基于誘變和抗性突變的多殺霉素高產(chǎn)菌株的選育

王佳穎，鄭 宇，梁 潔，高青青，張金林，祁桂玲

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護學(xué)院，河北 保定 071001；2.河北興柏農(nóng)業(yè)科技有限公司，河北 石家莊 050000）

多殺霉素（Spinosad），又名多殺菌素，是由刺糖多孢菌（Saccharopolyspora spinosa）經(jīng)過有氧發(fā)酵產(chǎn)生的一種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，由Spinosyn A（10%～15%）和Spinosyn D（85%～90%）組成，其作用模式獨特、自然分解快、對目標(biāo)害蟲高效，是一種具有廣闊市場前景的新型生物農(nóng)藥[1]。目前多殺霉素原藥由美國陶氏益農(nóng)公司獨家生產(chǎn)，專利到期后，國內(nèi)的一些企業(yè)致力于多殺霉素的研究，完成了一些基礎(chǔ)性工作，但是由于產(chǎn)量低，還未能實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)[2]。

目前，提高菌株中多殺霉素產(chǎn)量的途徑主要集中在以下幾方面：前體化合物和多殺霉素生物合成途徑的代謝工程，調(diào)控基因的引入，基因組規(guī)模代謝模型（GSMM）指導(dǎo)的工程[3-4]、誘變[5]、基因組改組[6-7]、發(fā)酵過程優(yōu)化[8-10]和組學(xué)分析以及異源其他放線菌中多殺霉素的生物合成。程休等[11]將刺糖多孢菌菌液進行紫外線誘變40 s后涂在含有50 mg/L多殺霉素的平板上，篩選到了1株效價較原始菌株高59.1%的高產(chǎn)突變株。扶教龍等[12]把刺糖多孢菌引入鏈霉素、鼠李糖和安普霉素抗性，然后經(jīng)過紫外線和亞硝基胍誘變，結(jié)合響應(yīng)面試驗，篩選到1株效價較原始菌株提高了54.55%的高產(chǎn)突變株。

多殺霉素應(yīng)用范圍廣，己在73個國家250多種作物上注冊應(yīng)用[13-14]，還被應(yīng)用于治療頭虱[15]、延長輪胎使用壽命[16]、抑制腫瘤增殖等方面[17]，因此快速有效地提高多殺霉素的產(chǎn)量以達到工業(yè)化生產(chǎn)意義重大。本試驗通過對刺糖多孢菌株DS0322-3進行常溫常壓等離子誘變、紫外線誘變和鏈霉素、慶大霉素、氯霉素等抗性突變，進行高產(chǎn)菌株的選育，以期獲得可以穩(wěn)定遺傳的高產(chǎn)突變菌株，為工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.2 供試培養(yǎng)基 斜面/平板培養(yǎng)基：可溶性淀粉 18 g，葡萄糖 3 g，酵母膏 3 g，玉米漿 1 g，瓊脂粉 18 g，1 000 mL 蒸餾水，pH 值調(diào)至 7.0；種子培養(yǎng)基：可溶性淀粉 5 g，葡萄糖 15 g，酵母膏 3 g，玉米漿30 g，酪蛋白 30 g，硫酸鎂2 g，磷酸二氫鉀為 0.5 g，1 000 mL 蒸餾水，pH 值調(diào)至 7.0；發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖 55 g，可溶性淀粉 20 g，糊精 10 g，棉籽蛋白5 g，黃豆餅粉15 g，酵母膏5 g，硫酸鎂2 g，磷酸二氫鉀0.5 g，碳酸鈣4 g，1 000 mL蒸餾水，pH值調(diào)至7.0。

1.2 方法

1.2.1 常溫常壓等離子體誘變選育 調(diào)整生物育種機（ARTP-ⅡS）功率為120 W，以氦氣為工作氣體，氣量為10 LSM。取10 μL孢子懸浮液（孢子量為108 cfu/mL）進行等離子體誘變，處理時間分別為 0、10、20、30、40、50和 60 s。誘變完成后加1 mL無菌水稀釋，取100 μL樣品進行涂板，每個處理重復(fù)3次，將涂布好的平板倒置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱培養(yǎng)13 d后，統(tǒng)計各個平板上的菌落數(shù)，計算致死率，選取長勢良好的單菌落進行篩選試驗。

1.2.2 紫外線誘變選育 試驗開始前將15 W的紫外線燈管預(yù)先開啟持續(xù)30 min左右，然后在黑暗條件下進行試驗，取10 mL孢子懸浮液于滅菌培養(yǎng)皿中，誘變時間分別為0、10、20、30、40、50和60 s，誘變完成后分別取100 μL樣品進行涂板，每個處理重復(fù)3次，涂布完成后立即用黑紙包住，同1.2.1進行培養(yǎng)和后續(xù)篩選試驗。

1.2.3 高產(chǎn)菌株的抗性突變篩選 ①抗性物質(zhì)母液的制備：分別稱取100 mg新霉素、紅霉素、慶大霉素和鏈霉素加10 mL無菌水溶解，分別稱取100 mg氯霉素、利福平和多殺霉素加10 mL甲醇溶解，用無菌注射器及針頭過濾器進行過濾后完成母液的制備。②最小抑制濃度的測定：取相應(yīng)質(zhì)量的鼠李糖和相應(yīng)劑量上述母液加入固體培養(yǎng)基中，混合均勻后倒平板，獲得目標(biāo)濃度的抗性平板，取100 μL孢子懸浮液涂板，每個處理3個重復(fù)，于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)13 d，比較對照組和處理組平板上菌落的生長情況，確定最小抑制濃度。平板上抗性物質(zhì)的濃度如表1所示。

表1 固體平板中不同抗性物質(zhì)的濃度Table 1 Concentrations of different resistant substances in the solid plate

1.2.4 對誘變獲得的高產(chǎn)菌株進行抗性突變篩選以誘變育種篩選出的高產(chǎn)突變菌為出發(fā)菌株，根據(jù)上述試驗結(jié)果，選擇合適濃度的鏈霉素、新霉素、氯霉素、慶大霉素、紅霉素、利福平、鼠李糖和多殺霉素抗性平板進行高產(chǎn)抗性菌株的選育，試驗方法同1.2.3，選取長勢良好的單菌落進行篩選試驗。

1.2.5 96孔板高通量篩選 選取平板上長勢良好且形態(tài)豐富的菌落接種到96孔板中，8 d后通過HPLC檢測發(fā)酵液中多殺霉素的濃度，計算突變率。將多殺霉素產(chǎn)量高于對照組的突變菌株進行搖瓶復(fù)篩驗證。

1.2.6 多殺菌素的HPLC檢測 按照發(fā)酵液和甲醇的體積比例為1:4，進行多殺霉素的萃取試驗，振蕩混勻后，超聲波超聲破碎 30 min，3 500 r/min，離心10 min，取上清液過有機濾膜后進行HPLC檢測。色譜條件為色譜柱：島津Shim-pack VP-ODS 150 mm×4.6 mm；流動相：V甲醇∶V乙腈∶V水（含0.05% 乙酸銨）=45∶45∶10；進樣量 20 μL；流速為1.0 mL/min；柱溫：28℃；檢測波長：245 nm。依據(jù)多殺霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)A和D組分的峰面積計算發(fā)酵液中多殺霉素的含量。

多殺霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：配制5個不同濃度的多殺霉素標(biāo)準(zhǔn)樣品，進行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，濃度分別為 40、80、120、160 和 200 mg/L。

春節(jié)前夕，奶奶起得特別早。她一直忙前忙后，一會兒去泡糯米，一會兒又去準(zhǔn)備柴火。爺爺也忙得不可開交。到了下午，爸爸和幾個叔叔合力抬來了一個奇形怪狀的大家伙：一塊圓圓的大石頭，中間被掏空了，光滑得發(fā)亮，就像一個大石碗。爸爸說這大家伙叫石臼（），是打糍粑用的。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理 運用Excel2010和SPSS19.0 等相關(guān)軟件完成數(shù)據(jù)分析。計算方法和公式如下：

在系統(tǒng)誤差存在的條件下，突變菌株的多殺霉素產(chǎn)量提高10%以上認(rèn)定為正突變菌株；突變株多殺霉素產(chǎn)量降低10%以下認(rèn)定為負突變菌株。

1.2.8 高產(chǎn)突變菌株的遺傳穩(wěn)定性檢測 根據(jù)96孔板的試驗結(jié)果，選取產(chǎn)量高于對照組的突變菌株進行搖瓶驗證試驗。根據(jù)搖瓶試驗結(jié)果對篩選到的高產(chǎn)突變株進行3次傳代穩(wěn)定性檢測，每次變化幅度小于10%認(rèn)定為可穩(wěn)定遺傳，并進行菌種保藏。

2 結(jié)果與分析

2.1 多殺霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線

多殺霉素標(biāo)準(zhǔn)樣品的HPLC檢測如圖1所示，Spinosyn A 的保留時間在 8.5 min左右，Spinosyn D的保留時間在10.1 min左右，以多殺霉素濃度為橫坐標(biāo)，Spinosyn A 和 Spinosyn D 的峰面積之和為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程為Y=13.891X+35.461，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 7，表明當(dāng)檢測液中多殺霉素濃度在40～200 mg/L時，濃度和峰面積之間存在良好的線性關(guān)系，可以用此方法檢測發(fā)酵液中多殺霉素的含量。

圖1 多殺霉素標(biāo)準(zhǔn)樣品的HPLC圖Fig.1 HPLC chromatogram for the standard solution of spinosad

2.2 多殺霉素高產(chǎn)菌株選育

2.2.1 常溫常壓等離子誘變選育 常溫常壓等離子（ARTP）對刺糖多孢菌DS0322-3的誘變效應(yīng)如圖2所示，在誘變時間為10～60 s時，致死率隨著時間的增加而增加，處理30 s后致死率達到90%左右。通過96孔板初篩統(tǒng)計了ARTP對刺糖多孢菌的突變率，在誘變時間為30 s時，刺糖多孢菌的突變率和正突變率均最高，分別為67.55%和16.34%，說明在后續(xù)試驗中利用ARTP篩選菌株時可以選擇30 s的誘變時間，減少工作量，提高工作效率。

圖2 ARTP對多刺糖多孢菌DS0322-3的誘變效應(yīng)Fig.2 The mutagenic effects of ARTP to Saccharopolyspora spinosa DS0322-3

96孔板初篩后選取高于對照組的高產(chǎn)菌株進行搖瓶復(fù)篩，結(jié)果如表2所示，有4株突變菌株的多殺霉素產(chǎn)量增長率在10%以上，誘變30 s得到的菌株AR1019-4的效價最高，為547.78 mg/L，較出發(fā)菌株增加了21.88%。

表2 高產(chǎn)突變菌株經(jīng)搖瓶培養(yǎng)時多殺霉素產(chǎn)量Table 2 Spinosad yield of high-yield mutant strains cultured in shake flasks

2.2.2 紫外誘變選育 紫外線對刺糖多孢菌DS0322-3的誘變效應(yīng)如圖3所示，在誘變時間為10～60 s時，致死率隨著誘變時間的增加而增加，處理30 s后致死率達到90%以上。通過96孔板初篩統(tǒng)計了紫外線對刺糖多孢菌的突變率，在誘變時間為40 s時，刺糖多孢菌的突變率和正突變率均最高，分別為81.53%和19.89%，說明在利用紫外線誘變篩選菌株時誘變時間可以選擇40 s，能快速高效的得到高產(chǎn)菌株。

圖3 UV對多刺糖多孢菌DS0322-3的誘變效應(yīng)Fig. 3 The mutagenic effects of UV to Saccharopolyspora spinosa DS0322-3

96孔板初篩后選取高于對照組的高產(chǎn)菌株進行搖瓶復(fù)篩，如表3所示，有5株突變菌株的多殺霉素產(chǎn)量增長率在10%以上，誘變40 s得到的菌株UV 1105-6的效價為500.28 mg/L，較原始菌株增加了14.15%。

表3 高產(chǎn)突變菌株經(jīng)搖瓶培養(yǎng)時多殺霉素產(chǎn)量Table 3 Spinosad yield of high-yield mutant strains cultured in shake flasks

2.2.3 高產(chǎn)菌株的抗性突變篩選 最小抑制濃度的確定：隨著平板中抗性物質(zhì)濃度的增加，刺糖多孢菌DS0322-3菌落生長逐漸受到抑制。將菌體完全被抑制生長的濃度視為最小抑制濃度，鏈霉素、新霉素、氯霉素、慶大霉素、紅霉素、利福平、鼠李糖和多殺霉素對刺糖多孢菌的最小抑制濃度分別為5、50、1.5、14、10、30、2 500 和 50 mg/L。

抗生素篩選濃度的確定：添加不同抗性物質(zhì)后，如圖4所示，菌落形態(tài)均發(fā)生了明顯的變化，對照平板上的菌落外緣有褐色色素，但經(jīng)過鏈霉素和氯霉素等進行抗性突變后，菌落邊緣褐色色素減少甚至消失。由于在最小抑制濃度時，固體平板上幾乎沒有菌落產(chǎn)生，故后續(xù)試驗選取具有明顯抑制作用且菌落形態(tài)良好的抑制濃度，具體濃度如表4所示。

圖4 刺糖多孢菌DS0322-3在不同抗性平板上的菌落形態(tài)Fig.4 Different colony morphologies of Saccharopolysporaspinosa DS0322-3 on resistant plates

表4 抗性物質(zhì)濃度篩選結(jié)果Table 4 Screening results of resistant substance concentration

2.2.4 以AR1019-4菌株為出發(fā)菌株進行高產(chǎn)菌株的篩選 將AR1019-4的孢子懸浮液稀釋涂布在表4處理濃度的抗性平板上，篩選結(jié)果如表5所示，有13株突變菌株的多殺霉素產(chǎn)量增長率在10%以上，在0.5 mg/L的氯霉素平板上得到的菌株Chl1215-5效價為637.12 mg/L，較出發(fā)菌株增加了16.31%，在12 mg/L的慶大霉素抗性平板上篩選到的菌株Gen1207-8，效價為597.59 mg/L。出發(fā)菌株AR1019-4和突變菌株Gen1207-8所產(chǎn)多殺霉素的液相色譜圖如圖5所示，菌株AR1019-4 D組分占比為11.14%，菌株Gen1207-8 D組分占比為30.52%，表明突變菌株Gen1207-8 D組分占比增加。

圖5 多殺霉素的HPLC圖Fig. 5 HPLC chromatogram for the spinosad

表5 高產(chǎn)突變菌株經(jīng)搖瓶培養(yǎng)時多殺霉素產(chǎn)量Table 5 Spinosad yield of high-yield mutant strains cultured in shake flasks

2.3 高產(chǎn)菌株的遺傳穩(wěn)定性檢測

將多殺霉素產(chǎn)量較對照菌株增加15%以上的2個突變菌株Spi1210-28、Chl1215-5和D組分增加至30%以上的突變菌株Gen1207-8進行3次遺傳穩(wěn)定性檢測。結(jié)果如圖6所示，菌株Gen1207-8和Chl1215-5的3次產(chǎn)量無顯著性差異（P＞0.05），且突變菌株Gen1207-8 D組分比例穩(wěn)定在30%～35%，菌株Spi1210-28的第2、3次產(chǎn)量均顯著低于第1次的產(chǎn)量（P＜0.05）。表明本研究篩選得到2株具有良好遺傳穩(wěn)定性狀的突變菌株，為實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

圖6 突變菌株的遺傳穩(wěn)定性檢測Fig.6 The heredity stability test of mutant strain

3 討論與結(jié)論

通過常溫常壓等離子體誘變，篩選到了1株效價為547.78 mg/L的突變菌株AR1019-4，較原始菌株增加了21.06%。通過紫外誘變篩選高產(chǎn)突變株，效價較原始菌株最多提高14.15%。常溫常壓等離子誘變是一種新型的誘變技術(shù)，原始菌株可能未接觸過該種誘變方式，菌株對等離子體比較敏感，所以有著較高的突變率。閔勇等[18]利用ARTP誘變處理多粘類芽孢桿菌NBF188，篩選到了1株使多粘菌素的產(chǎn)量提高106.2%的高產(chǎn)突變株，該突變株對番茄青枯病的抑制效果顯著優(yōu)于原始菌株。紫外誘變是一種經(jīng)典的誘變方式，但是難以獲得產(chǎn)量變化大的菌株，本試驗結(jié)果與大部分文獻報道相一致，紫外誘變提高產(chǎn)量的幅度一般低于15%。孫夢潔等[19]通過紫外線誘變篩選葡萄球菌D14，篩選到的陽性突變體的活性只有原始菌株1.04倍，所以為篩選得到高產(chǎn)菌株，紫外誘變經(jīng)常與其他育種技術(shù)相結(jié)合，如ARTP誘變，亞硝基胍誘變，抗生素突變篩選，原生質(zhì)體融合等[20-21]。

通過抗生素突變技術(shù)，以ARTP誘變得到的高產(chǎn)突變菌株AR1019-4作為出發(fā)菌株，獲得1株具有氯霉素抗性的高產(chǎn)菌株Chl 1215-5，效價為637.12 mg/L，較出發(fā)菌株增加了16.31%；慶大霉素抗性篩選出1株Spinosyn D組分增加至30%～35%的突變菌株 Gen 1207-8，效價為 597.59 mg/L，效價較出發(fā)菌株提高了12.18%，且該2種突變株均可穩(wěn)定遺傳。抗生素突變技術(shù)通過向微生物體內(nèi)引入一些特定的突變，改變與微生物代謝途徑相關(guān)的核糖體變化，達到提高代謝產(chǎn)物的目的。氯霉素能夠與50S亞基結(jié)合，阻斷新肽鏈的形成，抑制蛋白質(zhì)的合成。張金兒等[22]將NTG誘變的水稻惡苗病菌6028菌株的原生質(zhì)體引入氯霉素抗性，使赤霉素產(chǎn)量比出發(fā)菌高20%。慶大霉素能夠修飾改造微生物體內(nèi)的翻譯元件，分析多殺霉素的合成途徑可知，多殺霉素的聚酮合成酶有10個延伸模件和1個裝載模件，其中只有裝載模件和延伸模件3能夠以丙酸為底物，大多聚酮合成酶以乙酸為底物，延伸模件8對底物的特異性不強，乙酸和丙酸都可以利用，利用乙酸時產(chǎn)生Spinosyn A，利用丙酸時產(chǎn)生 Spinosyn D，但是利用丙酸的幾率只有15%左右，所以多殺霉素中Spinosyn D組分只占10%～15%[23-25]。本試驗獲得慶大霉素抗性的菌株Gen1207-8 Spinosyn D組分比例提高至30%～35%，可能是因為獲得慶大霉素抗性，增加了延伸模件8對丙酸的催化機率。

本研究通過ARTP誘變、UV誘變和抗性突變技術(shù)選育多殺霉素高產(chǎn)菌株，共篩選了1 536株突變菌株，得到1株具有氯霉素抗性的突變菌株，效價為637.12 mg/L，較出發(fā)菌株DS0322-3增加了41.76%，為工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)，前期文獻均為多殺霉素整體產(chǎn)量提高[2-12]，未出現(xiàn)關(guān)于Spinosyn D占比增加的報道，本研究得到1株具有慶大霉素抗性的突變菌株，Spinosyn D組分比例由10%～15%增加至30%～35%，效價為597.59 mg/L，但Spinosyn D組分的殺蟲活性有待進一步研究。