• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    感染赤星病后煙草葉片的蛋白質(zhì)表達(dá)差異

    2021-11-11 12:23:00耿莉娜汪代斌
    關(guān)鍵詞:赤星二磷酸侵染

    耿莉娜,趙 敏,張 艷,徐 宸,汪代斌

    重慶煙草科學(xué)研究所,重慶 400715

    煙草屬于收獲葉片的作物,在我國經(jīng)濟(jì)中占有比較重要的地位.煙草病害發(fā)生后對煙葉產(chǎn)量與質(zhì)量影響很大,嚴(yán)重時會造成毀滅性的經(jīng)濟(jì)損失.目前,煙草赤星病是嚴(yán)重制約我國煙葉生產(chǎn)的一類真菌病害,該病具有潛育期短、 爆發(fā)快的特點(diǎn),在溫濕度適宜的條件下,短時間內(nèi)即可大面積流行,給煙葉生產(chǎn)造成巨大損失.長期使用化學(xué)藥劑防治該病害會引起環(huán)境污染、 農(nóng)藥殘留、 抗藥性等問題; 生物防治雖無毒無害無污染,但其作用緩慢、 穩(wěn)定性差、 易受外界環(huán)境影響等缺點(diǎn)成為開發(fā)的難點(diǎn),因此研究煙草的抗病性和選育抗赤星病煙草品種是防治該病最經(jīng)濟(jì)有效的途徑[1-2].

    目前,對于煙草自身抗病性機(jī)理的研究,主要集中在抗病性誘導(dǎo)[3-5]、 抗病基因定位[6-7]、 分子標(biāo)記篩選[8-9]及抗性基因的轉(zhuǎn)化[10].這些研究都集中在分子水平上,而在蛋白質(zhì)水平上的研究報道很少.煙草自身的抗病性與蛋白的表達(dá)與調(diào)控密切相關(guān),因此本研究從蛋白質(zhì)水平入手,研究不同煙草品種接種赤星病菌后差異表達(dá)的蛋白質(zhì),旨在探討不同抗性煙草品種在蛋白質(zhì)組學(xué)水平上存在的差異及其對赤星病抗性的影響,為進(jìn)一步明確煙草的抗赤星病機(jī)制提供新內(nèi)容.

    1 材料和方法

    1.1 供試材料

    供試煙草品種為“云煙87” “K326”和“Beinhart1000-1”,由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所提供.播種于溫室花盆內(nèi),后移栽于溫室,常規(guī)管理,當(dāng)8~10片真葉完全展開時接種.供試菌株在PDA培養(yǎng)基上25 ℃培養(yǎng)7 d后待用.

    1.2 取 樣

    在煙草植株10葉期,選擇煙株下部未變黃的葉片接種菌餅,每張葉片上接種2個菌餅,接種3片葉片,接種后25 ℃保濕培養(yǎng),每天觀察葉片受病菌侵染后情況,感染后第6 d取樣,取接種葉片的上部第一片葉片,以接種前作空白對照,“云煙87”感染前(Y0d)、 “云煙87”感染后第6 d(Y6d)、 “K326”感染前(K0d)、 “K326”感染后第6 d(K6d)、 “Beinhart1000-1”感染前(B0d)和“Beinhart1000-1”感染后第6 d(B6d)共6個樣本.每個樣本稱取2 g葉片,樣品液氮速凍后-80 ℃保存?zhèn)溆茫?/p>

    1.3 雙向電泳

    取2 g葉片樣品液氮研磨成細(xì)粉狀,加入10 mL預(yù)冷的TCA-丙酮(1∶9),渦旋混勻,置于-20 ℃沉淀過夜,4 ℃離心40 min(6 000 r/min),棄上清.加入預(yù)冷丙酮,洗滌3次.通風(fēng)櫥中干燥沉淀.分別加入500 μL 2D裂解液(9.5 mol/L尿素,4% CHAPS,60 mmol/L DTT,體積分?jǐn)?shù)為2%的ampholytes,使用時每500 μL裂解液加入10 μL 50×Protein Inhibitor Cocktail Set I),震蕩混勻重懸沉淀,冰浴超聲處理(100 W,持續(xù)10 s,間隔8 s,重復(fù)8次),4 ℃離心30 min(12 000 r/min),取上清,使用Bradford 法進(jìn)行定量,測蛋白質(zhì)濃度后,分裝于-80 ℃冰箱保存.取處理好的蛋白樣品20 μL,使用12% 分離膠,5% 濃縮膠進(jìn)行SDS-PAGE,再經(jīng)考馬斯亮藍(lán)R-250染色檢測.

    分別取樣品100 μg,進(jìn)行雙向電泳,13 cm IPG預(yù)制膠條(pH值為3~10,非線性膠條),采用EttanTMIPGphorTM等電聚焦系統(tǒng)(GE Amersham)進(jìn)行等電聚焦,IPG膠條在水化緩沖液中再水化12 h,IEF分4步進(jìn)行: 30 V,12 h; 500 V,1 h; 1000 V,1 h; 8000 V,8 h.等電聚焦結(jié)束后,使用兩步法進(jìn)行平衡[11],然后轉(zhuǎn)移到12.5% SDS-聚丙烯酰胺凝膠上之后將條帶進(jìn)行第二維電泳.使用Hofer SE 600系統(tǒng)(GE Amersham)以15 mA/塊凝膠進(jìn)行電泳30 min,待樣品完全轉(zhuǎn)移出IPG膠條,加大電流至30 mA/塊凝膠,直到溴酚藍(lán)到達(dá)凝膠下沿0.5 cm處,電泳結(jié)束.

    電泳結(jié)束后取出凝膠,加入固定液(40% 乙醇,10% 冰醋酸)固定過夜,再加入浸泡液(30% 乙醇,6.8% NaAc,0.312% NaS2O3·5H2O)處理30 min,倒掉,用MilliQ水沖洗3次,每次5 min; 將清洗后的膠加入染色液(0.25 % 硝酸銀)中染色20 min,倒掉染色液,用MilliQ水沖洗2次,每次1 min; 放置于顯影液(2.5%無水碳酸鈉,0.04%甲醛)中顯色,直至蛋白質(zhì)點(diǎn)清晰可見,加入終止液(1.46% EDTA-2Na·2H2O),終止反應(yīng); 加入MilliQ水洗3次,每次5 min,再加入10%冰醋酸保存.

    1.4 圖像分析

    使用UMax Powerlook 2110XL(UMax)掃描染色的凝膠,并使用ImageMaster 2D Platinum(版本5.0,GE Amersham)完成圖像分析.手動驗(yàn)證每個配對斑點(diǎn)以確保在3份數(shù)據(jù)中產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)化點(diǎn)膠體之間的高度再現(xiàn)性.選擇重疊測量比以發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)表達(dá)變化,并且具有1.2倍或更大重疊率閾值過濾的蛋白質(zhì)被認(rèn)為是差異表達(dá)的.確定差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn),并從膠上挖取差異點(diǎn).

    1.5 MALDI-TOF/TOF分析及數(shù)據(jù)庫檢索

    1.5.1 膠內(nèi)酶解及Ziptip脫鹽

    將目標(biāo)蛋白點(diǎn)切下,裝入離心管中做好標(biāo)記,將膠粒切碎后加入50 μL銀染脫色液(銀染脫色液:V30 mmol/L鐵氰化鉀∶V100 mmol/L硫代硫酸鈉=1∶1混合)脫色,清洗脫色至透明,吸棄上清,再加入100 μL 100 mmol/L碳酸氫銨,室溫孵育15 min,吸棄上清凍干,之后加入5 μL 10 mg/L測序級Trypsin(胰蛋白酶,Promega)溶液,37 ℃反應(yīng)過夜(20 h左右); 將過夜消化的酶解液吸出,轉(zhuǎn)移至新的離心管中,在原管加入 100 μL 60% ACN/0.1% TFA,超聲溶解 15 min,合并酶解液凍干; 若有較多鹽分,則用 Ziptip(millipore)進(jìn)行脫鹽.首先用50% 的ACN濕潤吸嘴,再用60% ACN/0.1% TFA潤洗兩次,然后用吸嘴反復(fù)吸打樣品液,以除去鹽類和雜質(zhì),最后用60% ACN/0.1% TFA清洗吸嘴兩次,將所有溶液合并凍干.

    1.5.2 質(zhì)譜分析

    將凍干后的酶解樣品,取 2 μL 20% 乙腈復(fù)溶.取1 μL溶解后的樣品,直接點(diǎn)于樣品靶上,讓溶劑自然干燥后,再取 0.5 μL過飽和 CHCA 基質(zhì)溶液(溶劑為 50% ACN0.1% TFA)點(diǎn)至對應(yīng)靶位上并自然干燥.樣品靶經(jīng)氮?dú)獯祪舴湃雰x器進(jìn)靶槽并用串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜儀(5800 MALDI-TOF/TOF,AB SCIEX)進(jìn)行測試分析,激光源為355 nm波長的Nd: YAG激光器,加速電壓為2 kV,采用正離子模式和自動獲取數(shù)據(jù)的模式采集數(shù)據(jù),一級質(zhì)譜(MS)掃描范圍為800~4 000 Da,選擇信噪比大于50的母離子進(jìn)行二級質(zhì)譜(MS/MS)分析,每個樣品點(diǎn)上選擇8個母離子,二級質(zhì)譜(MS/MS)累計疊加2 500次,碰撞能量 2 kV,CID關(guān)閉.

    1.5.3 數(shù)據(jù)庫檢索

    質(zhì)譜測試原始文件用 Mascot 2.2 軟件檢索相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫,最后得到鑒定的蛋白質(zhì)結(jié)果.搜庫參數(shù)設(shè)置如下: Database: NCBI; Taxonomy: XXX; Type of search: Combined(MS+ MS/MS); Enzyme: Trypsin; Fixed modifications: Carbamidomethyl (C) ; Dynamical modifications: Oxidation(M); Mass values: Monoisotopic; Protein Mass: Unrestricted; Peptide Mass Tolerance: ± 100×10-6; Fragment Mass Tolerance: ± 0.4 Da; Peptide Charge State: 1+; Max Missed Cleavages: 1.

    2 結(jié)果與分析

    2.1 蛋白質(zhì)定量及SDS-PAGE電泳檢測

    對提取的樣品使用Bradford法進(jìn)行蛋白質(zhì)含量測定,樣品質(zhì)量濃度見表1,并進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢

    圖1 煙葉樣品蛋白SDS-PAGE電泳圖

    測(圖1),根據(jù)結(jié)果顯示“云煙87”對照(Y0d)濃度較低,后續(xù)雙向電泳上樣量為100 μg,根據(jù)樣品質(zhì)量濃度計算雙向電泳上樣體積.

    表1 煙葉樣品的蛋白質(zhì)量濃度

    2.2 雙向電泳圖譜及差異點(diǎn)分析

    將提取的蛋白進(jìn)行雙向電泳分析,使用pH值為3~10,13 cm的IPG預(yù)制膠條,蛋白上樣量為100 μg,雙向電泳銀染結(jié)果見圖2,提取的蛋白在各pH段都有分布,蛋白質(zhì)點(diǎn)較清晰,分離較好.

    將蛋白質(zhì)凝膠雙向電泳圖譜經(jīng)Image Master軟件分析,通過比較感染前和感染后第6 d的雙向電泳圖譜,檢測差異蛋白點(diǎn)(圖3).比較B6d和B0d膠圖有41個表達(dá)差異明顯的蛋白質(zhì)點(diǎn),比較K6d和K0d膠圖有46個表達(dá)差異明顯的蛋白質(zhì)點(diǎn),比較Y6d和Y0d膠圖有61個表達(dá)差異明顯的蛋白質(zhì)點(diǎn),共有148個表達(dá)差異明顯的蛋白質(zhì)點(diǎn).根據(jù)軟件分析結(jié)果,結(jié)合電泳圖譜,共選取48個表達(dá)差異顯著的蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析,其中上調(diào)表達(dá)的蛋白33個,下調(diào)表達(dá)的蛋白15個,具體見表2.

    2.3 差異表達(dá)蛋白點(diǎn)的質(zhì)譜鑒定

    對選取的48個差異蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定,成功鑒定出38個蛋白質(zhì)點(diǎn)(質(zhì)譜匹配肽段得分高于60,并且匹配得分可信度大于95%),結(jié)果見表3,其中上調(diào)表達(dá)蛋白28個,下調(diào)表達(dá)蛋白10個.根據(jù)這38個蛋白所參與的代謝途徑和生化功能將它們歸納成以下類群: 碳代謝途徑相關(guān)的蛋白質(zhì)有甘油醛-3-磷酸脫氫酶(B308,K328)和羧甲烯丁烯羥酸內(nèi)酯酶同系物(B559); 光合作用相關(guān)的蛋白質(zhì)包括鐵氧還蛋白酶還原酶(B412,Y607),PsbP結(jié)構(gòu)域蛋白6(B619),類囊體腔15kDa蛋白1(B889),葉綠素a-b結(jié)合蛋白8(K581),類PsbP蛋白1(K774),果糖二磷酸醛縮酶1(Y537),類囊體內(nèi)腔19 kDa蛋白(Y875)和1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RuBisCo)相關(guān)蛋白(K820,Y440,Y462,Y1172); 能量代謝相關(guān)的蛋白質(zhì)包括類DNA甲基化因子4(B728),磷酸甘油酸激酶(K270),蘋果酸脫氫酶(K342,Y579),PNSL5(K742),ATP 合成酶CF1ε亞基(K789),磷酸甘油酸激酶(Y449)和碳酸酐酶(Y769); 防御相關(guān)的蛋白質(zhì)包括過氧化物酶N1(K421),谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(K607),PR-5(K633),GGAT(Y331),PP2-B11(Y1039)和銅/鋅超氧化物歧化酶(Y1088); 蛋白合成相關(guān)的蛋白質(zhì)包括2-亞甲基-3-呋喃酮還原酶(B330,Y535,Y538)和FKBP19(Y958); 同時還有5個未知蛋白(B319,B531,K409,K427,Y637).

    圖2 煙葉樣品蛋白雙向電泳圖(13 cm,pH=3~10,12.5% SDS-PAGE)

    圖3 雙向電泳圖譜差異點(diǎn)分析

    表2 差異點(diǎn)選取

    續(xù)表2

    表3 差異表達(dá)蛋白的MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜結(jié)果

    3 討 論

    甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)是糖酵解反應(yīng)中一種非常關(guān)鍵的酶,常用作研究其他基因和蛋白表達(dá)的內(nèi)參.隨著研究的深入,越來越多的試驗(yàn)證實(shí)GAPDH蛋白功能的多樣性,如GAPDH在植物中與各種環(huán)境的壓力表現(xiàn)出抗逆性有關(guān)[12].有研究人員在分子水平上檢測到馬鈴薯的GAPDH基因受病原物侵染誘導(dǎo)表達(dá)[13],并且在致病疫霉侵染馬鈴薯最初的24 h內(nèi)就有反應(yīng)[14],本研究鑒定到的兩個甘油醛-3-磷酸脫氫酶(B308,K328)在受到病原菌侵染后均上調(diào)表達(dá),也進(jìn)一步在蛋白水平上驗(yàn)證了GAPDH蛋白在病原菌侵染過程中發(fā)揮作用,另外,根據(jù)結(jié)果也可以得出在研究病菌侵染過程中GAPDH基因不適合作為基因表達(dá)的內(nèi)參.

    本研究共鑒定到12個與光合作用有關(guān)的蛋白質(zhì),其中有8個上調(diào)表達(dá)的蛋白: 鐵氧還蛋白酶還原酶(B412,Y607),PsbP結(jié)構(gòu)域蛋白6(B619),果糖二磷酸醛縮酶1(Y537),類囊體內(nèi)腔19 kDa蛋白(Y875),1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RuBisCo)相關(guān)蛋白(Y440,Y462,Y1172); 4個下調(diào)表達(dá)的蛋白: 類囊體腔15kDa蛋白1(B889),葉綠素a-b結(jié)合蛋白8(K581),類PsbP蛋白1(K774)和1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶小亞基(K820).其中1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RuBisCo)是光合作用中的一個關(guān)鍵酶,本研究發(fā)現(xiàn)4個RuBisCo相關(guān)蛋白,其中在“K326”中鑒定到的1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶小亞基在被赤星病菌侵染后下調(diào)表達(dá),“云煙87”中有2個二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶2和1個二磷酸核酮糖羧化酶小鏈在被赤星病菌侵染后上調(diào)表達(dá).光合作用是植物中最重要的代謝過程,赤星病侵染顯著影響光合作用的速率,RuBisCo作為光合作用中的一個關(guān)鍵酶,其表達(dá)量增加會增強(qiáng)光合作用以供給更多能量從而抵抗病毒侵染,而酶的減少表明植株在受到病菌侵染后光合作用下降,同時部分蛋白開始降解,植株開始逐漸衰弱,進(jìn)一步降低了對病原菌的抵抗能力,從而加速了植株的發(fā)病,這也表明了“云煙87”和“K326”對赤星病侵染的抗性不同.

    本研究共鑒定到能量代謝相關(guān)的蛋白質(zhì)8個,其中有6個上調(diào)表達(dá)的蛋白: 類DNA甲基化因子4(B728),磷酸甘油酸激酶(K270),蘋果酸脫氫酶(Y579),PNSL5(K742),磷酸甘油酸激酶(Y449),碳酸酐酶(Y769); 2個下調(diào)表達(dá)的蛋白蘋果酸脫氫酶(K342)和ATP 合成酶CF1ε亞基(K789).ATP合成酶是參與能量代謝的關(guān)鍵酶,有研究提出病原菌的侵染初期,作為細(xì)胞內(nèi)能量轉(zhuǎn)換核心酶的ATPase下調(diào)表達(dá),表明煙草在被侵染初期電子傳遞和能量傳遞能力減弱,即在病原物侵染初期某些生理途徑被病原菌破壞,或被病原菌產(chǎn)生的降解酶和毒素抑制從而降低植株呼吸作用強(qiáng)度,觸發(fā)植物的主動抗病機(jī)制,是植株主動防御機(jī)制起作用的必要過程[15].

    本研究共鑒定到防御相關(guān)的蛋白質(zhì)6個,其中有4個上調(diào)表達(dá)的蛋白: 過氧化物酶N1(K421),谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(K607),PR-5(K633)和GGAT(Y331); 2個下調(diào)表達(dá)的蛋白PP2-B11(Y1039)和銅/鋅超氧化物歧化酶(Y1088).研究表明,在植物受到外界脅迫時,植株體內(nèi)的GST活性會顯著升高,以保護(hù)生物體免受逆境的損害[16].本研究也鑒定到了谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(K607)在感染赤星病后上調(diào)表達(dá),與前期研究一致.本研究還鑒定到一個感染赤星病后上調(diào)表達(dá)的osmotin-like protein(K633)類滲調(diào)蛋白(OLP),它屬于PR-5蛋白.PR-5蛋白包含了具有多種抗逆功能的滲調(diào)蛋白(osmotin)和類滲調(diào)蛋白(OLP).有研究表明,馬鈴薯被致病疫霉(P.infestans)感染后能檢測到OLP蛋白的增加[17].PR-5蛋白具有抗真菌、 抗凍和抗?jié)B透壓力等多種生物學(xué)活性,參與植物系統(tǒng)獲得性反應(yīng)(SAR)和超敏反應(yīng)(HR),在植物抵御生物和非生物脅迫中具有重要作用[18].當(dāng)受到病原侵害時植物可以產(chǎn)生系統(tǒng)獲得性抗性,發(fā)生系統(tǒng)獲得性抗性過程時植物的細(xì)胞內(nèi)會發(fā)生一系列的生理生化反應(yīng),其中就包括PR蛋白表達(dá).

    綜上所述,在本研究中,接種病菌后煙草葉片中參與各個代謝過程的相關(guān)蛋白并不是呈現(xiàn)單一的變化趨勢,煙草的抗性機(jī)制是十分復(fù)雜的,涉及大量基因的誘導(dǎo)表達(dá)與調(diào)控,這些基因的表達(dá)結(jié)果往往導(dǎo)致蛋白質(zhì)的變化.本研究得到了煙草對赤星病菌應(yīng)答網(wǎng)絡(luò)中表達(dá)量發(fā)生顯著變化的差異蛋白,但所得到的差異蛋白在應(yīng)答機(jī)制中的具體作用有待進(jìn)一步的深入研究.總之,煙草對赤星病抗性機(jī)制復(fù)雜,其中涉及眾多的信號物質(zhì)和抗性相關(guān)蛋白,隨著蛋白質(zhì)組學(xué)等技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用,將會有更多的抗性相關(guān)基因和蛋白被挖掘,進(jìn)而大大提高人們對煙草與赤星菌互作機(jī)理的認(rèn)識.

    猜你喜歡
    赤星二磷酸侵染
    揭示水霉菌繁殖和侵染過程
    幾種藥劑對煙草赤星病的防治效果
    中國赤星衣屬一新種和一新記錄種(茶漬目:赤星衣科)
    廣西植物(2021年1期)2021-03-24 18:30:12
    PARP 抑制劑在BRCA 胚系突變?nèi)橄侔┲委熤械难芯窟M(jìn)展
    淺談煙草赤星病的防治
    二磷酸果糖用于小兒先天性心臟病伴心力衰竭治療中的效果分析
    煙草品種和打頂時期對煙草赤星病發(fā)病情況的影響
    蕓薹根腫菌侵染過程及影響因子研究
    甘藍(lán)根腫病菌休眠孢子的生物學(xué)特性及侵染寄主的顯微觀察
    1,6-二磷酸果糖對體外循環(huán)冠狀動脈旁路移植術(shù)患者肺功能保護(hù)作用的研究
    久久精品aⅴ一区二区三区四区 | 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 99热全是精品| 国产成人欧美| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 欧美成人午夜精品| 18+在线观看网站| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 高清不卡的av网站| 日日摸夜夜添夜夜爱| 咕卡用的链子| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 丝袜脚勾引网站| 激情视频va一区二区三区| 黄色 视频免费看| videos熟女内射| 久热这里只有精品99| 久久精品国产亚洲av涩爱| av女优亚洲男人天堂| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 午夜精品国产一区二区电影| 亚洲成色77777| a级毛片在线看网站| 一级片'在线观看视频| 又黄又粗又硬又大视频| 精品一区二区三卡| 国产黄色免费在线视频| 综合色丁香网| 飞空精品影院首页| 亚洲成色77777| 亚洲国产av新网站| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 高清在线视频一区二区三区| 黄频高清免费视频| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 一个人免费看片子| 永久网站在线| 精品久久蜜臀av无| 亚洲欧美一区二区三区国产| 国产伦理片在线播放av一区| 色94色欧美一区二区| 国产日韩欧美在线精品| 美女国产视频在线观看| 香蕉国产在线看| 中文字幕人妻熟女乱码| 亚洲综合色惰| 大码成人一级视频| 久久久久久久精品精品| 99久久精品国产国产毛片| 麻豆乱淫一区二区| 97在线人人人人妻| 国产精品香港三级国产av潘金莲 | 精品少妇久久久久久888优播| 女性被躁到高潮视频| 亚洲图色成人| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 精品国产一区二区久久| 2021少妇久久久久久久久久久| 在线观看人妻少妇| 亚洲一码二码三码区别大吗| 国产精品免费大片| 最近2019中文字幕mv第一页| 久久精品国产综合久久久| 热99久久久久精品小说推荐| 黄色 视频免费看| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 久久久久久人妻| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 人妻 亚洲 视频| 国产精品香港三级国产av潘金莲 | 国产不卡av网站在线观看| 成年女人在线观看亚洲视频| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 国产免费又黄又爽又色| 日本91视频免费播放| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 高清欧美精品videossex| 99久国产av精品国产电影| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 一级毛片电影观看| 国产高清国产精品国产三级| 午夜免费鲁丝| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 日本av免费视频播放| 欧美xxⅹ黑人| 母亲3免费完整高清在线观看 | 欧美精品av麻豆av| 人人澡人人妻人| 一区二区三区激情视频| 老女人水多毛片| 1024香蕉在线观看| 国产男女超爽视频在线观看| 叶爱在线成人免费视频播放| 男女边摸边吃奶| 少妇人妻久久综合中文| 各种免费的搞黄视频| 国产一区二区三区av在线| 国产精品 国内视频| 亚洲精品自拍成人| 国产熟女午夜一区二区三区| 久久久久人妻精品一区果冻| 99久久综合免费| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 久久久久久免费高清国产稀缺| 1024香蕉在线观看| 久久免费观看电影| 国产精品成人在线| 男人操女人黄网站| 亚洲天堂av无毛| 国产一区二区在线观看av| 9色porny在线观看| 国产老妇伦熟女老妇高清| 久久久久久人人人人人| 秋霞伦理黄片| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 啦啦啦啦在线视频资源| 久久国产精品大桥未久av| 精品午夜福利在线看| 亚洲精品日本国产第一区| 少妇的逼水好多| 91国产中文字幕| 一区二区av电影网| 亚洲天堂av无毛| 国产精品 欧美亚洲| 男男h啪啪无遮挡| 国产精品久久久久成人av| 国产精品久久久久久精品电影小说| 又黄又粗又硬又大视频| 亚洲四区av| 一区二区三区激情视频| av在线app专区| 亚洲中文av在线| 国产极品天堂在线| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 青春草国产在线视频| 大香蕉久久网| 国产亚洲欧美精品永久| 国产成人欧美| 成人毛片60女人毛片免费| 成人影院久久| 国产野战对白在线观看| 中文欧美无线码| 高清不卡的av网站| 日韩欧美一区视频在线观看| 亚洲美女视频黄频| 久久精品夜色国产| 欧美最新免费一区二区三区| av天堂久久9| 国产爽快片一区二区三区| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 国产精品免费大片| 韩国精品一区二区三区| 老鸭窝网址在线观看| 黄片播放在线免费| 一个人免费看片子| 美女脱内裤让男人舔精品视频| av.在线天堂| 亚洲av日韩在线播放| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 2021少妇久久久久久久久久久| 国产又色又爽无遮挡免| 一级毛片 在线播放| 亚洲精品国产av成人精品| 欧美变态另类bdsm刘玥| 日本vs欧美在线观看视频| 热99国产精品久久久久久7| kizo精华| 日韩大片免费观看网站| 一级a爱视频在线免费观看| 亚洲男人天堂网一区| 搡女人真爽免费视频火全软件| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 成人免费观看视频高清| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 超碰97精品在线观看| 国产精品一区二区在线观看99| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 久久精品国产a三级三级三级| 亚洲精品aⅴ在线观看| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 青青草视频在线视频观看| 国产精品免费视频内射| 伦精品一区二区三区| 日韩制服骚丝袜av| 久久精品久久久久久久性| 国产有黄有色有爽视频| 又大又黄又爽视频免费| 美女国产视频在线观看| 两个人看的免费小视频| 亚洲一区中文字幕在线| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 极品少妇高潮喷水抽搐| 免费少妇av软件| 国产在线免费精品| 亚洲,欧美,日韩| 人妻系列 视频| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 亚洲,欧美精品.| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 成人国语在线视频| 最近中文字幕高清免费大全6| 免费日韩欧美在线观看| 天堂俺去俺来也www色官网| 美女中出高潮动态图| 国产成人一区二区在线| 午夜日本视频在线| av一本久久久久| 99热全是精品| a级片在线免费高清观看视频| 日韩av在线免费看完整版不卡| 最近最新中文字幕免费大全7| 国产亚洲欧美精品永久| 亚洲欧美一区二区三区国产| 乱人伦中国视频| 精品少妇黑人巨大在线播放| 久久99一区二区三区| 精品国产一区二区久久| 久久国产亚洲av麻豆专区| 激情视频va一区二区三区| av在线老鸭窝| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 日韩中字成人| 国产精品成人在线| 制服人妻中文乱码| 欧美精品亚洲一区二区| 久久久久久人妻| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 制服丝袜香蕉在线| 日本色播在线视频| 免费av中文字幕在线| 亚洲国产色片| 精品亚洲成国产av| 久久久久精品人妻al黑| 亚洲一区二区三区欧美精品| 亚洲综合色网址| 99久国产av精品国产电影| 亚洲美女搞黄在线观看| 午夜福利一区二区在线看| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 国产国语露脸激情在线看| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 婷婷色av中文字幕| 日本黄色日本黄色录像| 人人妻人人澡人人看| 亚洲国产精品一区三区| 99久久精品国产国产毛片| 午夜精品国产一区二区电影| 亚洲,欧美,日韩| 日韩伦理黄色片| 亚洲国产欧美网| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 亚洲经典国产精华液单| 两个人看的免费小视频| 国产成人午夜福利电影在线观看| 少妇的丰满在线观看| 国产精品蜜桃在线观看| 街头女战士在线观看网站| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 成人免费观看视频高清| av在线播放精品| 赤兔流量卡办理| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 久久久久久人人人人人| 中文欧美无线码| 在现免费观看毛片| 国产淫语在线视频| 夫妻性生交免费视频一级片| 丝袜人妻中文字幕| 日本爱情动作片www.在线观看| 纯流量卡能插随身wifi吗| 久久毛片免费看一区二区三区| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 久久久久国产一级毛片高清牌| 亚洲,一卡二卡三卡| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 成年动漫av网址| 天堂中文最新版在线下载| 美女国产视频在线观看| 黄色毛片三级朝国网站| www.自偷自拍.com| 女性生殖器流出的白浆| 最黄视频免费看| 中文字幕av电影在线播放| 涩涩av久久男人的天堂| 男女啪啪激烈高潮av片| 精品少妇久久久久久888优播| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 多毛熟女@视频| 亚洲国产成人一精品久久久| 国产免费福利视频在线观看| 激情五月婷婷亚洲| 欧美日韩av久久| 尾随美女入室| 国产一区二区三区av在线| 91在线精品国自产拍蜜月| 成人二区视频| www.av在线官网国产| 中文欧美无线码| 午夜福利视频精品| 丁香六月天网| 男女啪啪激烈高潮av片| 日本爱情动作片www.在线观看| 久久久a久久爽久久v久久| 天堂中文最新版在线下载| 大片免费播放器 马上看| 久久久久精品人妻al黑| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 久热这里只有精品99| 国产精品人妻久久久影院| 伊人久久国产一区二区| 久久久久久伊人网av| 国产精品人妻久久久影院| 熟妇人妻不卡中文字幕| 91aial.com中文字幕在线观看| 亚洲五月色婷婷综合| 久久99一区二区三区| 亚洲精品国产av成人精品| 久久女婷五月综合色啪小说| 国产免费一区二区三区四区乱码| 夫妻性生交免费视频一级片| 久久精品国产综合久久久| 精品酒店卫生间| 久久久久久久精品精品| 久久久久精品人妻al黑| av在线播放精品| 国产精品二区激情视频| xxxhd国产人妻xxx| 久久久久国产网址| 久久97久久精品| 精品少妇黑人巨大在线播放| 精品少妇久久久久久888优播| 欧美激情 高清一区二区三区| www.熟女人妻精品国产| 男女无遮挡免费网站观看| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 国产乱人偷精品视频| 日本色播在线视频| 纯流量卡能插随身wifi吗| 欧美日韩视频精品一区| 黄色 视频免费看| 制服诱惑二区| 久久久久久久大尺度免费视频| 免费高清在线观看视频在线观看| 在线观看www视频免费| 日韩av在线免费看完整版不卡| 欧美日韩精品网址| 日韩人妻精品一区2区三区| 在现免费观看毛片| av网站免费在线观看视频| 在线 av 中文字幕| 精品人妻偷拍中文字幕| 一边摸一边做爽爽视频免费| 在线观看免费日韩欧美大片| 999精品在线视频| 黄片无遮挡物在线观看| 国产精品蜜桃在线观看| 搡女人真爽免费视频火全软件| 成年av动漫网址| 免费在线观看黄色视频的| 丝袜在线中文字幕| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 日日啪夜夜爽| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 久久久国产欧美日韩av| 性少妇av在线| 婷婷色av中文字幕| 亚洲一码二码三码区别大吗| 97在线视频观看| 久久精品国产亚洲av天美| 91国产中文字幕| 午夜福利影视在线免费观看| 在线观看一区二区三区激情| a级毛片在线看网站| 亚洲精品久久午夜乱码| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 叶爱在线成人免费视频播放| 久久久精品94久久精品| 久久人人97超碰香蕉20202| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 毛片一级片免费看久久久久| 国产精品国产av在线观看| 亚洲美女视频黄频| 国产日韩欧美视频二区| 久久精品国产亚洲av高清一级| 久久午夜福利片| 黄片小视频在线播放| av网站在线播放免费| 国产一级毛片在线| 成年av动漫网址| 久久久久网色| 日本-黄色视频高清免费观看| 国产综合精华液| 老汉色∧v一级毛片| 大话2 男鬼变身卡| 大片免费播放器 马上看| 欧美+日韩+精品| www.熟女人妻精品国产| 在线观看一区二区三区激情| 中文字幕人妻熟女乱码| 久久久久久免费高清国产稀缺| 日韩人妻精品一区2区三区| a级毛片黄视频| 最近中文字幕2019免费版| 亚洲精品久久午夜乱码| 久久亚洲国产成人精品v| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 久久精品国产亚洲av天美| 国产一区二区三区av在线| 久久人人爽人人片av| 午夜日本视频在线| 9热在线视频观看99| 香蕉丝袜av| 亚洲色图综合在线观看| 久久鲁丝午夜福利片| 黑人欧美特级aaaaaa片| 高清在线视频一区二区三区| 91aial.com中文字幕在线观看| 免费黄色在线免费观看| 高清黄色对白视频在线免费看| 亚洲四区av| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 亚洲色图综合在线观看| 午夜福利,免费看| 夫妻午夜视频| 亚洲国产看品久久| 最近最新中文字幕免费大全7| 午夜精品国产一区二区电影| 18在线观看网站| 日本欧美国产在线视频| 大香蕉久久网| 中文字幕最新亚洲高清| videos熟女内射| 国产 一区精品| 国产精品久久久久久精品电影小说| 国产免费现黄频在线看| 丰满迷人的少妇在线观看| 在线观看一区二区三区激情| 日本av免费视频播放| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 高清av免费在线| 九九爱精品视频在线观看| 亚洲精品自拍成人| 中文字幕最新亚洲高清| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 国产一区二区在线观看av| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 91aial.com中文字幕在线观看| 秋霞在线观看毛片| 老鸭窝网址在线观看| 精品久久久精品久久久| 国产成人精品无人区| 秋霞在线观看毛片| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 嫩草影院入口| 大陆偷拍与自拍| 曰老女人黄片| 午夜av观看不卡| 自线自在国产av| 国产一区亚洲一区在线观看| 秋霞伦理黄片| 国产激情久久老熟女| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 高清在线视频一区二区三区| 午夜av观看不卡| 女性被躁到高潮视频| 成人亚洲精品一区在线观看| 久久99热这里只频精品6学生| 久久婷婷青草| 日本vs欧美在线观看视频| 另类精品久久| 老鸭窝网址在线观看| 亚洲精品久久午夜乱码| 18+在线观看网站| 男女边吃奶边做爰视频| 精品国产一区二区三区四区第35| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 另类精品久久| 精品福利永久在线观看| 国产精品久久久久成人av| 国产在线视频一区二区| 国产精品人妻久久久影院| 亚洲五月色婷婷综合| 久久国产精品大桥未久av| 最近中文字幕高清免费大全6| 久久毛片免费看一区二区三区| 国产精品亚洲av一区麻豆 | 亚洲一区中文字幕在线| 久久99一区二区三区| 在线 av 中文字幕| 久久99一区二区三区| 亚洲国产精品成人久久小说| 成人毛片60女人毛片免费| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 久久99一区二区三区| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 女性生殖器流出的白浆| 国产综合精华液| 国产成人午夜福利电影在线观看| av一本久久久久| 两个人免费观看高清视频| 十分钟在线观看高清视频www| 男女午夜视频在线观看| 欧美精品国产亚洲| h视频一区二区三区| 国产精品人妻久久久影院| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 久久综合国产亚洲精品| 在线精品无人区一区二区三| 久久 成人 亚洲| 亚洲成色77777| 亚洲综合精品二区| 人体艺术视频欧美日本| 精品卡一卡二卡四卡免费| 香蕉丝袜av| 丝袜脚勾引网站| 亚洲美女黄色视频免费看| 18禁动态无遮挡网站| 欧美日韩一级在线毛片| 久久人人97超碰香蕉20202| av福利片在线| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 一区在线观看完整版| 国产爽快片一区二区三区| 日韩大片免费观看网站| 秋霞伦理黄片| 国产精品女同一区二区软件| 成年人免费黄色播放视频| 日日爽夜夜爽网站| 国产高清不卡午夜福利| 成年人午夜在线观看视频| 老鸭窝网址在线观看| 午夜激情av网站| av.在线天堂| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 成年美女黄网站色视频大全免费| 一级a爱视频在线免费观看| 91aial.com中文字幕在线观看| 男人舔女人的私密视频| 色吧在线观看| 精品亚洲成a人片在线观看| 色婷婷av一区二区三区视频| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 看非洲黑人一级黄片| 国产深夜福利视频在线观看| 精品国产一区二区久久| 高清在线视频一区二区三区| 少妇人妻久久综合中文| 久久精品国产亚洲av天美| 少妇人妻久久综合中文| 丝袜喷水一区| 欧美精品国产亚洲| 考比视频在线观看| 黑人欧美特级aaaaaa片| 国产一区二区激情短视频 | 欧美日韩成人在线一区二区| 亚洲国产毛片av蜜桃av| av国产精品久久久久影院| 亚洲av欧美aⅴ国产| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 免费少妇av软件| av在线播放精品| 国产精品 国内视频| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 亚洲av男天堂| 国产又爽黄色视频| 黑人猛操日本美女一级片| av卡一久久| 精品少妇黑人巨大在线播放| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 日韩免费高清中文字幕av| 电影成人av| 日韩精品有码人妻一区| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 制服人妻中文乱码| 亚洲经典国产精华液单| 老司机亚洲免费影院| 国产极品天堂在线| 纯流量卡能插随身wifi吗| 99久久中文字幕三级久久日本| 日韩视频在线欧美| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 十八禁网站网址无遮挡| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 男的添女的下面高潮视频| 丰满饥渴人妻一区二区三| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 欧美精品高潮呻吟av久久| 一边亲一边摸免费视频| 国产成人一区二区在线| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 男女下面插进去视频免费观看| 韩国高清视频一区二区三区| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 伦理电影免费视频| 性高湖久久久久久久久免费观看| 在现免费观看毛片| 国产精品偷伦视频观看了| 999精品在线视频| 一区二区av电影网| 一级爰片在线观看| 久久影院123| 美女高潮到喷水免费观看| 咕卡用的链子| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 天堂俺去俺来也www色官网| 人人妻人人澡人人看|