我國乙型腦炎病毒優(yōu)勢基因型轉(zhuǎn)換及其風(fēng)險(xiǎn)和對策

苑中芬，狄荻，李宗杰，魏建超

1.莒縣疾病預(yù)防控制中心，山東 日照 276599；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所

流行性乙型腦炎(Japanese encephalitis，JE)是由乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)引起的一種人畜共患病，主要流行于東亞、東南亞和南亞地區(qū)，被WHO列為重點(diǎn)控制的傳染病[1]。1871年，日本記錄了第一例乙型腦炎病例。1924年，日本出現(xiàn)的臨床病例超過6 000人，死亡率約為60%，科學(xué)家首次在病人腦組織中分離到了病原。1935年，Nakayama毒株被分離并確定為乙型腦炎病毒[2]。1940年，中國報(bào)道了首例乙型腦炎病例。2003—2018年，中國先后報(bào)告了51 013例乙型腦炎病例[3]。目前，全世界每年約有3萬～5萬人感染乙型腦炎病毒，死亡人數(shù)約1萬～1.5萬人，部分感染患者恢復(fù)后也會留下嚴(yán)重的神經(jīng)性后遺癥[4-5]。因此，乙型腦炎病毒已經(jīng)對人類和動物生命健康帶來了巨大的威脅，如何采取有效的措施防控流行性乙型腦炎已經(jīng)成了公共衛(wèi)生領(lǐng)域面臨的重要課題。

乙型腦炎病毒只有一個(gè)血清型，根據(jù)基因組序列特征可分為5個(gè)基因型(GⅠ-GⅤ型)。其中GⅠ-a型毒株多分布于熱帶，GⅠ-b型毒株在溫帶地區(qū)更常見；GⅡ型毒株更偏好于熱帶地區(qū)；GⅢ型毒株主要分布在日本、中國、菲律賓、斯里蘭卡和印度;GⅣ型毒株局限在印度尼西亞地區(qū);GⅤ型僅在馬來西亞、中國和韓國有報(bào)道[6]。我國共分離到三種基因型(GⅠ型、GⅢ型和GⅤ型)，其中GⅠ型主要分布在天津、甘肅、山東、浙江、江西、安徽、湖南，而新疆、黑龍江、北京以GⅢ型為主，江蘇、山西、四川、遼寧、云南、廣西、湖北、河南、貴州、福建、上海、重慶、臺灣、廣東是GⅠ型和GⅢ型的混合流行區(qū)[7]。20世紀(jì)30年代以來，GⅢ型毒株一直占據(jù)著亞洲地區(qū)乙型腦炎病毒流行的主要地位。但是，最近二十年的研究發(fā)現(xiàn)GⅠ型毒株逐漸替代GⅢ型毒株，成為我國乃至整個(gè)亞洲地區(qū)的主要流行毒株[8]。因此，研究乙型腦炎病毒基因型轉(zhuǎn)換趨勢對于防控乙型腦炎具有重要意義。

近年來，隨著各種乙型腦炎疫苗的接種率逐漸提高，乙型腦炎病毒的傳播與流行已經(jīng)獲得較好的控制。但是，隨著乙型腦炎病毒優(yōu)勢基因型由GⅢ型向GⅠ型轉(zhuǎn)變，相關(guān)疫苗的升級換代也迫在眉睫[9]。此外，研究已經(jīng)證實(shí)三帶喙庫蚊是乙型腦炎病毒的傳播媒介，豬和鷺科水鳥都是乙型腦炎病毒的增殖宿主[10]。因此，加強(qiáng)控制和消滅媒介昆蟲也是建立完善乙型腦炎防控體系的重要舉措[11]。

本文主要綜述了乙型腦炎病毒的病原學(xué)特征、感染宿主的病理機(jī)制、優(yōu)勢基因型轉(zhuǎn)換趨勢及其風(fēng)險(xiǎn)分析，并且對乙型腦炎的防控對策提出了新的見解。

1 乙型腦炎病毒的病原學(xué)特征

乙型腦炎病毒是有囊膜的單股正鏈RNA病毒，基因組長度約為11 kb，和登革病毒(dengue virus，DENV)、西尼羅病毒(West Nile virus，WNV)、寨卡病毒(Zika virus，ZIKV)和蜱傳腦炎病毒(tick-borne encephalitis virus，TBEV)等都是黃病毒屬的成員[12]。乙型腦炎病毒顆粒的外觀呈現(xiàn)為約50 nm大小二十面體對稱的球形結(jié)構(gòu)，外層由脂質(zhì)囊膜包裹，內(nèi)層含有一個(gè)約30 nm高電子密度的核[13]。乙型腦炎病毒的基因組包含一個(gè)單一的開放閱讀框(open reading frames，ORF)，編碼蛋白被蛋白酶切割后可產(chǎn)生三個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白和七個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白[14-15]。其中結(jié)構(gòu)蛋白是構(gòu)成病毒粒子的重要組分，而非結(jié)構(gòu)蛋白則在病毒的復(fù)制、組裝和逃避宿主的天然免疫反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[16-17]。

2 乙型腦炎病毒感染宿主的病理機(jī)制

乙型腦炎病毒感染人之后存在5～15天的潛伏期，主要癥狀表現(xiàn)為非特異性發(fā)熱和無菌性腦膜炎或腦炎，引起相應(yīng)的急性癥狀主要包括神經(jīng)源性呼吸缺乏、心血管休克和惡心等[18]。此外，脊髓運(yùn)動神經(jīng)元也可能會受到影響，導(dǎo)致出現(xiàn)急性弛緩性麻痹[19]。在致死性的病例中，大腦會出現(xiàn)血管充血、小膠質(zhì)細(xì)胞增生、膠質(zhì)細(xì)胞間質(zhì)形成結(jié)節(jié)、局灶性囊性壞死、腦水腫等多種病理變化[20]。乙型腦炎的流行不僅嚴(yán)重危害人類健康，同時(shí)也造成巨大社會負(fù)擔(dān)和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

乙型腦炎病毒主要通過入侵人、豬、馬和野生動物腦神經(jīng),增加炎癥因子和趨化因子并募集外周免疫細(xì)胞，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中誘發(fā)“炎癥風(fēng)暴”并最終導(dǎo)致神經(jīng)元死亡[21]。乙型腦炎病毒增殖時(shí)，單股正鏈RNA病毒既可以直接復(fù)制子代RNA，又可以發(fā)揮mRNA作用翻譯出病毒蛋白。核衣殼蛋白(C蛋白)主要參與病毒基因組的組裝和核衣殼的形成，膜蛋白(M蛋白)參與病毒顆粒裝配和釋放，囊膜糖蛋白(E蛋白)是與細(xì)胞膜受體相結(jié)合并且使病毒進(jìn)入細(xì)胞的主要蛋白，與病毒的吸附、侵入、致病性以及誘導(dǎo)宿主的免疫應(yīng)答等密切相關(guān)[22]。E蛋白具有三個(gè)結(jié)構(gòu)不同的結(jié)構(gòu)域(DⅠ、DⅡ和DⅢ)，其中DⅠ區(qū)與E蛋白的結(jié)構(gòu)重排有關(guān)，DⅡ區(qū)可影響病毒與宿主細(xì)胞之間的膜融合，DⅢ區(qū)具有與受體結(jié)合的氨基酸位點(diǎn)，在與宿主細(xì)胞受體相互作用和促進(jìn)病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞過程中發(fā)揮重要作用[23]。7種非結(jié)構(gòu)蛋白中的NS1蛋白在病毒復(fù)制過程中起著輔助因子作用，NS2A、NS4A和NS4B具有干擾素拮抗作用，NS2B和NS3具有蛋白酶活性，NS5蛋白可抑制干擾素誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答過程[24]。研究乙型腦炎病毒的致病機(jī)制有助于深入了解其病毒變異的生物學(xué)特性。

3 乙型腦炎優(yōu)勢基因型的變化

乙型腦炎病毒的主要傳播基因型可能會發(fā)生周期性變化，具體原因很有可能與蚊子-禽-蚊子傳播周期中GⅠ型毒株在禽類宿主中具有更高的病毒血癥和更長的持續(xù)時(shí)間有關(guān)[25-27]。與GⅢ型毒株相比較，GⅠ型毒株在禽類宿主中誘導(dǎo)的干擾素表達(dá)更低，從而表現(xiàn)出對禽類宿主的適應(yīng)性優(yōu)勢。通過構(gòu)建嵌合病毒與定點(diǎn)突變病毒，發(fā)現(xiàn)NS5-V372A-H386Y兩個(gè)氨基酸位點(diǎn)的氫鍵排布導(dǎo)致了對宿主適應(yīng)性的差異[9]。此外，我國學(xué)者還從庫蚊中分離得到了GⅤ型毒株，而且其生物學(xué)特性和致病性與GⅠ型毒株和GⅢ型毒株顯著不同[28]。GⅤ型毒株的核苷酸序列與GⅠ-Ⅳ型毒株的同源性不高，GⅤ型毒株的NS4A基因中多插入了3個(gè)核苷酸，在終止密碼子下游的非翻譯區(qū)域也有核苷酸插入，并且E基因有多個(gè)氨基酸發(fā)生突變(約10%)。因此，GⅤ型毒株的編碼區(qū)和非編碼區(qū)的基因突變決定了其具有更強(qiáng)的毒力和更高的致病性[29]。通過比較不同毒株的E蛋白序列，發(fā)現(xiàn)E蛋白138位氨基酸殘基(E138)的酸堿性能夠決定乙型腦炎病毒的神經(jīng)毒力，強(qiáng)酸性氨基酸毒力強(qiáng)，弱酸性氨基酸則毒力呈現(xiàn)部分下降，而強(qiáng)堿性毒力弱。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)強(qiáng)毒株能在腦內(nèi)擴(kuò)散，弱毒株則失去腦內(nèi)擴(kuò)散能力。因此，E138可作為強(qiáng)、弱毒株篩選鑒定的重要標(biāo)志，同時(shí)也可作為判斷E138突變的JEV疫苗是否出現(xiàn)毒力返強(qiáng)的靶位點(diǎn)[30]。

4 乙型腦炎病毒優(yōu)勢基因型轉(zhuǎn)換的風(fēng)險(xiǎn)分析

分子流行病學(xué)監(jiān)測表明，我國乙型腦炎病毒的優(yōu)勢基因型已從GⅢ型逐漸向GⅠ型轉(zhuǎn)變，同時(shí)西藏地區(qū)還出現(xiàn)了毒力更強(qiáng)和致病性更高的GⅤ型毒株。乙型腦炎病毒的優(yōu)勢基因型轉(zhuǎn)換導(dǎo)致了更加嚴(yán)峻的傳播風(fēng)險(xiǎn)，給公共衛(wèi)生領(lǐng)域的防控工作帶來了新的挑戰(zhàn)[31-32]。由于目前世界上尚無可用于治療乙型腦炎病毒感染的特定藥物，因此通過廣泛接種疫苗進(jìn)行免疫預(yù)防是控制乙型腦炎病毒傳播的有效方法。我國目前使用的兩種乙型腦炎疫苗(SA14-14-2弱毒活疫苗和滅活的P3毒株疫苗)均源自GⅢ型毒株，其對GⅠ型和GⅤ型毒株攻擊的保護(hù)效果值得進(jìn)一步評估[33]。通過病毒中和試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，GⅢ型毒株疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生的中和抗體對GⅠ型毒株的中和能力明顯降低[34]。此外，研究發(fā)現(xiàn)GⅢ型毒株疫苗對于GⅤ型毒株的攻擊也不能提供完全保護(hù)[35]。只有針對病毒流行優(yōu)勢基因型研發(fā)有效的保護(hù)疫苗，才能有效控制多種基因型共同流行的現(xiàn)狀。

目前，全球有4種不同類型的乙型腦炎疫苗可供使用：①鼠腦滅活疫苗；②細(xì)胞來源的弱毒活苗；③細(xì)胞來源的滅活疫苗；④基因工程的弱毒嵌合活疫苗。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所馬志永課題組通過攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)對不同GⅢ型和GⅠ型毒株衍生疫苗的交叉保護(hù)作用進(jìn)行了大量研究，結(jié)果表明接種了GⅢ型毒株疫苗(SA14-14-2弱毒活疫苗)的豬和小鼠能誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體，但是對于GⅠ型毒株的攻擊不能提供完全保護(hù)[36]。通過在倉鼠腎細(xì)胞(BHK-21細(xì)胞)將GⅠ型強(qiáng)毒株連續(xù)傳120代得到了弱毒株候選疫苗(SD12-F120)，接種免疫小鼠后可對GⅠ型強(qiáng)毒株提供完全保護(hù)[37]。此外，國際上也在積極研發(fā)GⅠ型毒株(KV1899)衍生疫苗，其滅活疫苗可在豬體內(nèi)誘導(dǎo)很高水平的中和抗體，同時(shí)也在非洲猴腎細(xì)胞(Vero細(xì)胞)中進(jìn)行弱毒活疫苗的開發(fā)[38]。因此，針對GⅢ型和GⅠ型毒株疫苗交叉保護(hù)作用較差的問題，可采用構(gòu)建二價(jià)疫苗或者多價(jià)疫苗的疫苗研發(fā)策略來控制多種基因型流行造成的混合感染。此外，還要在疫苗佐劑、給藥系統(tǒng)和免疫程序等方向開展更多研究，以便開發(fā)更好的乙型腦炎疫苗。

5 結(jié) 語

近二十年來，乙型腦炎病毒的優(yōu)勢基因型在我國乃至整個(gè)亞洲地區(qū)都出現(xiàn)了由GⅢ型向GⅠ型轉(zhuǎn)變，根據(jù)國內(nèi)外最新研究數(shù)據(jù)，可以推斷原因很可能是病毒本身對水禽宿主的適應(yīng)性差異。病毒優(yōu)勢基因型的轉(zhuǎn)換和流行范圍的擴(kuò)大給乙型腦炎的防控工作帶來了新的挑戰(zhàn)，因此需要加快研發(fā)不同基因型的疫苗來應(yīng)對乙型腦炎病毒造成的感染。

此外，乙型腦炎病毒的主要媒介昆蟲是庫蚊，因此根據(jù)氣候變化和地理位置不同會出現(xiàn)全年持續(xù)流行和季節(jié)性流行，感染的候鳥以及蚊子共同的地理分布很大程度上決定著乙型腦炎病毒的傳播流行地區(qū)[39-40]。在溫帶地區(qū)，受感染的蚊子也可以通過垂直傳播的方式幫助病毒越冬。因此，根據(jù)蚊子的越冬習(xí)性加強(qiáng)越冬蚊子的治理也是控制病毒傳播的有效途徑[41-43]。近年來，由于全球氣候逐漸變暖，蚊子的地理分布區(qū)域不斷擴(kuò)大，因此可能將出現(xiàn)更多新的乙型腦炎病毒疫區(qū)[44-45]。所以,可采取的預(yù)防措施還包括有效地控制蚊蟲和避免被蚊蟲叮咬。通過加強(qiáng)人類住所和動物畜舍的衛(wèi)生措施隔絕蚊子入侵，特別是在黎明和黃昏等蚊子活動高峰期開展滅蚊措施，可以減少蚊子叮咬的機(jī)會，從而有效地降低乙型腦炎病毒感染的風(fēng)險(xiǎn)。