• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    韭菜遲眼蕈蚊雌雄成蟲差異基因表達的轉(zhuǎn)錄組分析

    2021-11-12 07:29:00胡靜榮史彩華
    關(guān)鍵詞:雌雄差異基因韭菜

    胡靜榮,史彩華

    長江大學(xué)農(nóng)學(xué)院,湖北 荊州 434025

    韭菜遲眼蕈蚊(BradysiacellarumFrey)俗稱韭蛆,隸屬雙翅目眼蕈蚊科[1]。該蟲是我國蔬菜作物的重要地下害蟲,其寄主范圍廣,可為害大蒜、大蔥、甘藍、蘿卜、甜瓜、芹菜等7科30多種蔬菜、瓜果和食用菌,尤其喜歡取食百合科的韭菜(AlliumtuberosumRottlerexSpreng)[2,3]。在無任何防治措施的情況下,可造成韭菜減產(chǎn)50%左右,嚴(yán)重時毀種絕收[4]。

    防治韭菜遲眼蕈蚊的方法有臭氧水、昆蟲病原線蟲、粘蟲板、防蟲網(wǎng)和生物菌劑等[5-8]。然而,這些方法均存在一定的局限性,如防治效果差、成本高、操作復(fù)雜等。因此,韭菜遲眼蕈蚊仍然是我國韭菜種植業(yè)的重大生物災(zāi)害。目前,防治韭菜遲眼蕈蚊的首選方法仍然是澆灌化學(xué)農(nóng)藥,然而農(nóng)藥的過度使用存在抗藥性、食品污染和環(huán)境污染等風(fēng)險[9]。為有效防治韭菜遲眼蕈蚊,研究新的、可持續(xù)性的防控措施勢在必行。

    研究表明,將雌蚊轉(zhuǎn)化為雄蚊是當(dāng)前蚊蟲防控工作的重要突破口。然而,通過生物技術(shù)調(diào)控昆蟲性別必須建立在昆蟲性別決定與性別分化的基礎(chǔ)之上。目前,為揭示蚊蟲的性別差異,KOUTSOS等[10]研究了岡比亞按蚊(Anophelesgambiae)在胚胎、5個齡期的幼蟲、蛹、成蚊等8個連續(xù)生命周期中的基因表達譜,結(jié)果表明其雌蚊表達量較高的基因主要與免疫有關(guān),雄蚊表達量較高的基因主要與代謝過程有關(guān)。WHITTLE等[11]研究表明,埃及伊蚊(Aedesaegypti)卵巢高表達的基因有2927個,精巢高表達的基因有2013個。然而,關(guān)于韭菜遲眼蕈蚊雌雄差異表達基因并不清楚。為明確韭菜遲眼蕈蚊雌雄個體在生殖中的作用與貢獻,筆者采用PacBio Sequel平臺進行第三代轉(zhuǎn)錄組測序,從基因水平比較雌雄成蟲之間的差異,以期為揭示韭菜遲眼蕈蚊性別決定與性別分化的分子機理奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    韭菜遲眼蕈蚊由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所提供,并在長江大學(xué)農(nóng)學(xué)院實驗室恒溫飼養(yǎng)3代,設(shè)置溫度(25 ± 1)℃、濕度(70 ± 5)%、光照14h∶10h(晝∶夜)。用吸蟲管分別將未交配的雌雄成蟲收集到不同的1.5mL無菌離心管中,作好標(biāo)記,放液氮中徹底冷凍、備用。

    RNA提取試劑Trizol購置于Invitrogen公司(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA);cDNA文庫構(gòu)建試劑盒購置于Illumina公司(TruseqTM RNA Sample prep Kit);PCR產(chǎn)物純化試劑盒購置于Qiagen公司(Qiagen, CA, USA);cDNA合成試劑盒購置于Thermo公司(Revert AidTM First Strand cDNA Synthesis Kit);dNTP購置于TIANGEN。

    1.2 方法

    1.2.1 總RNA提取、測序、數(shù)據(jù)校正

    將樣品送北京諾禾致源科技股份有限公司測序,采用Trizol法提取韭菜遲眼蕈蚊雌雄成蟲的總RNA。用帶有Oligo(dT)的磁珠,通過A-T互補配對的方法與mRNA的ployA結(jié)合富集mRNA,再加入fragmentation buffer打斷mRNA,然后用六堿基隨機引物(random hexamers)合成cDNA,再加dNTPs、DNA polymerase I合成雙鏈cDNA,并純化。

    將純化后的雙鏈cDNA進行末端修復(fù),加A尾和測序接頭,用AMPure XP beads進行片段大小選擇,最后采用PCR富集得到最終的cDNA文庫。對檢測合格的文庫進行上機測序。

    用PacBio軟件處理測序后的原始數(shù)據(jù)獲得Subreads序列,再通過CCS (Circular Consensus Sequence) 算法進行校正,獲得環(huán)形一致的CCS序列。將CCS序列分為全長序列(FLNC)與非全長序列(nFL),再將同一轉(zhuǎn)錄本的FLNC序列進行hierarchical n*log(n)算法聚類,獲得cluster consensus序列。然后對全長序列進行polish,獲得高質(zhì)量的Polished consensus序列,用二代轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)校正Polished consensus序列,并用CD-HIT軟件去冗余,得到非冗余轉(zhuǎn)錄本,包括CDS序列和unigene序列的數(shù)量。

    1.2.2 基因功能注釋

    分別用NCBI blast、Blast2GO和KAAS軟件,將1.2.1中拼接得到的unigenes序列與Nr非冗余蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫、Nt核酸序列數(shù)據(jù)庫、KOG同源蛋白簇數(shù)據(jù)庫、GO 基因本體論數(shù)據(jù)庫,以及KEGG日本京都基因和基因組百科全書數(shù)據(jù)庫(e-value<0.00001)進行比對,獲得All Unigene 在每個數(shù)據(jù)庫中的功能注釋信息。

    1.2.3 基因表達差異分析

    按照基因的表達量(FPKM值)計算基因在韭菜遲眼蕈蚊雌雄樣本間的差異表達倍數(shù),并結(jié)合差異檢驗的FDR(false discovery rate)值篩選雌雄樣本間的差異表達基因。

    1.2.4 基因差異富集分析

    用KEGG注釋信息得到Unigene基因的pathway注釋,選擇q-value≤0.05的pathway為差異表達基因中的顯著富集條目。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 韭菜遲眼蕈蚊雌雄成蟲基因功能注釋

    2.1.1 Nr數(shù)據(jù)庫注釋

    將韭菜遲眼蕈蚊雌雄成蟲基因序列與Nr數(shù)據(jù)庫進行比對,結(jié)果表明,雌成蟲注釋到11950個基因,對應(yīng)312個物種;雄成蟲注釋到16571個基因,對應(yīng)353個物種。同時,分別對雌雄成蟲注釋到的物種按基因相似度進行排序,取相似度排前20位的物種作圖,其中,雌雄成蟲共有的高相似物種占95%,詳見圖1。

    圖1 韭菜遲眼蕈蚊雌雄成蟲基因序列與Nr數(shù)據(jù)庫物種比對的注釋信息Fig.1 Annotation information on gene sequences of male and female adults of Bradysia cellarum compared with species in Nr database

    圖2 韭菜遲眼蕈蚊雌雄成蟲的GO分類 Fig.2 GO taxonomy of male and female adults of Bradysia cellarum

    2.1.2 GO分類

    將韭菜遲眼蕈蚊雌雄成蟲基因序列進行GO注釋,結(jié)果表明,雌蟲注釋上的基因數(shù)為9705個,雄蟲注釋上的基因數(shù)為12168個。將基因功能按照細(xì)胞組分、分子功能和生物學(xué)過程進行分類,雌蟲分別占11114、11910、19600個,雄蟲分別占13473、14394、25332個,詳見圖2。

    2.1.3 KOG分類

    將韭菜遲眼蕈蚊雌雄成蟲基因序列與KOG數(shù)據(jù)庫進行比對分類,結(jié)果表明,雌蟲比對上10781個基因,雄蟲比對上14520個基因,詳見圖3。

    圖3 韭菜遲眼蕈蚊雌雄成蟲的KOG分類圖Fig.3 KOG taxonomic map of male and female adults of Bradysia cellarum

    2.1.4 KEGG分類

    圖4 韭菜遲眼蕈蚊雌雄成蟲基因功能注釋KEGG代謝通路分類Fig.4 Classification of gene function annotation to KEGG metabolic pathways in male and female adults of Bradysia cellarum

    將韭菜遲眼蕈蚊雌雄成蟲基因序列與KEGG數(shù)據(jù)庫進行比對,結(jié)果表明,從雌雄成蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中分別獲得13064和23488個轉(zhuǎn)錄本。對雌雄成蟲的基因分別按6大通路進行注釋,結(jié)果表明,雌蟲中參與細(xì)胞過程(cellular processes)、環(huán)境信息處理(environment information processing)、遺傳信息處理(genetic information processing)、人類疾病(human disease)、新陳代謝(metabolism)和機體系統(tǒng)(organismal systems)的基因通路分別為1560、1237、1363、2643、1701、2160條;雄蟲中參與細(xì)胞過程、環(huán)境信息處理、遺傳信息處理、人類疾病、新陳代謝和機體系統(tǒng)的基因通路分別為228、2055、1276、4132、3301、3865條,詳見圖4。

    2.1.5 數(shù)據(jù)庫之間的維恩圖分析

    韭菜遲眼蕈蚊雌成蟲注釋到Nr、Nt、KOG、KEGG、GO等5個數(shù)據(jù)庫中的基因分別為11950、4091、9562、10012、9704條,其中共同注釋到的基因有3209條,詳見圖5(a)。雄成蟲注釋到Nr、Nt、KOG、KEGG、GO等5個數(shù)據(jù)庫中的基因分別為16571、6046、12873、16203、12168條,其中共同注釋到的基因有4402條,詳見圖5(b)。

    2.2 差異基因表達分析

    2.2.1 韭菜遲眼蕈蚊雌雄成蟲差異基因篩選

    根據(jù)韭菜遲眼蕈蚊雌雄成蟲基因表達倍數(shù)比表明,上調(diào)的基因有9794個,下調(diào)的基因有8881個,無顯著差異的基因有5472個,詳見圖6。

    2.2.2 韭菜遲眼蕈蚊雌雄成蟲差異基因維恩圖

    雄性成蟲特有基因6833個,雌性成蟲特有基因3898個,雌雄成蟲共同擁有的基因17763個,詳見圖7。

    2.3 韭菜遲眼蕈蚊雌雄成蟲差異基因KEGG富集分析

    對雌雄成蟲的差異基因進行KEGG富集,結(jié)果表明,上調(diào)基因的富集通路282個,平均q-value為0.00088;下調(diào)基因的富集通路285個,平均q-value為0.0048。挑選富集最顯著的20條pathway作圖,其中包含上調(diào)基因1821個,下調(diào)基因1351個。差異表達基因明顯富集在有機酸代謝、肽代謝過程等功能類別上,參與核糖體生物合成、RNA轉(zhuǎn)運等,詳見圖8。

    注:橫坐標(biāo)代表基因在雌雄成蟲樣品中表達倍數(shù),縱坐標(biāo)代表基因表達量在統(tǒng)計學(xué)上的顯著程度。其中,校正后的p-value越小,-log10越大,即差異越顯著。圖中散點代表各個基因,藍色圓點表示無顯著差異的基因,紅色圓點表示顯著上調(diào)的基因,綠色圓點表示顯著下調(diào)的基因。圖6 韭菜遲眼蕈蚊雌雄基因差異表達分析Fig.6 Differential expression analysis of male and female genes of Bradysia cellarum

    注:每個大圓中數(shù)字的和代表某種樣品差異基因總數(shù),圓圈交疊處的數(shù)字表示雌雄成蟲共有的差異基因。圖7 韭菜遲眼蕈蚊雌雄成蟲差異基因維恩圖Fig.7 Venn map of differential genes of male and female adults of Bradysia cellarum

    3 討論與結(jié)論

    轉(zhuǎn)錄組通常指物種或組織中所有 RNA 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的集合[12]。不同物種或同一物種的不同組織或同一組織的不同時期,它們的轉(zhuǎn)錄組表達情況均存在很大差異[13]。分析生物雌雄樣本的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),有利于挖掘系統(tǒng)發(fā)育基因、性別關(guān)聯(lián)基因、特異遺傳性狀基因等[14]。

    注:縱軸表示pathway名稱,橫軸表示pathway對應(yīng)的富集因子。qvalue值越小則顏色越接近紅色,每個pathway下包含的差異基因的多少用點的大小來表示。圖8 韭菜遲眼蕈蚊雌雄成蟲差異基因KEGG富集散點圖Fig.8 Scatter plot of differential gene KEGG enrichment of male and female adults of Bradysia cellarum

    該研究分別構(gòu)建了韭菜遲眼蕈蚊雌雄成蟲的2個cDNA文庫。其中,在雌性cDNA文庫中獲得13064條unigenes,同時被Nr、Nt、KOG、KEGG和GO等數(shù)據(jù)庫注釋的基因有3209條;在雄性cDNA文庫中獲得23488條unigenes,同時被Nr、Nt、KOG、KEGG和GO等數(shù)據(jù)庫注釋的基因有4402條。雄性成蟲高表達的基因數(shù)顯著多于雌性成蟲,可能與雄性成蟲活動能力略強于雌性成蟲有關(guān)[15]。

    韭菜遲眼蕈蚊雌雄成蟲表現(xiàn)出高度的性別二態(tài)性,比如雌性個體大,雄性個體??;雌蟲腹部粗大,末端細(xì)而尖,雄蟲有1對抱握器等[16]。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析有助于闡明性別二態(tài)性的分子機理,對揭示性別分化和性別決定具有重要意義。研究結(jié)果表明,韭菜遲眼蕈蚊偏向雄性的基因多于雌性,其中雄性特有的基因6833條,雌性特有的基因3898條,與EADS等[17]研究水蚤的結(jié)果一致。然而,赤擬谷盜(Triboliumcastaneum)[18]、岡比亞蚊[19]和埃及伊蚊[11]的特有基因數(shù)量偏向雌性,從而暗示物種不同,性別基因的偏向并不相同。KOUTSOS等[10]研究表明,岡比亞按蚊雌蚊的高表達基因主要與免疫有關(guān),雄蚊高表達基因主要與代謝有關(guān)。韭菜遲眼蕈蚊的高表達基因之所以偏向雄性,可能與雄性超強的交配能力和強于雌性的飛行能力需要超強的代謝功能有關(guān)[20],但具體原因有待進一步研究。

    轉(zhuǎn)錄組序列的拼接算法包括有參考基因組序列的拼接方法和無參考基因組序列的拼接方法:參考基因組序列的拼接算法主要有Cufflinks[21]和Scripture[22]等開發(fā)軟件;無參考基因組序列的拼接算法主要有ABySS[23]、SOAP denovo[24]、Trinity[25]等開發(fā)軟件。笗者利用新一代高通量測序技術(shù)對韭菜遲眼蕈蚊雌雄成蟲進行轉(zhuǎn)錄組測序,再采用無參考基因組序列的拼接算法對韭菜遲眼蕈蚊序列進行拼接,與序列表達標(biāo)簽(EST)技術(shù)進行比較,具有測序數(shù)據(jù)覆蓋度高的優(yōu)點。該研究為揭示韭菜遲眼蕈蚊性別決定、生殖生長、營養(yǎng)代謝等分子機制奠定了基礎(chǔ),同時,豐富了昆蟲遺傳信息庫,有助于韭菜遲眼蕈蚊綠色防控新技術(shù)研發(fā)。

    猜你喜歡
    雌雄差異基因韭菜
    ICR鼠肝和腎毒性損傷生物標(biāo)志物的篩選
    “割韭菜”用英語怎么說?
    英語世界(2023年11期)2023-11-17 09:24:46
    太行雞雌雄鑒別智能技術(shù)的研究與應(yīng)用
    基于RNA 測序研究人參二醇對大鼠心血管內(nèi)皮細(xì)胞基因表達的影響 (正文見第26 頁)
    風(fēng)云變幻——赫章韭菜坪
    萵苣和韭菜
    韭菜新品種遼韭1號的選育
    中國蔬菜(2015年9期)2015-12-21 13:04:42
    雌雄時代
    Coco薇(2015年12期)2015-12-10 02:40:50
    SSH技術(shù)在絲狀真菌功能基因篩選中的應(yīng)用
    雌雄洛氏鱥肌肉營養(yǎng)成分的比較分析
    日本精品一区二区三区蜜桃| 国产色婷婷99| 性色av乱码一区二区三区2| 一进一出好大好爽视频| 国产精品综合久久久久久久免费| 在线播放无遮挡| 级片在线观看| 99久国产av精品| 成年人黄色毛片网站| 欧美成人性av电影在线观看| 色综合亚洲欧美另类图片| 国产免费一级a男人的天堂| 国产乱人伦免费视频| 中文字幕久久专区| 亚洲人成网站在线播| 成年女人毛片免费观看观看9| 久久性视频一级片| 岛国在线免费视频观看| 日韩欧美在线乱码| 欧美极品一区二区三区四区| 亚洲人成电影免费在线| 男女视频在线观看网站免费| 黄色视频,在线免费观看| 丰满人妻一区二区三区视频av| 亚洲国产精品sss在线观看| 成人av一区二区三区在线看| 国产精品国产高清国产av| 丁香六月欧美| 最近最新中文字幕大全电影3| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 日韩亚洲欧美综合| 国产精品精品国产色婷婷| 午夜免费成人在线视频| 熟女电影av网| 国产毛片a区久久久久| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 国产精品永久免费网站| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 禁无遮挡网站| 日韩av在线大香蕉| 亚洲性夜色夜夜综合| 变态另类丝袜制服| 在线免费观看的www视频| 日韩成人在线观看一区二区三区| 1000部很黄的大片| 成人特级黄色片久久久久久久| 少妇熟女aⅴ在线视频| 特级一级黄色大片| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 国产成人a区在线观看| 国产精品久久电影中文字幕| 性欧美人与动物交配| 久9热在线精品视频| 亚洲欧美清纯卡通| 日韩欧美精品免费久久 | 免费搜索国产男女视频| 亚洲av电影在线进入| 日韩欧美 国产精品| 成人永久免费在线观看视频| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 欧美丝袜亚洲另类 | 国产高清视频在线观看网站| 久久久成人免费电影| 欧美bdsm另类| 亚洲自拍偷在线| 亚洲成人精品中文字幕电影| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 婷婷精品国产亚洲av在线| 1000部很黄的大片| 永久网站在线| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 日本黄色视频三级网站网址| 成人特级黄色片久久久久久久| 色哟哟哟哟哟哟| 日韩人妻高清精品专区| 国内精品美女久久久久久| 国产一区二区三区视频了| 12—13女人毛片做爰片一| 老熟妇仑乱视频hdxx| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 最好的美女福利视频网| 国产野战对白在线观看| 欧美日本亚洲视频在线播放| 热99在线观看视频| 国产乱人视频| 婷婷精品国产亚洲av在线| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 18禁在线播放成人免费| 亚洲av电影在线进入| 我要看日韩黄色一级片| 观看美女的网站| 观看美女的网站| 欧美黑人巨大hd| 午夜免费激情av| 啪啪无遮挡十八禁网站| 一本久久中文字幕| 亚洲成人久久爱视频| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 中出人妻视频一区二区| 91麻豆av在线| 亚洲美女搞黄在线观看 | 成人特级黄色片久久久久久久| 黄色日韩在线| 国产精品亚洲一级av第二区| 国产一级毛片七仙女欲春2| 一进一出抽搐gif免费好疼| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 国产高潮美女av| 2021天堂中文幕一二区在线观| 亚洲自拍偷在线| 欧美午夜高清在线| 88av欧美| 丰满人妻一区二区三区视频av| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 18禁在线播放成人免费| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 午夜福利免费观看在线| 欧美zozozo另类| а√天堂www在线а√下载| а√天堂www在线а√下载| 亚洲中文日韩欧美视频| 99久久精品一区二区三区| 日本黄色片子视频| 老司机午夜十八禁免费视频| 婷婷丁香在线五月| 精品久久久久久久久久免费视频| 看黄色毛片网站| 搞女人的毛片| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 国产一区二区三区视频了| 成人特级黄色片久久久久久久| 午夜福利高清视频| 色噜噜av男人的天堂激情| 国产精品免费一区二区三区在线| 久久精品影院6| 亚洲熟妇熟女久久| 99国产综合亚洲精品| 男女视频在线观看网站免费| 日韩高清综合在线| 国产精华一区二区三区| 亚洲人成电影免费在线| 成熟少妇高潮喷水视频| 国产在线精品亚洲第一网站| 看免费av毛片| 九色国产91popny在线| 亚洲不卡免费看| 啦啦啦韩国在线观看视频| av专区在线播放| 免费av观看视频| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 国产免费男女视频| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 婷婷亚洲欧美| 人妻夜夜爽99麻豆av| 欧美又色又爽又黄视频| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 亚洲18禁久久av| av视频在线观看入口| 国产精华一区二区三区| 又爽又黄无遮挡网站| 国产大屁股一区二区在线视频| 国产精品一区二区免费欧美| 99久久99久久久精品蜜桃| 亚洲中文字幕日韩| 亚洲自拍偷在线| 亚洲18禁久久av| 一级毛片久久久久久久久女| 免费搜索国产男女视频| 最近在线观看免费完整版| 亚洲欧美激情综合另类| 久久久国产成人精品二区| 午夜福利成人在线免费观看| 可以在线观看毛片的网站| 9191精品国产免费久久| 欧美激情国产日韩精品一区| 中文亚洲av片在线观看爽| 国产精品影院久久| www.色视频.com| 欧美激情在线99| 嫁个100分男人电影在线观看| 免费看日本二区| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 国产精品亚洲美女久久久| 1000部很黄的大片| 男人舔女人下体高潮全视频| 亚州av有码| 最近中文字幕高清免费大全6 | 韩国av一区二区三区四区| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 国产三级中文精品| 在线免费观看的www视频| 久久6这里有精品| 一进一出抽搐动态| 国产精品一区二区免费欧美| 日本熟妇午夜| 嫩草影视91久久| 一进一出好大好爽视频| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 99久久无色码亚洲精品果冻| 可以在线观看的亚洲视频| 国产成人啪精品午夜网站| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 性色avwww在线观看| 如何舔出高潮| 免费一级毛片在线播放高清视频| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 日韩欧美国产一区二区入口| 国产精品,欧美在线| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 亚洲欧美激情综合另类| 国产在线精品亚洲第一网站| 国产黄片美女视频| 精品久久久久久,| 亚州av有码| 我要搜黄色片| 成人性生交大片免费视频hd| 欧美国产日韩亚洲一区| 欧美日韩国产亚洲二区| 亚洲精品日韩av片在线观看| 日韩欧美免费精品| 久久99热6这里只有精品| 舔av片在线| 老司机午夜十八禁免费视频| 99久久九九国产精品国产免费| 丰满人妻一区二区三区视频av| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 欧美激情国产日韩精品一区| 亚洲精品日韩av片在线观看| 性插视频无遮挡在线免费观看| 国产亚洲av嫩草精品影院| 久久人妻av系列| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 两人在一起打扑克的视频| 中文资源天堂在线| 日本 av在线| 久久九九热精品免费| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 久久久久亚洲av毛片大全| 欧美一区二区亚洲| 99久久精品国产亚洲精品| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片 | 尤物成人国产欧美一区二区三区| 国产黄片美女视频| 亚洲 国产 在线| 精品熟女少妇八av免费久了| 午夜激情福利司机影院| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 女同久久另类99精品国产91| 在线观看一区二区三区| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 男人和女人高潮做爰伦理| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 精品人妻视频免费看| 偷拍熟女少妇极品色| 亚洲成a人片在线一区二区| 天堂av国产一区二区熟女人妻| ponron亚洲| 十八禁网站免费在线| 中亚洲国语对白在线视频| 校园春色视频在线观看| 黄色配什么色好看| 亚洲美女黄片视频| 一夜夜www| 欧美中文日本在线观看视频| 免费av观看视频| 成人国产一区最新在线观看| 十八禁网站免费在线| 亚洲最大成人手机在线| 日本一本二区三区精品| 日韩中文字幕欧美一区二区| 欧美又色又爽又黄视频| 宅男免费午夜| 男女视频在线观看网站免费| 老司机午夜福利在线观看视频| 欧美成人免费av一区二区三区| 少妇的逼水好多| 在线播放无遮挡| 久久精品人妻少妇| 波多野结衣高清作品| 亚洲成av人片免费观看| 国产av一区在线观看免费| 欧美最新免费一区二区三区 | 亚洲av.av天堂| 我要搜黄色片| x7x7x7水蜜桃| 免费观看精品视频网站| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 天堂动漫精品| 精品久久久久久久末码| 男人狂女人下面高潮的视频| 国产免费男女视频| av天堂在线播放| 淫秽高清视频在线观看| 午夜激情欧美在线| 亚洲午夜理论影院| 91午夜精品亚洲一区二区三区 | 久久国产乱子伦精品免费另类| 久久久久久大精品| 久久性视频一级片| 欧美国产日韩亚洲一区| 国产白丝娇喘喷水9色精品| www日本黄色视频网| 欧美激情在线99| 少妇人妻精品综合一区二区 | 欧美性猛交黑人性爽| 午夜福利视频1000在线观看| 观看免费一级毛片| 1000部很黄的大片| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 美女cb高潮喷水在线观看| 国产大屁股一区二区在线视频| 女同久久另类99精品国产91| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 国产精华一区二区三区| 亚洲在线观看片| 国产精品久久久久久久电影| 99热只有精品国产| 一进一出抽搐动态| 波多野结衣巨乳人妻| 国产三级在线视频| 俄罗斯特黄特色一大片| 51国产日韩欧美| 特级一级黄色大片| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 91久久精品国产一区二区成人| 又爽又黄无遮挡网站| 午夜日韩欧美国产| 91字幕亚洲| 国产精品三级大全| 午夜免费激情av| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 丰满乱子伦码专区| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 极品教师在线视频| h日本视频在线播放| 亚洲精品色激情综合| 亚洲国产色片| 韩国av一区二区三区四区| 久久精品国产自在天天线| 嫁个100分男人电影在线观看| 国产在线男女| 婷婷色综合大香蕉| 男女视频在线观看网站免费| 在线播放无遮挡| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 亚洲乱码一区二区免费版| 午夜福利欧美成人| 中国美女看黄片| 国产精品人妻久久久久久| 欧美在线黄色| 日韩高清综合在线| 亚洲在线观看片| 欧美又色又爽又黄视频| 日本a在线网址| 亚洲国产精品久久男人天堂| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 亚洲熟妇熟女久久| 在线看三级毛片| 又黄又爽又免费观看的视频| 99久久精品热视频| 日韩亚洲欧美综合| 99久久99久久久精品蜜桃| 热99在线观看视频| 真人一进一出gif抽搐免费| 亚洲中文日韩欧美视频| 亚洲成人中文字幕在线播放| 毛片女人毛片| 中文资源天堂在线| 少妇被粗大猛烈的视频| 给我免费播放毛片高清在线观看| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 久久国产乱子免费精品| www.www免费av| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 午夜福利高清视频| 日韩欧美免费精品| 久久久久精品国产欧美久久久| 日本免费一区二区三区高清不卡| 国产精品女同一区二区软件 | 免费在线观看成人毛片| 黄色一级大片看看| 深夜精品福利| 在线看三级毛片| 在线a可以看的网站| 亚洲熟妇熟女久久| 精品日产1卡2卡| 女同久久另类99精品国产91| 久久久久久国产a免费观看| 亚洲一区高清亚洲精品| 婷婷精品国产亚洲av| 欧美一区二区国产精品久久精品| 99久国产av精品| 在线a可以看的网站| 精品人妻视频免费看| 成人特级av手机在线观看| 麻豆国产av国片精品| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 欧美日本亚洲视频在线播放| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 成人欧美大片| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 窝窝影院91人妻| 一个人免费在线观看电影| 黄色配什么色好看| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 亚洲性夜色夜夜综合| 久久九九热精品免费| 国产综合懂色| 久久久久久九九精品二区国产| a级毛片a级免费在线| 欧美国产日韩亚洲一区| 在线天堂最新版资源| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 国产av一区在线观看免费| 97碰自拍视频| 亚洲五月天丁香| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 午夜激情欧美在线| 国产精品98久久久久久宅男小说| 亚洲性夜色夜夜综合| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 丁香欧美五月| 国产淫片久久久久久久久 | 精品国产亚洲在线| 国产三级黄色录像| 老司机午夜福利在线观看视频| 一级黄色大片毛片| 九九热线精品视视频播放| 91麻豆av在线| 精品国产亚洲在线| 搡老妇女老女人老熟妇| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 一区二区三区免费毛片| 韩国av一区二区三区四区| 亚洲,欧美精品.| 如何舔出高潮| 国产高清视频在线播放一区| 99久久无色码亚洲精品果冻| 99久久精品一区二区三区| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 99久久精品国产亚洲精品| 国产一级毛片七仙女欲春2| 91在线精品国自产拍蜜月| 观看免费一级毛片| 亚洲精品日韩av片在线观看| 麻豆成人午夜福利视频| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 首页视频小说图片口味搜索| 成人美女网站在线观看视频| 午夜福利在线在线| 亚洲欧美清纯卡通| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 亚洲精品粉嫩美女一区| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 日本一二三区视频观看| 日韩精品中文字幕看吧| 色综合站精品国产| 国产大屁股一区二区在线视频| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 中国美女看黄片| 一本综合久久免费| 精品午夜福利在线看| 亚洲精品456在线播放app | 国产精品久久久久久久久免 | 亚洲成人中文字幕在线播放| 在现免费观看毛片| 白带黄色成豆腐渣| 舔av片在线| 久久久精品大字幕| 国产精品av视频在线免费观看| 亚洲一区高清亚洲精品| 精品人妻偷拍中文字幕| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 国产成+人综合+亚洲专区| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 在线播放国产精品三级| 成人三级黄色视频| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 69av精品久久久久久| 赤兔流量卡办理| 国产成年人精品一区二区| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 亚洲成人中文字幕在线播放| 日韩 亚洲 欧美在线| 黄色日韩在线| 一夜夜www| 在线播放无遮挡| 99在线人妻在线中文字幕| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 国产真实伦视频高清在线观看 | 久久午夜福利片| 欧美乱色亚洲激情| 亚洲av电影在线进入| 成人一区二区视频在线观看| 国产私拍福利视频在线观看| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 最好的美女福利视频网| 能在线免费观看的黄片| 动漫黄色视频在线观看| 中亚洲国语对白在线视频| 搞女人的毛片| 国产精品日韩av在线免费观看| 精品久久久久久久久久免费视频| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 亚洲av不卡在线观看| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 999久久久精品免费观看国产| 天天躁日日操中文字幕| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 在线国产一区二区在线| 国产三级黄色录像| 可以在线观看毛片的网站| 欧美黑人欧美精品刺激| 九色国产91popny在线| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 人妻久久中文字幕网| av国产免费在线观看| 中出人妻视频一区二区| 婷婷精品国产亚洲av在线| 久99久视频精品免费| 在线天堂最新版资源| 久久亚洲真实| 亚洲,欧美,日韩| 香蕉av资源在线| 欧美中文日本在线观看视频| 久久人人精品亚洲av| 很黄的视频免费| 嫩草影视91久久| 日韩有码中文字幕| 午夜福利高清视频| 国产淫片久久久久久久久 | 国产伦精品一区二区三区视频9| 成年女人毛片免费观看观看9| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 两人在一起打扑克的视频| 国产av在哪里看| 两人在一起打扑克的视频| av在线观看视频网站免费| 很黄的视频免费| 婷婷精品国产亚洲av在线| 免费在线观看亚洲国产| 午夜福利在线在线| 免费在线观看亚洲国产| av天堂在线播放| 亚洲成a人片在线一区二区| av中文乱码字幕在线| 99热这里只有是精品在线观看 | 亚洲人成电影免费在线| 91久久精品电影网| 精品人妻熟女av久视频| 日韩免费av在线播放| 少妇人妻精品综合一区二区 | 中文资源天堂在线| or卡值多少钱| 国产在线男女| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 中文资源天堂在线| 欧美日韩乱码在线| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 亚洲av熟女| 亚洲av二区三区四区| 亚洲精品久久国产高清桃花| 看十八女毛片水多多多| 在线观看午夜福利视频| 精品国产亚洲在线| av女优亚洲男人天堂| 91午夜精品亚洲一区二区三区 | 51国产日韩欧美| 婷婷精品国产亚洲av在线| 亚洲一区高清亚洲精品| eeuss影院久久| 午夜久久久久精精品| 美女黄网站色视频| 99精品在免费线老司机午夜| АⅤ资源中文在线天堂| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 久久久精品欧美日韩精品| 国产伦一二天堂av在线观看| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 一级黄色大片毛片| 日本一二三区视频观看| 1000部很黄的大片| 51国产日韩欧美| 深夜a级毛片| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| av欧美777| 一本精品99久久精品77| 88av欧美| av专区在线播放| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 精品免费久久久久久久清纯| 国产乱人伦免费视频| 嫁个100分男人电影在线观看| 999久久久精品免费观看国产| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 99国产极品粉嫩在线观看| 精品日产1卡2卡| 香蕉av资源在线| 美女被艹到高潮喷水动态| 最近视频中文字幕2019在线8| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 丝袜美腿在线中文| 国产老妇女一区|