超聲浸提-離心過濾法測(cè)土壤有效磷的探索

王 丹 ，吳佐京通 ，姚華明 ，3，祝賢彬 ，潘紅忠

（1.長(zhǎng)江大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，武漢 430100；2.濕地生態(tài)與農(nóng)業(yè)利用教育部工程研究中心，湖北 荊州 434000；3.中國長(zhǎng)江電力股份有限公司，湖北 宜昌 443000）

有效磷作為土壤中唯一可被植物吸收的磷態(tài)，是衡量土壤中磷含量的一個(gè)關(guān)鍵指標(biāo)。測(cè)定土壤有效磷含量對(duì)于合理控制施肥時(shí)間、提高作物產(chǎn)量及預(yù)防水肥流失造成的水體富營(yíng)養(yǎng)化等具有非常重要的意義［1-4］。目前，有效磷的測(cè)定方法主要有 Olsen法、Mehlich3法、ASI法、Bray-Kurtz1和Bray-Kurtz2［5-6］，其中Olsen法的測(cè)定值與土壤有效磷含量及植物吸磷量之間相關(guān)性最好，是目前使用最廣泛的測(cè)定方法［7］。我國國標(biāo)GB 12297—1990《石灰性土壤有效磷測(cè)定方法》也推薦采用Olsen法（0.5mol/lNaHCO3pH 8.5）進(jìn)行土壤有效磷測(cè)定。但該法實(shí)驗(yàn)過程繁瑣、不能實(shí)現(xiàn)序批操作、測(cè)試效率低。如何提高土壤有效磷的測(cè)試效率，仍然是目前亟需解決的問題。

目前土壤有效磷測(cè)定改進(jìn)方法主要集中在浸提劑、波長(zhǎng)及顯色劑等環(huán)節(jié)，如楊俐蘋等［2］改進(jìn)了顯色劑，調(diào)整波長(zhǎng)為882nm，結(jié)果發(fā)現(xiàn)可消除土壤可溶有機(jī)質(zhì)顏色的影響，減少了加無磷活性炭的步驟，降低了二次污染的風(fēng)險(xiǎn)。杜昌文等［8］采用省去樣品前處理的傅里葉變換紅外光聲光譜法測(cè)定土壤中有效磷。秦海娜等［9］使用電感耦合等離子體發(fā)射譜法測(cè)定土壤有效磷。

綜上可見，目前土壤有效磷改進(jìn)方法大多集中在測(cè)定儀器上，對(duì)于土壤樣品前處理過程的優(yōu)化研究較少。本文在參照GB 12297—1990國家標(biāo)準(zhǔn)的前提下，對(duì)國標(biāo)法前處理環(huán)節(jié)進(jìn)行改進(jìn)，采用超聲浸提、離心機(jī)離心分離等方法。其中，超聲萃取因其具有浸提效率高、操作簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)，被用來提取磷石膏中的水溶性磷和有效磷［10］。本研究試圖通過設(shè)置不同的超聲浸提時(shí)間和離心轉(zhuǎn)速，找到最合適的浸提時(shí)間和離心轉(zhuǎn)速，研究改進(jìn)法與國標(biāo)法之間的相關(guān)性，以期為提高土壤有效磷測(cè)定效率提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

為使樣品更具代表性，實(shí)驗(yàn)所用的樣品分別來自菜地、魚塘和江邊沙地3個(gè)不同的地方，因?yàn)椴说厥┝?，施磷可以提高表層土壤速效磷的含量，?dǎo)致菜地的有效磷含量是魚塘和江邊沙地的10倍左右。實(shí)驗(yàn)過程中所用的試劑和樣品用量與國標(biāo)法保持一致。

1.1 土壤樣品

土樣1 （114°6′7.61″，30°18′1.32″）：來自菜地，顏色呈褐色，其中，砂粒占8.93%，粉粒占60.45%，黏粒占30.62%，電導(dǎo)率為105.3us/cm，TDS為52.7mg/L，pH為7.45，有機(jī)物含量為14.38g/kg。

土樣3 （114°5′46.19″，30°17′36.96″）：來自江邊沙地，顏色呈黃色，其中，砂粒占11.33%，粉粒占64.96%，黏粒占23.71%，電導(dǎo)率為102.2us/cm，TDS為51.1 mg/L，pH為7.48，有機(jī)物含量為27.62g/kg。

土樣2 （114°6′2.48″，30°17′40.26″）：來自魚塘，顏色呈黃褐色，其中，砂粒占10.56%，粉粒占66.88%，黏粒占22.57%，電導(dǎo)率為96.2us/cm，TDS為48.1mg/L，pH為7.71，有機(jī)物含量為16.08g/kg。

1.2 主要分析儀器和設(shè)備

振蕩培養(yǎng)箱（浙江美壁儀器有限公司）、超聲波清洗儀 （中國上海早盈精密清洗機(jī)械有限公司）、L400 Cence湘儀冷凍離心機(jī) （湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）、UV-2550紫外分光光度計(jì) （島津國際貿(mào)易有限公司）、瑪瑙研缽、分析天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）、1mm方孔篩 （連云港市春龍實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）。

1.3 試劑和溶液

碳酸氫鈉（分析純）；氫氧化鈉（化學(xué)純）：50%（m/v）溶液；碳活性炭（化學(xué)純）；鹽酸：1+1溶液；鉬酸銨（分析純）；硫酸（分析純）；酒石酸氧銻鉀：0.3%（m/v）溶液；抗壞血酸（左旋，比旋光度+21°～+22°，分析純）；磷酸二氫鉀（分析純）。

1.3.1 浸提劑（0.5mol/L碳酸氫鈉，pH=8.5）

將42.0g碳酸氫鈉溶于800mL水中，稀釋至1L，用氫氯化鈉溶液調(diào)節(jié)至pH=8.5（用pH計(jì)測(cè)定）。儲(chǔ)存于聚乙烯瓶中，用塞塞緊，如貯存期超過20d，使用時(shí)必須檢查并校準(zhǔn)pH值。

1.3.2 無磷活性炭粉

如果所用活性炭含磷，應(yīng)先用1+1鹽酸浸泡12 h以上，然后移放在平板漏斗上抽氣過濾，用水淋洗4～5次，再用浸提劑浸泡12h以上，在平板漏斗上抽氣過濾，用水洗盡碳酸氫鈉，并至無磷為止，烘干備用。

1.3.3 鉬銻儲(chǔ)存液

10.0g鉬酸銨溶于300 mL約60℃的水中冷卻。另取181mL硫酸緩緩注入約800mL水中，攪勻，冷卻。然后將稀硫酸注入鉬酸銨溶液中，隨時(shí)攪勻；再加入100mL酒石酸氧銻鉀溶液；最后用水稀釋至2000mL，盛于棕色瓶。

1.3.4 顯色劑

0.50g抗壞血酸溶于100mL鉬銻貯備液中。此試劑有效期在室溫下為24h，在2～8℃冰箱中可貯存7d。

1.3.5 磷標(biāo)準(zhǔn)貯備液100mg/L

準(zhǔn)確稱取經(jīng)105℃烘干的磷酸二氫鉀0.4394g溶于200mL水中，加入5mL硫酸，轉(zhuǎn)入1000mL容量瓶中，加水定容，混勻。此貯備溶液可以長(zhǎng)期保存。

1.3.6 磷標(biāo)準(zhǔn)工作液5mg/L

將磷標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液用浸提劑準(zhǔn)確稀釋20倍。此工作溶液不宜久存。

1.4 實(shí)驗(yàn)步驟

1.4.1 浸提步驟

稱取2.5g通過風(fēng)干研磨并過篩1mm的土樣，置于干燥的150mL的具塞錐形瓶中，加入50mL浸提劑，再加一小勺無磷活性炭，塞緊，第一批置于恒溫往復(fù)振蕩器上，以25℃、160r/min震蕩30min，第二批放入超聲波清洗儀進(jìn)行超聲處理，整個(gè)超聲過程中控制溫度在（25±1）℃，按實(shí)驗(yàn)方法考察了5，10，15，20，25，30min對(duì)土壤中有效磷濃度的影響。

1.4.2 分離步驟

第一批立即用無磷濾紙過濾后所得濾液即為待測(cè)溶液，第二批倒入離心管中，利用可控溫的冷凍離心機(jī)控制溫度在（25±1）℃，考察了1000，2000，4000，6000，8000，10000，12000，14000rpm對(duì)土壤中有效磷濃度的影響，離心5min，取上清液，所得即為待測(cè)溶液。

1.4.3 鉬銻抗分光光度法測(cè)定土壤有效磷

吸取10mL上清液和濾除液于干燥的50mL比色管中，加入5mL硫酸鉬銻抗混合顯色劑，慢慢搖動(dòng)，使二氧化碳逸出。再加入10mL水，充分搖勻，逐盡二氧化碳。在室溫高于15℃處放置30min后，用比色皿在700nm波長(zhǎng)處，測(cè)讀吸光度，以空白溶液（10mL浸提液代替土壤濾出液，同上處理）為參比液，調(diào)節(jié)分光光度計(jì)的零點(diǎn)。

1.4.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

在土樣測(cè)定的同時(shí)，吸取磷標(biāo)準(zhǔn)工作液0，1.5，2.5，5，10，15，20mL分別放入7個(gè)50mL容量瓶中，并用浸提劑定容，同上處理顯色，測(cè)度系列溶液的吸光度，然會(huì)以上述標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的磷濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。此標(biāo)準(zhǔn)系列中磷濃度依次為0，0.15，0.25，0.5，1，1.5，2.5mg/L。

2 結(jié)果和討論

2.1 浸提時(shí)間選擇

同一土壤樣品在相同實(shí)驗(yàn)條件下采用不同時(shí)間進(jìn)行超聲浸提，考察了5，10，15，20，25，30min對(duì)土壤中有效磷濃度的影響，本實(shí)驗(yàn)采用3種不同的土樣進(jìn)行測(cè)定，浸提結(jié)果與國標(biāo)法進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果如圖1。從圖1可以看出，隨著超聲時(shí)間的增大，一些難溶性的磷發(fā)生溶解，導(dǎo)致菜地、魚塘和江邊沙地有效磷的濃度一直增大。經(jīng)與國標(biāo)法對(duì)比可得，超聲浸提10min得到的結(jié)果與國標(biāo)法十分接近，如果超過10min，將會(huì)增加土壤中非有效磷成分的溶解，所以選擇最合適的浸提時(shí)間為10min。與國標(biāo)法的振蕩浸提相比，超聲浸提不僅縮短了浸提的時(shí)間，而且操作簡(jiǎn)單，大大提高了浸3提的速率。

圖1 不同超聲時(shí)間下測(cè)定有效磷濃度與國標(biāo)法的對(duì)比

2.2 分離轉(zhuǎn)速選擇

對(duì)上面超聲浸提的溶液進(jìn)行離心分離，同一土壤樣品相同離心時(shí)間內(nèi)采用不同的離心轉(zhuǎn)速進(jìn)行分離，主要考察了1000，2000，4000，6000，8000，10000，12000，14000rpm對(duì)土壤中有效磷濃度的影響，分離結(jié)果與國標(biāo)法進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果如圖2。

圖2 不同離心轉(zhuǎn)速下測(cè)定有效磷濃度與國標(biāo)的對(duì)比

從圖2可以看出，采用不同的離心轉(zhuǎn)速下測(cè)定有效磷濃度，有效磷的濃度變化幅度不大。因此，超聲浸提是關(guān)鍵，離心是輔助。隨著轉(zhuǎn)速的不斷增大，有部分吸附在土壤顆粒表面的磷粘在離心管底部，導(dǎo)致有效磷的濃度變小，當(dāng)達(dá)到10000rpm左右時(shí)，有效磷的濃度變化趨于平穩(wěn)，且與國標(biāo)方法的結(jié)果最接近。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇最佳的離心轉(zhuǎn)速為10000rpm。與國標(biāo)法的無磷濾紙過濾相比，離心過濾大大節(jié)約了過濾時(shí)間，同時(shí)也節(jié)約了資源。

2.3 改進(jìn)法與國標(biāo)法測(cè)定土壤有效磷測(cè)試結(jié)果的相關(guān)性分析

分別對(duì)超聲過濾與國標(biāo)法、振蕩浸提離心分析與國標(biāo)法、超聲浸提離心分離的改進(jìn)法與國標(biāo)法進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果如圖3。從圖3可得，超聲萃取改進(jìn)法與國標(biāo)法及離心分離改進(jìn)法與國標(biāo)法、改進(jìn)法與國標(biāo)法之間的相關(guān)性都呈極顯著正相關(guān)，R2分別為0.99973，0.99944，0.99994。其中，改進(jìn)國標(biāo)法與國標(biāo)法的R2最大，證明此改進(jìn)方法具有可行性。

圖3 改進(jìn)法與國標(biāo)法測(cè)定土壤有效磷測(cè)試結(jié)果的相關(guān)性分析

2.4 精密度實(shí)驗(yàn)

將3種土壤樣品分別用國標(biāo)法和改進(jìn)法進(jìn)行有效磷的測(cè)量，每種樣品平行測(cè)定五次，測(cè)定結(jié)果對(duì)比見表1。從表1實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出，菜地有效磷含量相對(duì)偏差小于5%，魚塘和江邊沙地的絕對(duì)誤差小于1mg/kg，符合國標(biāo)法的要求。因此，改進(jìn)法測(cè)定土壤樣品有效磷濃度的精密度是可靠的。

表1 改進(jìn)法與國標(biāo)法測(cè)定土壤有效磷結(jié)果對(duì)比

2.5 改進(jìn)法與國標(biāo)法測(cè)定土壤有效磷的方法條件比較

對(duì)改進(jìn)法和國標(biāo)法測(cè)定土壤有效磷的測(cè)定步驟進(jìn)行了比較，進(jìn)一步突出改進(jìn)方法的可行性。結(jié)果如表2。

表2 國標(biāo)法與改進(jìn)法測(cè)定土壤有效磷的比較

3 結(jié)論與展望

對(duì)于測(cè)定土壤有效磷含量的GB 12297—1990《石灰性土壤有效磷測(cè)定方法》中浸提步驟和分離步驟進(jìn)行了改進(jìn)，即分別采用超聲浸提代替振蕩浸提，使用離心分離代替無磷濾紙過濾。改進(jìn)方法與國標(biāo)法相比，具有以下特點(diǎn)：

（1）采用改進(jìn)法測(cè)定土壤樣品中有效磷的含量時(shí)，對(duì)其精密度、準(zhǔn)確度以及相關(guān)性進(jìn)行了分析比較，其測(cè)定結(jié)果符合GB 12297—1990《石灰性土壤有效磷測(cè)定方法》的相關(guān)要求，精密度和準(zhǔn)確度可靠。

（2）采用改進(jìn)法與國標(biāo)法得到的測(cè)試結(jié)果相關(guān)性分析都呈極顯著正相關(guān)，R2達(dá)到0.99994。因此，其測(cè)定結(jié)果可靠。

（3）采用改進(jìn)法測(cè)定土壤有效磷含量時(shí)，既省略了用無磷濾紙過濾環(huán)節(jié)而節(jié)省了濾紙用量，從而節(jié)約了測(cè)定成本，也大大縮短了浸提和過濾時(shí)間，并且可以一次性處理多個(gè)樣品，提高了檢測(cè)效率，為土壤有效磷的大批量檢測(cè)提供了指導(dǎo)與借鑒。

國標(biāo)法土壤有效磷測(cè)定過程中，要求將溫度嚴(yán)格控制在25±1℃，而改進(jìn)法在超聲浸提和離心分離過程中，普遍存在升溫現(xiàn)象，如何控制改進(jìn)法實(shí)驗(yàn)過程中的溫度，還有待進(jìn)一步探索與研究。