蛋白結構。

2 實驗驗證

2.1 實驗材料

肝癌HepG2細胞，康源博創(chuàng)生物科技(北京)有限公司；雷公藤甲素(純度≥98%)、雷公藤紅素(純度≥98%)，上海源葉生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液(PBS)、胰酶，SolarBio公司；RIPA裂解液，Thermo Scientific公司；凝膠快速制備試劑盒、STAT3、PTGS2抗體，CST公司；內(nèi)參GAPDH、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG二抗，Beyotime公司。

2.2 細胞培養(yǎng)

使用DMEM培養(yǎng)基，將HepG2細胞置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱(311型，Thermo Fisher公司)中貼壁培養(yǎng)，待細胞鋪滿培養(yǎng)皿底部80%左右，使用PBS洗滌，用0.25%胰酶消化傳代。

2.3 Western Blot測定蛋白表達

取對數(shù)生長期的HepG2細胞，分于6孔板中，將0.5、1、1.5 μmol/L的雷公藤甲素或雷公藤紅素處理的細胞孔設為實驗組，未添加藥物處理的細胞孔設為對照組，置于培養(yǎng)箱中孵育24 h，PBS清洗，收取細胞。使用RIPA裂解液裂解細胞，收集總蛋白。使用蛋白核酸電泳儀(EPS 600型，上海天能科技有限公司)，以每孔100 μL的上樣量進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，于120 V恒壓1.5 h，將蛋白轉移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，于350 mA恒流1.5 h，用8%脫脂奶粉孵育內(nèi)參GAPDH和一抗(PTGS2、STAT3)，4 ℃過夜。次日清洗膜，與辣根過氧化物酶標記的二抗孵育1 h，再次洗滌后，置于化學發(fā)光成像儀(ChemiScope-6000-Rro型，上海勤翔科學儀器有限公司)下觀察并拍照。

3 結果與討論

3.1 雷公藤藥效成分的篩選結果

從TCMSP平臺中篩選得到144種雷公藤有效成分，根據(jù)ADME參數(shù)對其進行評估、刪選，最終篩選出51種，另外根據(jù)Targets Information結果刪掉無蛋白靶點的成分。檢索雷公藤成分的相關文獻進行補充、排除，同時考慮到雷公藤紅素是雷公藤抗炎和抑制免疫的非常重要的有效成分，故本文將其也納入雷公藤的有效成分化合物庫中，最終確定了雷公藤的31個藥效成分，如表1所示。

表1 篩選出的雷公藤藥效成分Table 1 Screened effective ingredients of Tripterygium wilfordii

3.2 雷公藤主要成分抗癌靶點的篩選結果

根據(jù)Swiss Target Prediction平臺預測藥物靶點，篩選得到68個Probability>0.5的靶點，與TCMSP平臺的164個基因蛋白互補，確定208個藥物靶點蛋白。對照UniProt數(shù)據(jù)庫將其靶蛋白標準化，并與GeneCards、OMIM、Drugbank數(shù)據(jù)庫所得的人類肝癌相關基因通過Venn圖進行比對剔除，結果如圖1所示，其中藍色與其他顏色的交集部分即為篩選確定的80種雷公藤抗肝癌靶點。

對GSE33006肝癌樣本數(shù)據(jù)集的差異基因作火山圖，如圖2所示。取|log2FC|>1、P<0.05的結果，與上一步數(shù)據(jù)結果進行交集映射，得到具有上下調屬性的抗癌基因31個。

3.3 C- T網(wǎng)絡構建分析

根據(jù)3.2節(jié)的數(shù)據(jù)篩選結果，我們創(chuàng)建了雷公藤的藥效成分與對應靶點的網(wǎng)絡映射，如圖3所示。該復合網(wǎng)絡包含55個節(jié)點和393條邊，節(jié)點包含31個雷公藤抗肝癌靶點和24個化合物，邊表示它們彼此之間的聯(lián)系。按度值由大到小篩選，確定核心成分為山奈酚、雷公藤甲素、β-谷甾醇、雷公藤紅素。從對應靶標基因的數(shù)量來看，這幾種成分可能是治療肝癌的重要化合物。另外，從蛋白靶點的角度來看，我們選擇度值大于2倍中位數(shù)的結果，其分別是PTGS2、ESR1、AR、NOS3、JUN、PRKACA、TGFB1。在網(wǎng)絡的拓撲分析結果中，我們認為上述靶點占據(jù)相當重要的位置。

3.4 PPI分析

圖4(a)為蛋白靶點相互作用網(wǎng)絡圖，將圖4(a)導入Cytoscape 3.7.2統(tǒng)計軟件進行拓撲學分析并進行可視化處理，結果如圖4(b)所示。根據(jù)Network Analyzer插件對網(wǎng)絡的拓撲學分析發(fā)現(xiàn)，結果中共獲得31個節(jié)點和176條邊，平均節(jié)點度值為11.4，聚類相關性系數(shù)(clustering coefficient)為0.689，相鄰節(jié)點的平均數(shù)目為11.733，說明基因彼此之間存在相互作用，它們協(xié)同起效，關系十分密切，驗證了雷公藤中的藥效化合物與肝癌疾病兩者的重疊基因具有密切的關聯(lián)性。我們以度值大于2倍平均度值為標準篩選核心靶標蛋白，可以看出JUN、STAT3、PTGS2、ESR1、FOS、CXCL8、ICAM1、CDKN1A、AR、TGFB1在其中的作用程度較大，因此，我們認為有必要進一步探討此類基因的分子功能和通路富集情況。

藍色表示已確定的藥物蛋白靶點，黃色、綠色、粉色分別表示GeneCards、OMIM、Drugbank數(shù)據(jù)庫中的肝癌靶點，數(shù)字表示交集數(shù)據(jù)庫所共有的蛋白靶點數(shù)量。圖1 雷公藤的抗癌靶點Fig.1 Anti-cancer targets of Tripterygium wilfordii

圖2 GSE33006樣本的火山圖Fig.2 Volcano plot for sample GSE33006

紅色菱形表示藥效成分；綠色圓形表示蛋白靶點，其大小代表重要程度。圖3 雷公藤(TWHF)藥效成分與肝癌靶點的C-T網(wǎng)絡映射Fig.3 C-T network mapping of the active ingredients of Tripterygium wilfordii (TWHF) and liver cancer targets

圖4 蛋白互作網(wǎng)絡分析Fig.4 Protein interaction network analysis

3.5 代謝通路富集結果分析

進一步對靶點在生物功能中的富集關系進行分析，以獲得靶點在生物集群中的協(xié)同作用。我們對靶點進行了GO富集分類和分子注釋，同時也獲得Pathway分析，將P<0.05的結果由小到大排序，取排名前20位的結果，如圖5所示，其中，氣泡大小代表基因數(shù)目的多少，氣泡顏色由紅色至綠色表示P值由小到大。從富集結果可以看出，靶點基因主要富集在催化酶結合、血紅素結合、轉錄激活因子結合、配體激活的序列特異性DNA結合、轉錄調控區(qū)DNA結合、細胞周期蛋白結合、氧化還原酶活性、蛋白質異二聚活性等分子功能上，這些基因主要參與細胞增殖的正負調控、有絲分裂細胞周期的陽性調控、血管生成的負調控、細胞的氧化應激以及基因表達的負調控等生物過程，體現(xiàn)出雷公藤是通過多種分子功能調控生物過程而共同實現(xiàn)抗肝癌效果的。圖6列出了排名前20位的信號通路，包括HIF-1、TNF以及調控細胞周期、乙型肝炎等信號通路，說明雷公藤通過靶向基因對多條通路產(chǎn)生影響而發(fā)揮抗肝癌作用。

圖5 GO富集分析氣泡圖Fig.5 Bubble diagram of GO enrichment analysis

圖6 KEGG富集通路分析氣泡圖Fig.6 Bubble diagram of KEGG enrichment pathway analysis

肝癌的發(fā)生、發(fā)展過程是一個受多基因、多途徑調控的過程，癌細胞的增殖失控和凋亡機制失活，是導致肝癌發(fā)展的主要因素[12]。因此，抑制肝癌細胞生長并誘導細胞凋亡是肝癌治療的主要目標之一。另外也有研究表明，乙型肝炎病毒是肝癌的主要危險因素[13]。這些研究結果與我們的數(shù)據(jù)分析結果不謀而合，表明本文的工作具有研究價值和借鑒意義。

3.6 分子對接驗證分析

綜合上述C-T網(wǎng)絡和PPI網(wǎng)絡中篩選出的靶點集合，選取其中富集排名在前5位的KEGG信號通路上的蛋白，確定了PTGS2、TGFB1、CXCL8、STAT3、CDKN1A、FOS、JUN這7種蛋白為核心靶點。

有研究表明，山奈酚、β-谷甾醇和槲皮素在不同的藥物篩選中經(jīng)常作為活性成分出現(xiàn)[14]，因此我們認為它們在本文中沒有較大的研究意義。本文最終確定對雷公藤中的特有成分雷公藤甲素和雷公藤紅素這兩種關鍵藥效物質與核心抗癌靶點進行對接驗證。

通常，結合能<-17.78 kJ/mol可認為配體與受體之間具有結合活性，結合能<-20.92 kJ/mol則認為結合活性較高，結合能<-29.29 kJ/mol可認為配體與受體之間具有強烈的對接活性[15]。對接結果如表2所示，由表2可知，雷公藤甲素、雷公藤紅素與所選核心靶點的結合能均小于-17.78 kJ/mol，表明它們與靶點具有結合活性。雷公藤甲素與PTGS2以及雷公藤紅素與PTGS2、CXCL8、STAT3的結合能均小于-29.29 kJ/mol，表明它們之間有著很強的結合活性。對其進行對接模式分析，如圖7所示。由結果可知，雷公藤甲素與PTGS2在CYS-36、CYS-47和ARG-44處形成氫鍵。雷公藤紅素與PTGS2在LYS-532、GLN-372、LYS-369和SER-121處形成氫鍵，與CXCL8在LYS-11和ARG-26處形成氫鍵，與STAT3在PRO-333和ARG-325處形成氫鍵。

圖7 雷公藤甲素、雷公藤紅素與核心抗癌靶點的對接模式分析Fig.7 Analysis of the docking mode of triptolide and celastrol with core anti-cancer targets

表2 雷公藤甲素、雷公藤紅素與核心靶點的結合能Table 2 Binding energies of triptolide and celastrol tothe core targets

3.7 雷公藤對蛋白表達的影響

由于高濃度的雷公藤甲素和雷公藤紅素表現(xiàn)出細胞毒性且伴隨毒副作用，所以本文選擇相對低的藥物濃度梯度(0.5、1、1.5 μmol/L)，以探究對癌細胞增殖的影響。Western Blot原始條帶結果見圖8，可以看出，隨著雷公藤甲素和雷公藤紅素濃度的升高，STAT3和PTGS2蛋白的表達量減少，說明雷公藤甲素和雷公藤紅素可以抑制STAT3和PTGS2蛋白的表達，并且抑制作用具有劑量依賴性。

圖8 雷公藤甲素和雷公藤紅素對蛋白表達的影響Fig.8 Effect of triptolide and celastrol on the expression of various proteins

前列腺素(PG)是由炎癥誘導的氧化應激關鍵酶PTGS2催化合成的重要炎癥介質，具有抑制細胞凋亡、促進細胞增殖、抑制免疫監(jiān)視、促進血管生成等作用，體內(nèi)外研究均表明PTGS2的特異性抑制劑可以抑制肝癌[16]。STAT3是JAK2/STAT3信號通路的關鍵調控基因，其在信號通路中的表達與肝細胞癌的發(fā)生關系密切[17]。單獨或協(xié)同其他化療藥物使用的雷公藤紅素可促進肝癌細胞的凋亡，防止癌細胞的擴散和侵襲，通過STAT3信號通路[18]，抑制下游基因如cyclin D1、Bcl-2、Bcl-xL、survivin、Mcl-1、VEGF等，調節(jié)腫瘤細胞的增殖、凋亡，從而抑制血管生成并促使細胞凋亡。

4 結論

本文采用網(wǎng)絡藥理學方法并結合分子對接模擬，對雷公藤抗肝癌的藥效物質及其生物學機制進行探討。通過對雷公藤成分中的多種化合物數(shù)據(jù)進行篩選和富集分析，篩選出雷公藤甲素和雷公藤紅素為雷公藤抗肝癌的關鍵藥效成分。通過對靶點的功能富集以及配體與受體之間的結合能分析，得出雷公藤作用于肝癌的核心靶點蛋白為STAT3、PTGS2、CXCL8。分子對接的結果顯示，雷公藤甲素與PTGS2以及雷公藤紅素與PTGS2、CXCL8、STAT3有著很強的結合活性。生物學實驗結果表明，雷公藤甲素和雷公藤紅素均可以抑制PTGS2和STAT3蛋白的表達。以上結果表明，雷公藤可能作用于這些靶點，通過調控細胞的增殖和凋亡，發(fā)揮抗炎癥、調節(jié)免疫的作用，從而抑制肝癌的惡化。

本研究僅是依靠數(shù)據(jù)庫進行的理論分析和初步的實驗驗證，故存在一定的局限性，后續(xù)還需其他實驗(動物實驗和臨床試驗)進一步驗證才具有更為科學可靠的說服力。但是，從整體的分析層面上講，本研究為雷公藤抗肝癌的作用機制及相關藥物的開發(fā)提供了新思路。