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    絨毛白蠟FvSAP1基因的克隆與分析及表達(dá)載體的構(gòu)建

    2021-11-12 02:05:32臧真榮燕麗萍王因花吳德軍
    山東林業(yè)科技 2021年5期
    關(guān)鍵詞:鋅指白蠟絨毛

    李 麗,臧真榮,燕麗萍,王因花,吳德軍

    (山東省林業(yè)科學(xué)研究院山東省林木遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東濟(jì)南250014)

    自然環(huán)境中非生物脅迫比如鹽堿、干旱、低溫等會(huì)影響植物的正常生長(zhǎng),植物往往通過(guò)抗逆相關(guān)基因的表達(dá)并經(jīng)過(guò)體內(nèi)一系列復(fù)雜的生理生化反應(yīng)來(lái)抵御和適應(yīng)外界環(huán)境的變化[1-2],因此抗逆基因的表達(dá)是植物抵御外界不利因素、增強(qiáng)自身適應(yīng)性的關(guān)鍵所在。許多研究證實(shí)植物抗逆基因的表達(dá)受某些鋅指蛋白調(diào)控,且鋅指蛋白發(fā)揮著重要作用[3]。因此可通過(guò)構(gòu)建逆境相關(guān)鋅指蛋白基因的植物表達(dá)載體,將基因轉(zhuǎn)入植物體內(nèi),使其蛋白產(chǎn)物在逆境脅迫下過(guò)表達(dá)從而達(dá)到從分子水平提高植物抗逆性的目的。鋅指蛋白序列中的組氨酸(His)與半胱氨酸(Cys)能和鋅離子結(jié)合形成鋅指結(jié)構(gòu),鋅指結(jié)構(gòu)與DNA 雙鏈大溝或蛋白結(jié)合后參與基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。TFIIIA 是首次發(fā)現(xiàn)的具有此功能的鋅指蛋白[4],隨后人們發(fā)現(xiàn)各種動(dòng)植物或其他物種體內(nèi)存在鋅指蛋白。根據(jù)蛋白中半胱氨酸(Cys)和組氨酸(His)的排列順序,鋅指蛋白被分成C2H2、C8、C6、C3HC4(RING 型)、C2HC 等類型[5]。本研究所克隆的鋅指蛋白屬于A20/AN1 型鋅指蛋白,該蛋白具有A20或(和)AN1 型鋅指結(jié)構(gòu)。A20 鋅指由一個(gè)或多個(gè)串聯(lián)C2C2 鋅指結(jié)構(gòu)組成; AN1 鋅指的結(jié)構(gòu)模式是C-X4-C-X(9-12)-C-X(1-2)-C-X4-C-X2-H-X5-H-X- C 或者C-X2-C-X(9-12)-C-X(1-2)-C-X4-C-X2-H-X5-H-X-C,其中X 代表任意氨基酸[6]。OsSAP1(Oryza sativa subspecies indica stress-associated protein1)是在植物中首次發(fā)現(xiàn)的具有AN1 與A20 鋅指結(jié)構(gòu)域的蛋白,在煙草中過(guò)量表達(dá)OsSAP1 后,轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)逆境的耐受性得以提高[7]。后來(lái)有更多研究證明非生物脅迫應(yīng)答與A20/AN1 鋅指蛋白相關(guān),因此具有A20/AN1 結(jié)構(gòu)的蛋白被研究者命名為逆境相關(guān)蛋白SAPs(Stress associated proteins)[8]。

    絨毛白蠟(Fraxinus velutina Torr.)為木樨科(Oleacear)白蠟屬(Fraxinus L.)植物,原產(chǎn)美國(guó),其樹(shù)體高大,根系發(fā)達(dá),抗逆性強(qiáng),是鹽堿地造林的主要樹(shù)種,在城市綠化中應(yīng)用也非常廣泛。本研究以絨毛白蠟為材料,通過(guò)RT-PCR 技術(shù)克隆了含有兩個(gè)AN1 鋅指結(jié)構(gòu)域的鋅指蛋白FvSAP1 并對(duì)該基因以及編碼的氨基酸序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析,同時(shí)構(gòu)建了pCAMBIA2300-FvSAP1 植物表達(dá)載體,為下一步分析非生物脅迫下轉(zhuǎn)FvSAP1 基因的株系與非轉(zhuǎn)基因株系之間的表達(dá)差異,進(jìn)而培育抗性強(qiáng)的絨毛白蠟新品種提供理論支撐。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    試驗(yàn)于2018年在山東省林木遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行,以絨毛白蠟(Fraxinus velutina Torr.) R36 的種子組培幼苗為材料。R36 為項(xiàng)目組在種質(zhì)資源收集過(guò)程中于山東省東營(yíng)市發(fā)現(xiàn)的優(yōu)株。

    1.2 絨毛白蠟總RNA 的提取及cDNA 第一鏈的合成

    總RNA 提取采用Trizol 法,測(cè)定其OD260/OD280 值。取5 μL 樣品,加1 μL 6×Loading buffer,用于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA 質(zhì)量。用提取的總RNA 作為模板,按照Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit 使用說(shuō)明書(shū)合成的cDNA 第一鏈。

    1.3 克隆絨毛白蠟FvSAP1 基因編碼區(qū)

    以絨毛白蠟轉(zhuǎn)錄組Unigene 數(shù)據(jù)為基礎(chǔ),該數(shù)據(jù)通過(guò)Illumina HiSeq 2000 高通量測(cè)序技術(shù)獲得。設(shè)計(jì)引物序列如下F2:5′-CGGAAATGGGGAAGAACAG-3′; R2:5′-CAAACAAGAGGTCCGTCAT-3′,以F5、R5 為引物,cDNA 為模板,使用高保真酶對(duì)引物中間的蛋白質(zhì)編碼框進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為:先94℃預(yù)變性5 min;再94℃變性30 s; 然后58℃退火30 s;最后72℃延伸1 min 30 s,共計(jì)30 個(gè)循環(huán)。把擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),檢測(cè)完畢將目的條帶回收、連接pMD18-T Vector 并把重組載體pMD18-T-FvSAP1 轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。經(jīng)過(guò)過(guò)夜培養(yǎng)后,選取單菌落進(jìn)行PCR 擴(kuò)增并篩選陽(yáng)性克隆,在檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的菌液中加入15%的甘油在-80℃條件下保存,同時(shí)將新鮮菌液送到山東沃恩生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

    1.4 絨毛白蠟pCAMBIA2300-FvSAP1 植物表達(dá)載體的構(gòu)建

    提取重組質(zhì)粒pMD18-T-FvSAP1,使用Xba I 和Sal I 對(duì)pMD18-T-FvSAP1 和pCAMBIA2300 質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切,凝膠電泳檢測(cè)目的條帶并回收。使用T4 DNA 連接酶將回收的目的基因和線性pCAMBIA2300 載體進(jìn)行連接,將連接后的重組質(zhì)粒pCAMBIA2300-FvSAP1 轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404。過(guò)夜培養(yǎng)后選取單菌落進(jìn)行PCR 擴(kuò)增篩選陽(yáng)性菌落。

    1.5 生物信息學(xué)分析

    利用ORFfinder 程序?qū)ふ议_(kāi)放閱讀框; NCBI 上的CD-Search 工具查找氨基酸序列的保守結(jié)構(gòu)域;BLASTX 程序進(jìn)行核苷酸序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列同源性比對(duì); DNAMAN 軟件進(jìn)行氨基酸序列的多重比較。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 絨毛白蠟FvSAP1 基因編碼區(qū)的克隆及植物表達(dá)載體的構(gòu)建

    本實(shí)驗(yàn)以絨毛白蠟幼嫩葉片反轉(zhuǎn)錄cDNA 為模板,通過(guò)設(shè)計(jì)特異性引物F2/R2 擴(kuò)增得到大小為900bp左右的預(yù)期條帶(見(jiàn)圖1-A),對(duì)該條帶進(jìn)行回收、轉(zhuǎn)化、陽(yáng)性檢測(cè)(見(jiàn)圖1-B)、保菌并測(cè)序。

    圖1 PCR 擴(kuò)增結(jié)果

    對(duì)pMD18-T-FvSAP1 和pCAMBIA2300 質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切并使用T4 DNA 連接酶將目的基因與線性載體連接獲得重組pCAMBIA2300-FvSAP1 質(zhì)粒,且將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404 獲得重組質(zhì)粒菌株。

    2.2 生物信息學(xué)分析

    2.2.1 氨基酸序列分析

    基因編碼區(qū)編碼281 個(gè)氨基酸,分子量為31.0 kDa,等電點(diǎn)為8.34。使用NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 上的Conserved Domains 數(shù)據(jù)庫(kù)查詢FvSAP1 蛋白序列的保守結(jié)構(gòu)域,結(jié)構(gòu)顯示在13-47bp 和101-137bp 處各有1 個(gè)AN1 型鋅指結(jié)構(gòu)(見(jiàn)圖2),其結(jié)構(gòu)為:C-X4-C-X(9-12)-C-X(1-2)-C-X4-C-X2-H-X5-H-X-C。Jin 等把水稻、白楊等4 種植物中含AN1 鋅指的蛋白家族分為兩大類:類型Ⅰ的AN1 鋅指基序?yàn)镃X(2)CX(9-12)CX(1-2)CX(4)CX(2)HX(5)HXC,通常還含有A20 鋅指結(jié)構(gòu)域,基因內(nèi)無(wú)內(nèi)含子;類型II的鋅指基序?yàn)镃X(4)CX(9-12)CX(1-2)CX(4)CX(2)H X(5)HXC,不含A20 結(jié)構(gòu)域,基因內(nèi)有內(nèi)含子[9]。說(shuō)明所克隆的基因?qū)儆陬愋虸I。

    圖2 FvSAP1 基因編碼區(qū)序列及氨基酸序列

    2.2.2 同源性分析

    Blast 工具尋找FvSAP1氨基酸序列的同源序列,結(jié)果顯示與包含AN1 和C2H2 鋅指結(jié)構(gòu)的蛋白序列有較高的相似性。其中與芝麻(Sesamum indicum, XP_011075237.1) SiSAP16 序列的相似性為78%; 與煙草(Nicotiana attenuata, OIT39519.1)NaSAP16 序列的相似性為75%。選取相似性較高的幾個(gè)序列以及查閱相關(guān)文獻(xiàn)得知,同類的與抗逆境脅迫相關(guān)的蛋白番茄SlSAP12(Solanum lycopersicum,FJ442198)[10],擬南芥AtSAP11(Arabidopsis thaliana, Q8VZ42)[11],玉米ZmAN110(Zea mays, EF396223)進(jìn)行多重序列比對(duì)(見(jiàn)圖3)。從圖中可以看出N-端的兩個(gè)AN1 鋅指結(jié)構(gòu)域和C-端功能未知,類似C2H2 鋅指的區(qū)域存在較高的保守性,說(shuō)明不同物種之間,該蛋白序列的具有較高的保守性。

    圖3 FvSAP1 與同類蛋白的多重序列比對(duì)

    3 結(jié)論

    鋅指蛋白屬于基因表達(dá)調(diào)控因子,其重要作用就是調(diào)控基因的表達(dá)。已有多項(xiàng)研究顯示植物體內(nèi)的A20/AN1型鋅指蛋白與植物應(yīng)對(duì)逆境的反應(yīng)有密切關(guān)系,人們將這種蛋白稱為逆境相關(guān)蛋白SAPs(Stress associated proteins)。本研究從絨毛白蠟中克隆出了一個(gè)鋅指蛋白基因FvSAP1,分析發(fā)現(xiàn)其編碼蛋白序列中包含兩個(gè)AN1型鋅指結(jié)構(gòu)域,屬于A20/AN1型鋅指蛋白,且與其他植物的同類鋅指蛋白具有高度的保守性,并且構(gòu)建了植物表達(dá)載體pCAMBIA2300-FvSAP1,為下一步驗(yàn)證該基因是否與逆境脅迫應(yīng)答相關(guān),以及培育優(yōu)良抗性強(qiáng)的絨毛白蠟新品種奠定基礎(chǔ)。

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