生物傳感檢測獨(dú)腳金內(nèi)酯的研究與展望

方 園,姚瑞楓

(湖南大學(xué)生物學(xué)院化學(xué)生物傳感與計(jì)量學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室植物功能基因組學(xué)與發(fā)育調(diào)控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,中國湖南長沙410082)

植物激素獨(dú)腳金內(nèi)酯(strigolactones,SLs)是一類由類胡蘿卜素衍生的萜類內(nèi)酯。SL最初被認(rèn)為是根際寄生雜草如獨(dú)腳金屬(Striga spp.)的萌發(fā)刺激物[1],隨后被鑒定為叢枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi,AMF)的根源共生信號[2]。直至2008年,SL被鑒定為一種新型植物激素,參與抑制植物分枝的過程[3～4]。SL由全反式-β-胡蘿卜素經(jīng)過一系列酶催化加工而來,主要在植物根部合成,并被運(yùn)輸?shù)窖炕蚍置诘礁H。目前已鑒定的植物內(nèi)源性(天然)SL在化學(xué)結(jié)構(gòu)上都包含1個(gè)三環(huán)內(nèi)酯(ABC-ring)和1個(gè)由烯醇醚鍵連接在一起的單環(huán)內(nèi)酯(D-ring)。目前有30種以上天然SL分子在不同植物中被發(fā)現(xiàn)[5～6],不同形式的天然SL的區(qū)別主要是ABC-ring上不同形式或位置的基團(tuán)修飾,但是D-ring嚴(yán)格保持不變[7]。如圖1所示,根據(jù)其是否具有完整的ABC-ring三環(huán)結(jié)構(gòu),SLs可分為典型和非典型兩大類；根據(jù)C-ring的立體化學(xué)性不同,典型SLs又可分為獨(dú)角金屬(strigol-type)和列當(dāng)屬(orobanchol-type)兩類[8～9]。

圖1 天然的獨(dú)腳金內(nèi)酯及其合成類似物的結(jié)構(gòu)和分類Fig.1 Structures and classification of natural SLs and synthetic SL analogs

研究發(fā)現(xiàn),SL不僅可以調(diào)控植物的生長發(fā)育過程,包括誘導(dǎo)次生生長、加速葉片衰老、刺激節(jié)間生長和根系伸長,抑制腋芽的生長、不定根和側(cè)根的形成等[10],還能介導(dǎo)植物對營養(yǎng)匱乏和病原菌等逆境脅迫的抗性反應(yīng)[11]。寄生雜草獨(dú)腳金屬和列當(dāng)屬植物利用SL促進(jìn)自身種子萌發(fā)并寄生于宿主植物根部,威脅宿主的生存。該類植物可寄生大多數(shù)主要糧食作物,在世界范圍內(nèi)感染了超過6千萬公頃農(nóng)田,因此導(dǎo)致每年上百億美元的經(jīng)濟(jì)損失,影響世界糧食安全[12]?，F(xiàn)已開發(fā)出一些SL受體激動(dòng)劑和拮抗劑用于寄生雜草控制[13～16],其也可用于調(diào)節(jié)植物株型,通過改善農(nóng)作物農(nóng)藝性狀而提高產(chǎn)量[17～19]。此外,SL還可用作植物-微生物共生調(diào)節(jié)劑,通過促進(jìn)菌根共生,提高農(nóng)作物在逆境時(shí)的產(chǎn)量。

雖然SL的生物合成、運(yùn)輸和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制已取得了一系列的突破進(jìn)展[9,20～21],但是SL在調(diào)控植物生長發(fā)育機(jī)制及其與其他激素的交互作用方面還有待進(jìn)一步研究,可能還有新的未鑒定的SL或有農(nóng)業(yè)價(jià)值的類似物,SL化學(xué)合成體系也仍需進(jìn)一步開發(fā)完善[22],這些工作都依賴于SL定量檢測方法學(xué)的輔助。植物激素在植物體內(nèi)含量很低(通常約pg/g鮮重),豐度高的其他化合物可能對檢測結(jié)果造成顯著干擾,且當(dāng)這些干擾物與靶標(biāo)分析物具有相似結(jié)構(gòu)或物化性質(zhì)時(shí),對檢測結(jié)果的影響更大。另外,植物基質(zhì)的高度復(fù)雜性,激素的化學(xué)、光和溫度穩(wěn)定性等也增加了分析的難度。相較于其他植物激素,SL在根部分泌物中或植物體內(nèi)濃度極低[23]。而且,由于烯醇醚鍵不穩(wěn)定,SL即使在溫和的環(huán)境下也易被剪切或水解[24],在純化過程中很不穩(wěn)定[25]。因此,植物激素特別是SL的定性和定量分析一直是研究難點(diǎn)。

目前,SL的定量檢測主要依賴氣相色譜(gas chromatography,GC)或高效液相色譜(high-performance liquid chromatography,HPLC)與串聯(lián)質(zhì)譜(tandem mass spectrometry,MS/MS)技術(shù)聯(lián)用,這些基于譜學(xué)的檢測方法具有高準(zhǔn)確度和高靈敏度[26～29]。但是,此類方法在很大程度上依賴于中心化的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備和經(jīng)驗(yàn)豐富的操作人員,操作繁瑣、耗時(shí)長、價(jià)格高,不適用于原位檢測和實(shí)時(shí)測定[30～32]。另外,雖然快速取樣使色譜分析能夠提供時(shí)間分辨率,但是由于提取物反映的是一個(gè)器官(如葉片)中眾多細(xì)胞的激素濃度平均值,因此無法提供激素水平的空間分辨率,如濃度梯度分布[30]。研發(fā)具有較高的靈敏度、特異性和時(shí)空分辨率的SL快速檢測方法,對于深入闡明SL感知和信號傳遞機(jī)制、調(diào)控植物生長發(fā)育及對環(huán)境變化的響應(yīng)機(jī)制等十分重要。

1 生物傳感器

生物傳感器是一種對特定生物物質(zhì)敏感,并可將其濃度轉(zhuǎn)換為定量信號的分析工具或系統(tǒng)。如圖2所示,生物傳感器由生物敏感材料識別器(bioreceptor)、換能器(transducer)和信號讀取系統(tǒng)構(gòu)成[33]。其中,接受器/識別器需要與換能器具有直接空間連接,而標(biāo)記物(label)可以被認(rèn)為是換能器或換能器的一部分。生物傳感器的分類方式較多,主要依據(jù)識別元件(如酶、抗體、適配體、分子印跡聚合物等)或者換能器(如電極、熱電偶、光電管等)進(jìn)行分類。此外,也依據(jù)生物傳感器的特性(如微流控)進(jìn)行分類,或以檢測對象進(jìn)行分類。

圖2 生物傳感器示意圖MIP:分子印跡聚合物；AuNP:金納米顆粒；MNP:磁性納米顆粒。Fig.2 Schematic representation of a biosensorMIP:Molecular imprinting polymer；AuNP:Au nanoparticle；MNP:Magnetic nanoparticle.

生物傳感器具有操作簡便、響應(yīng)快速、價(jià)格低廉、可選擇性高、可重復(fù)性高、穩(wěn)定、特異性好、線性度高等諸多優(yōu)點(diǎn)[32～33],為靈敏、特異性定量檢測SL提供了一種新思路?；谏鲜鲋T多優(yōu)點(diǎn),生物傳感器已被廣泛應(yīng)用于環(huán)境監(jiān)測、疾病檢測、食品安全、藥物開發(fā)等眾多領(lǐng)域[33]。生物傳感器也廣泛應(yīng)用于小分子如植物激素[34～42]的特異性識別和定量檢測(表 1)。

表1 生物傳感器在植物激素檢測中的應(yīng)用Table 1 Typical application of biosensors in phytohormone detection

基于酶識別的生物傳感器靈敏度高、特異性強(qiáng)、反應(yīng)迅速,可以在復(fù)雜的生物介質(zhì)(如細(xì)胞裂解液和血液)中直接對靶標(biāo)進(jìn)行定量檢測[43]。然而目前只有有限的分析物(如葡萄糖、乙醇、乙酰膽堿)可用作定量檢測體系中酶的底物,且酶對溫度敏感、保質(zhì)期短,因此酶傳感器在植物激素檢測中的應(yīng)用較少。另一類常見的生物傳感策略為免疫檢測,即以抗體作為識別元件檢測抗原?？贵w可以高親和力地結(jié)合特定分析物,在復(fù)雜的生物樣本中實(shí)現(xiàn)高靈敏度的分析物檢測。但是,抗體制備周期長、費(fèi)用高、對小分子物質(zhì)識別能力有限,限制了相關(guān)策略在植物激素生物傳感器方面的應(yīng)用[32]。分子印跡聚合物(molecular imprinting polymer,MIP)也是一種用于生物傳感器的識別元件。MIP是在聚合物材料中引入分子識別位點(diǎn)產(chǎn)生的在空間上與特定模板分子相匹配的、具有高選擇性的高分子化合物。MIP與模板分子的結(jié)合類似于抗體-抗原反應(yīng)。MIP性質(zhì)穩(wěn)定,制備過程簡單、可重復(fù)性強(qiáng),但是制備過程毒性較大。近些年來新型的適配體是通過指數(shù)富集配基系統(tǒng)進(jìn)化(systematic evolution of ligand by exponential enrichment,SELEX)技術(shù)從體外隨機(jī)文庫反復(fù)篩選獲得的DNA或RNA寡鏈核酸,能夠高親和力、高特異性結(jié)合靶標(biāo)[44]。目前已有數(shù)千種適配體被鑒定用于識別蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、抗生素、小分子化合物、病毒、完整或部分細(xì)胞,甚至金屬離子等多種靶標(biāo),并應(yīng)用于診斷、治療、生物傳感器和生物分析領(lǐng)域[45]。適配體篩選周期短、識別靶標(biāo)范圍廣、批間差小、價(jià)格便宜、性質(zhì)穩(wěn)定易保存,因此,基于適配體識別的生物傳感器是分析檢測領(lǐng)域目前重要的研究方向之一[32,45～46]。

2 生物傳感器在SL測定中的研究進(jìn)展

生物傳感器雖然為組織內(nèi)和胞內(nèi)快速定量SL提供了新的策略,但目前已開發(fā)的高靈敏度、高特異性檢測SL的生物傳感方法十分有限?，F(xiàn)已報(bào)道的SL生物傳感器都是基于內(nèi)源性SL的感知機(jī)制(圖3),即當(dāng)SL存在時(shí),SL被受體蛋白D14/DAD2/RMS3(水稻 Oryza sativa DWARF 14,或擬南芥Arabidopsis thaliana DWARF 14,或矮牽牛Petunia hybrida DECREASED APICAL DOMINANCE 2,或豌豆 Pisum sativum RAMOSUS 3)感知,招募下游信號元件F-box蛋白D3/MAX2(水稻DWARF 3,或擬南芥MORE AXILLARY GROWTH 2)和抑制蛋白D53/SMXL[水稻DWARF 53,或擬南芥SUPPRESSOR OF MAX2 1(SMAX1)-LIKE],形成信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白復(fù)合體(D3/MAX2-D14/DAD2/RMS3-D53/SMXL)。其中,F-box蛋白家族成員D3/MAX2是SCFD3/MAX2泛素連接酶復(fù)合體的底物識別亞基。抑制蛋白D53/SMXL被SCFD3/MAX2泛素化,然后通過26S蛋白酶體降解,從而解除D53/SMXL蛋白對下游轉(zhuǎn)錄因子及其自身基因啟動(dòng)子的抑制作用,SL信號從而得以向下游進(jìn)一步傳遞并發(fā)揮生理作用[22,47]。值得一提的是,SL信號也會導(dǎo)致D14/DAD2的降解[22,48]?；诤铣缮飳W(xué)理念,研究人員開發(fā)了基因編碼的生物傳感器,可間接或直接檢測SL。

圖3 SL信號感知和傳遞機(jī)制模型SCF:Skp1-Cullin-F-box；E2:泛素連接酶 2；Ub:泛素；TPR:TOPLESS-related repressor；SPL:Squamosa promoter binding protein-like。已申請獲得該圖[22]的電子/印刷版使用授權(quán)。Fig.3 A simplified model of strigolactone perception and signal transductionSCF:Skp1-Cullin-F-box；E2:Ubiquitin ligase 2；Ub:Ubiquitin；TPR:TOPLESS-related repressor；SPL:Squamosa promoter binding protein-like.Reprinted with permission from Reference[22].Copyright 2020 American Chemical Society.

2.1 基于合成生物學(xué)的SL間接檢測

起初研究人員基于SL誘導(dǎo)抑制蛋白D53/SMXL6/SMXL7的降解,通過為該類蛋白質(zhì)添加熒光蛋白標(biāo)簽,實(shí)現(xiàn)了SL的定性檢測。Zhou等[49]在水稻根系中外源添加5 μmol/L rac-GR24(合成的SL類似物),引起了D53-GFP的降解。在擬南芥根系中,5 μmol/L rac-GR24處理也誘導(dǎo)了SMXL6-YFP[50]和SMXL7-YFP[51]的降解。首個(gè)基于合成生物學(xué)的SL定量檢測是由Samodelov等[52]制備的一種熒光比率式SL生物傳感器(StrigoQuant),該工作構(gòu)建了REN-2A-SMXL6-FF融合表達(dá)體,通過外源添加SL誘導(dǎo)SMXL6-FF降解而導(dǎo)致FF/REN熒光比率下降,從而實(shí)現(xiàn)了在擬南芥原生質(zhì)體內(nèi)高特異性、高靈敏度的SL定量分析(圖4)。對于rac-GR24、rac-orobanchol和 rac-5-deoxystrigol 3種靶分子,StrigoQuant的檢測限分別為10 pmol/L、10 nmol/L和100 fmol/L,線性范圍約10 pmol/L～1 nmol/L?；陬愃评砟?Sanchez等[48]開發(fā)了一種基因編碼的SL生物傳感器。不同的是,該傳感器是基于SL感知機(jī)制引發(fā)的受體D14降解,通過SL處理后的轉(zhuǎn)基因擬南芥D14-FF降解致使熒光信號降低,而實(shí)現(xiàn)對SL的定量測定。該傳感體系的半最大效應(yīng)濃度(50%maximal effective concentration,EC50)為 1.62 μmol/L(rac-GR24),線性范圍為μmol/L級別。相比于StrigoQuant,該傳感器使用了植物自身的D14啟動(dòng)子來表達(dá)D14-FF,而沒有采用外源強(qiáng)啟動(dòng)子,更接近于植物細(xì)胞天然的生理環(huán)境,但這可能是其靈敏度低于Strigo-Quant的原因之一[48]。另外,靈敏度低也有可能是由于SMXL6是SCFMAX2的直接靶標(biāo),比D14更快發(fā)生降解；或者外源添加SL處理原生質(zhì)體或植株時(shí),SL的吸收、運(yùn)輸和分布的情況有差別[48]。

圖4 StrigoQuant檢測原理示意圖P35S是組成型35S啟動(dòng)子；REN是一種綠色熒光素酶,在該傳感體系中作為內(nèi)參元件；FF是一種黃色熒光素酶；SMXL6是擬南芥中參與SL感知信號通路的抑制蛋白；2A是一種自剪切肽,使該體系的REN和SMXL6-FF能夠按照化學(xué)計(jì)量比共表達(dá)。已申請獲得該圖[52]的電子/印刷版使用授權(quán)。Fig.4 Schematic of StrigoQuant biosensor designP35S:A constitutive 35S promoter；REN:A renilla luciferase (green,as a normalization element here)；FF:A firefly luciferase(yellow)；SMXL6:AtSMXL6；2A:A self-processing 2A peptide,leading to stoichiometric coexpression of REN and SMXL6-FF.Reprinted with permission from Reference[52].Copyright 2016 Science Advances.

2.2 基于合成生物學(xué)的SL直接檢測

Chesterfield等[22]于2020年開發(fā)了另一種熒光比率式生物傳感器,即rDAD2cpGFP和rSh-HTL7cpGFP,是目前已報(bào)道的唯一直接定量檢測SL的生物傳感器。該工作(圖5)將cpGFP(circularly permuted green fluorescent protein)與矮牽牛SL受體DAD2或獨(dú)腳金(Striga hermonthica)SL受體HTL7整合,使cpGFP可以將外源SL結(jié)合其受體引起的構(gòu)象重排轉(zhuǎn)化為熒光強(qiáng)度變化。為了克服蛋白質(zhì)表達(dá)量和蛋白質(zhì)降解等差異造成的影響,該傳感體系引入了一個(gè)對SL不敏感的熒光蛋白LSSmOrange作為內(nèi)參。LSSmOrange融合到DAD2cpGFP和ShHTL7cpGFP的C端。在表達(dá)該傳感體系的大腸桿菌裂解液中,rDAD2 cpGFP的EC50為 25.9 nmol/L(rac-GR24)或 70.5 nmol/L(rac-5-deoxystrigol)或 124 nmol/L(rac-orobanchol),線性范圍約為 50～500 nmol/L(rac-GR24)；rShHTL7 cpGFP的EC50為8.9 nmol/L(rac-GR24),線性范圍約為10～100 nmol/L(rac-GR24)。而在煙草原生質(zhì)體中,rDAD2 cpGFP的EC50為119.3 nmol/L(rac-GR24)。該傳感器體外檢測SL的靈敏度與目前MS檢測限相當(dāng):Boutet Mercey等[26]報(bào)道使用UHPLCEI-MS/MS分析rac-GR24的檢測限為4.94 μg/L(16.6 nmol/L)。該傳感體系實(shí)現(xiàn)了對SL的高特異性、高靈敏性檢測,還可能應(yīng)用于高通量篩選除草劑(促進(jìn)寄生雜草自殺性萌發(fā)的SL類似物)。相比于現(xiàn)有的其他依賴于SL感知機(jī)制的生物傳感器,該SL傳感器首次實(shí)現(xiàn)了在體外和植物原生質(zhì)體內(nèi)直接定量檢測SL,并且降低了SL感知信號通路中多組分以及D14降解可能涉及未知的基因轉(zhuǎn)錄過程對檢測結(jié)果可能造成的干擾。該工作對于SL的定量檢測研究具有重要意義。

圖5rDAD2 cpGFP檢測原理示意圖SL與受體結(jié)合引起的構(gòu)象變化會使得cpGFP的構(gòu)象發(fā)生重排,導(dǎo)致cpGFP/LSSmOrange熒光比值下降。其中,LSSmOrange對SL不敏感,在此傳感體系中作為內(nèi)參熒光。已申請獲得該圖[22]的電子/印刷版使用授權(quán)。Fig.5 Schematic of the ratiometric DAD2 cPGFP biosensor designThe fluorescence ratio(cpGFP/LSSmOrange)is decreased when strigolactone-induced conformational change is propagated into cpGFP.LSSmOrange,insensitive to strigolactone,is included as an internal flurescent control.Reprinted with permission from Reference[22].Copyright 2020 American Chemical Society.

3 討論與展望

目前已報(bào)道的定量檢測SL的生物傳感器都是基于合成生物學(xué)方法和內(nèi)源性SL感知機(jī)制,不過它們的靈敏度差異較大?；赟MXL6降解的StrigoQuant具有非常高的靈敏度,可以檢測的濃度低至 10 pmol/L(rac-GR24)、100 fmol/L(rac-5-deoxystrigol)和 10 nmol/L(rac-orobanchol)；基于構(gòu)象變化的生物傳感器(rDAD2 cpGFP和rShHTL7 cp-GFP)的靈敏度次之,對低-中納摩爾濃度范圍的rac-GR24有明顯的EC50值；而基于D14降解的生物傳感器靈敏度較低,僅對μmol/L濃度范圍的rac-GR24有明顯的EC50值。這些差異可能是由于上述生物傳感器對其他細(xì)胞過程的依賴程度不同[22]。比如,在StrigoQuant傳感體系中,帶有熒光素酶標(biāo)記的SMXL6蛋白被SCFD3/MAX2泛素連接酶復(fù)合體泛素化,可能介導(dǎo)其信號放大。相反,SL感知引起D14降解的過程還有待進(jìn)一步研究,該過程可能抑制檢測信號。而且,不同SL生物傳感器采用的各植物物種的SL受體靈敏度可能有差別,同時(shí)生物傳感器構(gòu)建過程中對受體的修飾或改造而引起的變化各異,這些都可能影響受體對SL的親和力[22]。此外,雖然基于D14降解的SL生物傳感器靈敏度不高,但是構(gòu)建該傳感器使用的是植物自身的D14啟動(dòng)子,更接近于植物細(xì)胞天然的生理環(huán)境。

上述生物傳感器中,只有rDAD2 cpGFP和rShHTL7 cpGFP是直接和定量檢測SL,為測定植物SL濃度和揭示SL信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程提供了新手段。在已知的識別器中,適配體的3D折疊結(jié)構(gòu)使其可與多種靶標(biāo)結(jié)合形成穩(wěn)定的復(fù)合物,如蛋白質(zhì)、核酸和小分子等[46]。至今已篩選出數(shù)百個(gè)適配體適用于識別小分子[32]。相對于抗體,適配體具有顯著的優(yōu)勢,如可識別低免疫原性的小分子、制備時(shí)間短、成本低、批間差小、易修飾、穩(wěn)定易保存等。因此可以考慮采用適配體作為識別元件,實(shí)現(xiàn)體外高特異性、高靈敏度、快速準(zhǔn)確地直接測定SL濃度。

為了深入理解SL的生理效應(yīng),實(shí)時(shí)檢測SL的濃度和時(shí)空分布具有重要的意義?；蚓幋a的生物傳感器具有在轉(zhuǎn)基因植物中特異性定量測定植物激素和無侵入性成像的特點(diǎn)[30],在分析活細(xì)胞中植物激素的濃度和分布的動(dòng)態(tài)變化方面具有巨大的潛力。比如,近期Birte H?cker和Gerd Jürgens團(tuán)隊(duì)[53]報(bào)道了一種基于FRET的基因編碼生物傳感器(AuxSen),其能夠在細(xì)胞和亞細(xì)胞水平實(shí)時(shí)可視化監(jiān)測生長素的濃度和時(shí)空分布,以及生長素對環(huán)境變化的響應(yīng)。AuxSen的構(gòu)建以大腸桿菌色氨酸抑制蛋白TrpR作為識別元件,經(jīng)過基因工程改造,使其僅與IAA牢固結(jié)合,而不再與TRP結(jié)合。使用異源識別元件降低了其干擾植物自身信號通路的可能性[30]。不同于傳統(tǒng)的依賴于內(nèi)源性生長素響應(yīng)機(jī)制的生長素時(shí)空分布研究(如DIIVENUS[54]),AuxSen與生長素的相互作用以可逆的方式誘導(dǎo)FRET比值變化,因此能夠監(jiān)測生長素濃度的快速瞬時(shí)變化。該工作對實(shí)時(shí)、可視化、原位檢測活體植物體內(nèi)其他激素的濃度和分布提供了新視角。

此外,SL與其他植物激素在調(diào)控植物生長發(fā)育過程的交互作用還沒完全闡明。為構(gòu)建更全面的激素組學(xué)信息,未來可以開發(fā)同時(shí)檢測多種類植物激素的傳感體系,實(shí)現(xiàn)多種植物激素的高時(shí)空分辨率測定。

目前,性價(jià)比高、快速、靈敏、特異性定量檢測SL的生物傳感器有限,今后SL定量檢測的主要趨勢可能仍然以合成生物學(xué)方法為主。而適配體生物傳感器由于其在小分子檢測領(lǐng)域獨(dú)特的優(yōu)勢,很可能將進(jìn)一步推進(jìn)高靈敏度、高特異性、簡單、快速的SL定量檢測研究。期望不久的將來,可以實(shí)現(xiàn)在細(xì)胞和亞細(xì)胞水平實(shí)時(shí)、可視化、動(dòng)態(tài)監(jiān)測SL的濃度和時(shí)空分布。SL檢測方法的理論和技術(shù)研究,將有助于SL生物合成、運(yùn)輸、感知和信號傳遞機(jī)制的進(jìn)一步揭示,從而為植物株型和共生特性的定向遺傳改良,以及根際寄生雜草生物/化學(xué)防治提供支撐,具有重要科學(xué)意義和應(yīng)用前景。