基于磁珠捕獲和連接的免核酸提取的恒溫擴增技術(shù)

邱櫟臻，楊明珠，駢紅茹，鄭 直

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院 生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，北京 100005)

核酸檢測在疾病篩查、用藥指導(dǎo)、預(yù)后判斷和監(jiān)測等方面扮演重要角色，在新型冠狀病毒病(corona virus disease,COVID-19)的防控、篩查、治療過程中體現(xiàn)得淋漓盡致[1-2]。其中聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)一直是實驗室進行分子診斷和病原學(xué)檢測的金標(biāo)準(zhǔn)[3]，PCR方法以其高靈敏度和高特異性這一特點被廣泛使用，然而這種方法需要高昂的成本，需要基于實驗室的設(shè)備和專業(yè)知識，應(yīng)用到現(xiàn)場檢測需要克服許多不利因素，因此研究人員逐漸將目光轉(zhuǎn)向利用單一溫度進行擴增的技術(shù)[4-5]。

環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)是21世紀(jì)發(fā)展起來的一種新穎的等溫核酸擴增技術(shù)，與普通PCR比起來不需要溫度控制精確的模塊體系，恒溫完成擴增，具有高靈敏度，高特異性和快速擴增的優(yōu)點[6-8]。現(xiàn)在發(fā)展成不依賴昂貴的PCR儀就能實現(xiàn)現(xiàn)場高通量快速檢測的一種方法，檢測成本遠(yuǎn)低于熒光定量PCR,可作為快速簡便的診斷方法來檢測和識別病原微生物感染[9]。本研究擬建立一種基于磁珠捕獲的免提核酸環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增技術(shù)CLIP-LAMP (capture and ligation probe-LAMP)，能夠快速、簡便地進行大體積病原體檢測。

1 材料與方法

1.1 材料

主要試劑：1 μmol/L鏈霉親和素磁珠(Invitrogen公司)； T4 多聚核苷酸激酶、BstDNA 聚合酶大片段和1× ThermoPol 反應(yīng)緩沖液(New England Biolabs， NEB 公司)；裂解液、洗液(Diacutate 公司)；T4 DNA 連接酶(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司);甜菜堿(Sigma-Aldrich公司)； dNTPS [寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司]； SYBR Green Ⅰ(廈門致善生物科技股份有限公司)； BSA(Cell Signaling Technology公司)。

1.2 方法

1.2.1 免疫缺陷病(human immunodeficiency virus，HIV)檢測模板體外轉(zhuǎn)錄(invitrotranscription,IVT)制備：查閱文獻資料，登錄pubmed下載主要在中國流行的 HIV-1型的 CRF07-BC、 CRF08-BC和 CRF01-AE 亞型，找到gag和pol基因，選取3種亞型共有的保守序列導(dǎo)入 pcDNA3.1(+) 質(zhì)粒載體中，搖菌擴大培養(yǎng)，提質(zhì)粒酶切為線性，然后反轉(zhuǎn)錄為 RNA 進一步純化，最后測濃度定量， IVT從 1.0×105CPs(copies)/μL梯度稀釋到1.28 CPs /μL，呈5倍稀釋作為 HIV 檢測模板進行后續(xù)試驗。

1.2.2 磁珠偶聯(lián)寡核苷酸制備：文獻中提到磁珠通過修飾鏈霉親和素可與被生物素標(biāo)記的寡核苷酸連接，從而起到捕獲靶標(biāo)的效果[10-11]，且磁珠自身有富集大體積樣品的優(yōu)勢。選取粒徑大小1 μm 的鏈霉親和素磁珠，與被biotin修飾的寡核苷酸探針結(jié)合。取1 mg(1 μmol/L)磁珠到1.5 mL 離心管中，去上清并用2×結(jié)合緩沖洗1遍，加200 μL緩沖液重懸，加入20 μL 100 μmol/L 探針和180 μL 水室溫振蕩30 min，隨后1×結(jié)合緩沖洗3遍，用1 mL 水重懸即可使用。

1.2.3 捕獲探針設(shè)計和檢測：以上面保守序列為模板，根據(jù)特定設(shè)置條件挑選捕獲和檢測探針，檢測探針設(shè)計成帶有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的序列，所有探針和引物均從生工公司訂購。

1.2.4 基于磁珠 CLIP-LAMP 實驗方法：此實驗中分為捕獲靶標(biāo)、連接探針、熒光檢測定量3步進行。在1.5 mL 離心管中加入捕獲體系300 μL，1 μmol/L偶聯(lián)寡核苷酸磁珠30 μL，探針終濃度100 nmol/L，在特定的鹽離子濃度下，磁珠連接捕獲探針特異性捕獲靶標(biāo)；置于金屬振蕩儀器中55 ℃，12 000 r/min，1 h 進行捕獲反應(yīng)。捕獲結(jié)束將離心管放置到磁力架上，通過磁場吸附磁珠去除廢液，加入1×washing buffer后用渦旋儀振蕩混勻；再放到磁力架去除洗液，重復(fù)兩次，加入連接體系50 μL (含有2 μL 的5×106U/L的 T4 DNA 連接酶，10 μL 的5×ligation buffer)，渦旋儀混勻放入金屬振蕩儀器中37 ℃，300 r/min，10 min即可完成連接反應(yīng)。將離心管拿出置于磁力架上，去除連接體系，加入25 μL最終恒溫擴增LAMP體系(含有甜菜堿，前端引物FIP，后端引物BIP，dNTP，BstDNA 聚合酶大片段， SYBR Green Ⅰ，由20 mmol/L Tris-HCl、10 mmol/L KCl、10 mmol/L(NH4)2SO4、 2 mmol/L MgSO4和0.1% Triton X-100, pH 8.8組成的1×ThermoPol buffer),混勻后轉(zhuǎn)入96孔板中置于熒光定量PCR儀中進行LAMP擴增，恒溫65 ℃擴增45 min，每分鐘采集1次熒光信號記錄熒光信號變化。整個過程如圖1所示。

SA.streptavidin; FIP,BIP.LAMP primer; MNPs.magnetic beads; A.hybridization between streptavidin-coated magnetic beads and biotin-labeled DNA molecules; B.CLIP-LAMP schematic diagram

2 結(jié)果

2.1 實驗優(yōu)化結(jié)果

2.1.1 BSA (bovine serum albumin) 對LAMP 反應(yīng)階段的影響： BSA 加入最后 LAMP 反應(yīng)可以對磁珠狀態(tài)的穩(wěn)定起到一定作用，比較 10、7、4 和1 mg/mL的 BSA 溶液，通過實驗得出1 mg/mL的 BSA 使得反應(yīng)速度加快，效果最好(表1，圖2)。

表1 不同濃度BSA 的檢測結(jié)果

CPs.copies; Cq.quantification cycle;*P<0.05 compared with NTC group; NTC.no template control圖2 CLIP-LAMP反應(yīng)中BSA的優(yōu)化Fig 2 Optimization of BSA in CLIP-LAMP reaction

2.1.2 磁珠捕獲體積遞增實驗：選取2×104和4×103CPs/μL兩種IVT 樣品進行實驗，捕獲體積分別為100 μL、200 μL、500 μL和1 mL，捕獲體積越大，此方法的靈敏度越低(表2，圖3)。

表2 不同捕獲體積檢測結(jié)果

CPs.copies; Cq.quantification cycle圖3 磁珠捕獲體積遞增試驗Fig 3 Capture volume of magnetic beads increasing

2.2 基于磁珠CLIP-LAMP檢測HIV的IVT靈敏度分析

將HIV的IVT從1×105CPs/μL至32 CPs/μL依次進行5倍梯度稀釋，以IVT濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，測得的Cq值(擴增達到熒光閾值時所經(jīng)歷的時間)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，線性關(guān)系良好，R2=0.94，可以穩(wěn)定測到32 CPs/μL的IVT(圖4)。

2.3 基于磁珠CLIP-LAMP檢測HIV的IVT特異性分析

基于磁珠CLIP-LAMP 檢測 HIV 的 IVT 的特異性評估如5圖所示， positive control選擇的是4×103CPs/μL的 IVT 樣本， negtive control 選擇的是健康的人血樣本，NTC(no template control)是未加模板的對照。圖中可以看出，此方法只在 IVT 樣品中準(zhǔn)確檢測出信號，在健康人血中和NTC中未檢測出信號，特異性良好。

2.4 基于磁珠CLIP-LAMP檢測HIV的IVT的重復(fù)性分析

IVT濃度從1×105CPs/μL到32 CPs/μL的變化中，Cq值的變異系數(shù)(coefficient of variation，CV)均小于5%，表明數(shù)據(jù)真實有效(表3)。

表3 磁珠CLIP-LAMP的重復(fù)性

3 討論

本研究基于磁珠捕獲免核酸提取環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增的方法成功建立，通過免提核酸使用磁珠富集靶標(biāo)核苷酸可以輕松處理大體積樣本，免提核酸避免了繁瑣的核酸提取步驟以及提取過程中的損失，普通96孔板可裂解處理樣品50 μL，而磁珠可以在1.5 mL的離心管中裂解富集1 mL的樣品，因而大體積富集有能力達到較低的靈敏度，本研究的靈敏度還可以通過改變磁珠偶聯(lián)核酸方式得到提升，后續(xù)優(yōu)化有潛力達到更低的靈敏度。LAMP檢測對設(shè)備沒有特殊要求，不需要昂貴的PCR儀器，僅需要簡單的恒溫擴增儀器恒溫保持30～60 min即可,這一優(yōu)勢決定其對各種應(yīng)用場景接納度高，受限小。

本研究方法與普通LAMP方法比較具有更強的特異性，常規(guī)LAMP引物只能針對一個位點進行設(shè)計擴增，本方法的CLIP-LAMP可以針對一段較長的靶標(biāo)檢測區(qū)域設(shè)計多對檢測探針同時進行擴增反應(yīng)，檢測探針覆蓋域更長，所以檢測較常規(guī)LAMP更加靈敏。其次一對檢測探針中間的連接步驟也進一步增強了檢測的特異性，彌補了常規(guī)LAMP容易出現(xiàn)的假陽性問題。檢測探針的莖環(huán)結(jié)構(gòu)尾巴是通用的，可以僅替換檢測靶標(biāo)序列達到檢測不同病原體的效果。

CPs.copies; Cq.quantification cycle圖4 磁珠CLIP-LAMP檢測HIV的IVT的實時熒光曲線和線性關(guān)系Fig 4 HIV detection sensitivity and dynamic range of CLIP-LAMP on magnetic beads n=3)

圖5 磁珠CLIP-LAMP檢測HIV體外轉(zhuǎn)錄(IVT)的特異性Fig 5 HIV detection specificity of CLIP-LAMP for in vitro transcription(IVT) magnetic beads

國內(nèi)艾滋病形勢較為嚴(yán)峻，目前有效消除艾滋病最重要的環(huán)節(jié)就是控制艾滋病的傳播，大規(guī)模進行重點人群艾滋病的檢測并且盡早地發(fā)現(xiàn)感染者是重中之重，本研究建立的基于磁珠CLIP-LAMP方法可以穩(wěn)定檢測到32 CPs/μL的HIV IVT濃度，并在將來通過進一步優(yōu)化達到更低的濃度。綜上所述，本研究成功建立起基于磁珠免核酸提取恒溫擴增技術(shù)，為HIV檢測帶來新的思路和方法。