基于ISSR標(biāo)記的丁香屬植物親緣關(guān)系分析

姚瑞紅，魏 杰，孟 昕，金夢(mèng)然，劉雅蘭，寇紫倩，史寶勝

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 園林與旅游學(xué)院,河北 保定 071000）

丁香屬植物樹(shù)形優(yōu)美、花期長(zhǎng)是城市園林綠化的主要樹(shù)種。木犀科（Oleaceae）丁香屬（SyringaSpp.）植物主要分布在亞洲溫帶地區(qū)及歐洲東南部[1]。我國(guó)丁香屬植物約有32種，自西南至東北各地都有[2]。美國(guó)、英國(guó)、加拿大、德國(guó)、俄羅斯等國(guó)家普遍引種歐丁香，并成功選育出1 800多個(gè)品種。隨著丁香新品種的快速增長(zhǎng)，品種混亂、命名不規(guī)范、種系定位不一、親本來(lái)源不明等問(wèn)題接踵出現(xiàn)，阻礙了丁香產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

林奈建立丁香屬，并將其歸為木犀科，這種劃分方式很少有爭(zhēng)議，但是對(duì)丁香屬的屬下分類等級(jí)問(wèn)題，學(xué)者們觀點(diǎn)不一。Rehder[3]和 Fiala[4]認(rèn)為丁香屬應(yīng)分為2個(gè)亞屬。而張美珍[5]將丁香分為2組4系，包括短花冠組和長(zhǎng)花冠組，長(zhǎng)花冠組可分為歐丁香系、羽葉丁香系、巧玲花系、頂生花序系，但該分類方法弱化了頂生花序類和側(cè)生花序類的區(qū)別，劃分存在缺陷，對(duì)許多起源不明確或具有多親本品種的分類鑒定具有局限性。

近年來(lái)，ISSR技術(shù)被廣泛應(yīng)用于包括植物在內(nèi)的不同生物的遺傳多樣性研究[6-7]。目前，ISSR分子標(biāo)記技術(shù)已廣泛應(yīng)用與櫻屬[7]、蘭屬[9]等多種植物的親緣關(guān)系及遺傳多樣性的研究。針對(duì)不同品種丁香屬植物的分子標(biāo)記研究較少，Yang[10]利用EST-SSR標(biāo)記對(duì)紫丁香群體的遺傳多樣性進(jìn)行了分析，鑒定出17個(gè)與花性狀相關(guān)的SSR標(biāo)記。思彬彬[11]從100 條ISSR引物中篩選出3條引物可以擴(kuò)增出多態(tài)性特征條帶，用于鑒別白花和紫花丁香。陳秋月[12]用11條ISSR引物對(duì)野生和栽培紫丁香種群的遺傳多樣性進(jìn)行了研究，野生種群比栽培種群表現(xiàn)出較高的遺傳多樣性。ISSR作為一種更高效、更多態(tài)性的分子標(biāo)記，廣泛應(yīng)用于鑒別植物親緣關(guān)系。本研究利用ISSR分子技術(shù)對(duì)40個(gè)丁香品種親緣關(guān)系進(jìn)行分析，構(gòu)建DNA指紋圖譜，以期從分子水平闡述其親緣關(guān)系，實(shí)現(xiàn)鑒別不同丁香種（品種）目的，了解丁香品種的遺傳背景，為丁香品種鑒定、品種分類及雜交育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

40份植物材料于2020年9月從河北農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)基地和北京植物園采集。選擇生長(zhǎng)健壯、無(wú)病蟲(chóng)害的植物幼嫩葉片，用錫箔紙裝置于液氮桶中，放置在實(shí)驗(yàn)室-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA提取 利用改良CTAB法[13-14]提取40份丁香屬植物材料總DNA。根據(jù)康為世紀(jì)試劑盒說(shuō)明書提取總DNA。

1.2.2 基因組DNA檢測(cè)方法 用Nano Drop 2000檢測(cè)提取DNA濃度和純度[15]，采用瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)不同方法提取的DNA的完整性[16]。

1.2.3 ISSR-PCR反應(yīng)體系設(shè)計(jì) 初篩引物：利用哥倫比亞大學(xué)和楊曉霞等[17-19]公布的32條引物在表型差異明顯的裂葉丁香、喜馬拉雅丁香、暴馬丁香3種植物中進(jìn)行初步篩選，選出擴(kuò)增產(chǎn)物主帶明顯，條帶清晰的引物。ISSR-PCR反應(yīng)體系：在25 μL的反應(yīng)體系中，DNA(40 ng/μL)模板 1 μL，引物(10 μmol/L) 2 μL，2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，ddH2O 補(bǔ)足。擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 預(yù)變性 5 min；94 ℃ 變性 45 s，退火 45 s，72 ℃ 延伸 90 s，30 個(gè)循環(huán)；最后 72 ℃保持 7 min，4 ℃保存。

DNA模板和循環(huán)數(shù)的優(yōu)化：用ddH2O將裂葉丁香、喜馬拉雅丁香、暴馬丁香DNA濃度分別稀釋到 10、20、40、60、80、100 ng/μL，作為 ISSRPCR的模板。

選擇20 ng的DNA模板，擴(kuò)增反應(yīng)程序同上，循環(huán)數(shù)分別設(shè)置為25、30、35、40。

退火溫度優(yōu)化：利用上述優(yōu)化的反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件，對(duì)初篩的引物，按照每個(gè)引物Tm值，設(shè)置10個(gè)不同梯度的溫度進(jìn)行PCR擴(kuò)增。最終篩選擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性好的引物的最佳退火溫度。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 電泳圖譜中的每1條帶可代表1個(gè)引物的結(jié)合位點(diǎn)，采用人工讀帶的方法，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)輸Excel表格，建立ISSR擴(kuò)增條帶0/1矩陣數(shù)據(jù)庫(kù)[16]。利用POPGENE 32軟件分析指標(biāo)有觀測(cè)等位基因數(shù)（observed number of alleles,Na）、有效等位基因數(shù)（effective number of alleles,Ne）、Nei’s遺傳多樣性指數(shù)（H）、Shannon’s信息指數(shù)（I）。利用 NTSYS pc 2.10e軟件進(jìn)行遺傳相似性系數(shù)計(jì)算，使用非加權(quán)組平均法（UPGMA）繪制聚類分析圖。

表1 40份丁香屬材料信息Table 1 The information on 40 species of Syringa materials

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA提取與檢測(cè)

采用CTAB法和試劑盒快速提取法進(jìn)行DNA提取，從圖可看出用CTAB法提取DNA含有較多雜帶；根據(jù)試劑盒說(shuō)明書提取DNA，條帶清晰，無(wú)拖尾現(xiàn)象（圖1）。選用康為世紀(jì)試劑盒提取丁香植物的總DNA。

圖1 不同方法提取總DNAFig. 1 The total DNA extracted by different methods

利用DNA提取試劑盒提取40份丁香屬植物材料的DNA，結(jié)果均是1條清晰的條帶（圖2），OD260/OD280的值介于1.8～2.0，無(wú)RNA污染、拖尾和彌散現(xiàn)象，利用Nano Drop 2000測(cè)得DNA的質(zhì)量濃度為25～680 ng/μL。提取的DNA可以滿足ISSR-PCR反應(yīng)對(duì)模板DNA的質(zhì)量要求。

圖2 母液 DNA完整性鑒定Fig. 2 The DNA integrity identification of mother liquor

2.2 ISSR-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化

2.2.1 DNA濃度篩選 PCR擴(kuò)增反應(yīng)的原料是模板 DNA，用量的多少對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)有著重要影響。模板DNA濃度過(guò)低時(shí)，導(dǎo)致擴(kuò)增結(jié)果得率少；過(guò)高則會(huì)發(fā)生錯(cuò)配現(xiàn)象。本研究設(shè)置了10、20、40、60、80、100 ng/μL 6 個(gè)濃度梯度，結(jié)果如圖3。從圖中可以看出，模板DNA濃度為20 ng/μL時(shí)，擴(kuò)增的條帶清晰，無(wú)非特異性條帶產(chǎn)生。因此，本研究ISSR-PCR擴(kuò)增體系模板DNA的最適范圍為20 ng/μL。

圖3 不同模板濃度對(duì)擴(kuò)增的影響Fig. 3 Effect of different template concentrations on amplification

2.2.2 循環(huán)數(shù)篩選 循環(huán)數(shù)對(duì)PCR結(jié)果產(chǎn)生影響，循環(huán)數(shù)太多，由于反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，非特異產(chǎn)物的擴(kuò)增相應(yīng)增加。由圖4可知，循環(huán)數(shù)為25，擴(kuò)增的條帶不清晰；循環(huán)數(shù)為35時(shí)，擴(kuò)增的條帶清晰、分明。因此，ISSR-PCR反應(yīng)體系中，設(shè)置循環(huán)數(shù)為35最合適。

注：1～3為25循環(huán)；4～6為30循環(huán)；7～9為35循環(huán)；10～12為40循環(huán)。

2.2.3 退火篩選 影響PCR擴(kuò)增的一個(gè)重要條件是退火溫度。溫度過(guò)高導(dǎo)致引物與模板結(jié)合差、特異性強(qiáng)、多態(tài)性差、產(chǎn)物少；過(guò)低則導(dǎo)致引物與模板非特異性結(jié)合。本研究根據(jù)所篩選出引物的Tm值上下設(shè)置10個(gè)溫度梯度進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選不同引物的退火溫度。各引物篩選后的最適退火溫度見(jiàn)表2，引物UBC841退火溫度的篩選結(jié)果見(jiàn)圖5。

表2 ISSR分析的引物序列Table 2 The primers sequences of ISSR analysis

圖5 UBC841退火溫度篩選Fig. 5 The UBC841 annealing temperature screening

2.3 ISSR引物篩選與擴(kuò)增結(jié)果

本文對(duì)32個(gè)ISSR引物進(jìn)行初篩、復(fù)篩，最終確定引物退火溫度，共篩選出13個(gè)擴(kuò)增條帶多、條帶清晰、重復(fù)性好的ISSR引物，部分引物篩選結(jié)果如圖6所示。40份丁香屬材料共擴(kuò)增出264個(gè)重復(fù)性好、條帶清晰、穩(wěn)定性好的位點(diǎn)，其中多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)264個(gè)，占總位點(diǎn)數(shù)的100%；各引物擴(kuò)增位點(diǎn)數(shù)在12～29之間，平均為20.31個(gè)位點(diǎn)。擴(kuò)增結(jié)果說(shuō)明，這13條引物擴(kuò)增得到的條帶多態(tài)性豐富，可以用于丁香屬材料間親緣關(guān)系分析。

圖6 引物UBC842的PCR擴(kuò)增電泳圖譜Fig. 6 The PCR amplification electrophoresis map of primer UBC842

2.4 遺傳多樣性分析

利用POPGENE 32軟件分別對(duì)40份丁香屬材料的遺傳多樣性進(jìn)行分析。結(jié)果顯示：40份丁香材料觀測(cè)等位基因數(shù)(Na)值均為2.000 0。有效等位基因數(shù)(Ne)最大值出現(xiàn)在引物ISSR2-2(1.961 5)，平均Ne值為1.187 7。平均Nei’s遺傳多樣性指數(shù)(H)為 0.144 0，Shannon’s信息指數(shù) (I)為 0.260 5，均在引物 UBC840 位點(diǎn)出現(xiàn)H(0.495 4)和I(0.688 6)最大值，顯示了丁香屬植物DNA具有較高的多態(tài)性，有著豐富的遺傳多樣性。

2.5 親緣關(guān)系分析

利用13條ISSR引物產(chǎn)生的標(biāo)記信息，經(jīng)NTSYS 2.10分析軟件計(jì)算40份丁香種間遺傳相似系數(shù)變化范圍為0.655 3～0.950 8，見(jiàn)表3。其中 ‘裘利’和 ‘裘利紫花重瓣’ 遺傳相似系數(shù)最大為0.950 8，說(shuō)明這2個(gè)品種之間親緣關(guān)系最近，遺傳差異相對(duì)較小?！募舅{(lán)’‘漂移’遺傳相似系數(shù)最小為0.655 3，說(shuō)明兩者親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，遺傳差異相對(duì)較大。

表3 40份丁香屬材料遺傳相似系數(shù)Table 3The genetic similarity coefficient of 40 Syringamaterials

2.6 聚類分析

為了確定各丁香種類間的親緣關(guān)系，采用NTSYS2.10分析軟件對(duì)0/1矩陣按UPGMA進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建樹(shù)狀聚類圖（圖7）。結(jié)果表明遺傳相似性系數(shù)為0.742 0時(shí)，群體可分為4個(gè)類群。

圖7 40 份丁香屬的聚類圖Fig.7 The UPGMA dendrogram for 40 Syringa materials

類群I包含的丁香最多，有紫丁香、白丁香、‘大花重瓣’歐丁香等35個(gè)丁香品種。在遺傳相似系數(shù)為0.782 0時(shí)，花葉丁香和什錦丁香親緣關(guān)系較近；‘大花重瓣’歐丁香和紫丁香聚為一類，其花型、花色表現(xiàn)高度相似，花期略有不同；‘羅蘭紫’‘香雪’‘紫云’‘晚花紫’、朝鮮丁香和朝鮮紫丁香親緣關(guān)系較近，其中‘羅蘭紫’‘香雪’‘紫云’花瓣均為重瓣，‘羅蘭紫’和‘香雪’花期差異不顯著，‘晚花紫’和朝鮮丁香遺傳相似度較高，花單瓣、花色均為淡紫色，以上均為歐丁香系，與傳統(tǒng)分類一致?！鹕珪r(shí)光’和四川丁香聚為一類；‘裘利’‘裘利紫花重瓣’‘瓷藍(lán)’和‘占姆士’親緣關(guān)系近，其葉形、葉尖與葉片質(zhì)地高度相似；日本丁香、匈牙利丁香、喜馬拉雅丁香、紅丁香聚為一類，與高洪曉[20]利用AFLP分子標(biāo)記將匈牙利丁香和喜馬拉雅丁香聚為一類結(jié)果相符，但與日本丁香聚為一類，可能是在育種過(guò)程中，有頂生花序的血統(tǒng)加入；裂葉丁香、‘沙宣’、白丁香分別單獨(dú)聚為一類。遺傳相似系數(shù)為0.792 0時(shí)，‘象牙段’和北京丁香、‘金園’、暴馬丁香聚在一起，短花管組位于長(zhǎng)花冠組內(nèi)部，與何淼[21]研究結(jié)果一致。遺傳相似系數(shù)為0.812 0時(shí)，莫斯加與遼東丁香親緣關(guān)系較近，這表明莫斯加可能與頂生花序系親緣關(guān)系較近。遺傳相似系數(shù)在0.851 6時(shí)，‘驕傲四季’與小葉丁香、關(guān)東丁香聚在一起，與‘驕傲四季’是小葉丁香的變種結(jié)果一致，均為巧玲花系，與傳統(tǒng)分類一致。

類群Ⅱ?qū)ⅰ岘嚒汀鹕∪~’聚為一類。類群Ⅲ有‘漂移’和‘天府信步’。類群Ⅳ將‘四季藍(lán)’單獨(dú)聚為一類。根據(jù)聚類分析結(jié)果，40個(gè)品種均被聚類分開(kāi)，說(shuō)明丁香種類間具有一定的遺傳差異，ISSR標(biāo)記在丁香種質(zhì)資源分析和品種鑒定研究方面具有較好的效果。

2.7 指紋圖譜的構(gòu)建

本研究利用核心引物 UBC834 構(gòu)建了 40 種丁香屬植物的 DNA 指紋圖譜（圖8），該指紋圖譜可用于40種丁香的分類與鑒定。

圖8 UBC836 引物構(gòu)建的 40 種丁香種質(zhì)資源 DNA 指紋圖譜Fig. 8 The DNA fingerprints of 40 Syringa germplasm resources constructed by UBC836 primers

3 討論與結(jié)論

ISSR分子標(biāo)記是有價(jià)值的工具，用于識(shí)別和評(píng)估物種之間的遺傳多樣性[22-23]。本研究從32條ISSR引物中篩選出13條引物用于丁香屬植物親緣關(guān)系分析，13條引物共擴(kuò)增264條帶，其中多態(tài)性條帶264條，多態(tài)性位點(diǎn)占100%，擴(kuò)增的多態(tài)性條帶清晰、無(wú)拖帶現(xiàn)象，表現(xiàn)出較高的遺傳多樣性。思彬彬[11]用3條ISSR引物來(lái)鑒別紫花與白花丁香，在陳秋月[12]、楊亞珺[19]、Yunyao Yang[10]的研究中發(fā)現(xiàn)，ISSR、SSR分子標(biāo)記在丁香屬植物中均表現(xiàn)出較高的遺傳多樣性。由此說(shuō)明，ISSR分子標(biāo)記技術(shù)可用于丁香屬種質(zhì)資源的分類、品種的鑒定。

通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)各品種間遺傳相似系數(shù)相差較大，丁香屬植物之間遺傳多樣性較高。歐美對(duì)本屬進(jìn)行雜交育種已有近百年的歷史，先后曾選育出數(shù)百個(gè)栽培品種。有些栽培品種已經(jīng)無(wú)法確定其親本和親緣關(guān)系。本試驗(yàn)選取的一些丁香品種親本不明，聚類結(jié)果表明，‘四季藍(lán)’‘天府信步’‘漂移’‘金色小葉’沒(méi)有聚在傳統(tǒng)分類學(xué)的內(nèi)部，可能是由于這些國(guó)外品種與國(guó)內(nèi)丁香品種血統(tǒng)差距較大，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，這一結(jié)果也證實(shí)了丁香屬植物遺傳多樣性較高[24]。不同系之間的聚類結(jié)果有交叉現(xiàn)象，巧玲花系的小葉丁香、關(guān)東丁香聚在了頂生花序系毛葉丁香和遼東丁香的內(nèi)部，可能巧玲花系和頂生花系存在較近的親緣關(guān)系[20]。傳統(tǒng)分類方法將丁香屬植物劃分為2組4系，本研究發(fā)現(xiàn)短花冠組聚在長(zhǎng)花冠組內(nèi)部，并且首先與巧玲花系和頂生花序系聚類，該研究與Li等[25]通過(guò)研究rDNA的ITS與ETS結(jié)果表現(xiàn)一致，他們認(rèn)為應(yīng)該去除組的劃分。

DNA指紋圖譜是以分子標(biāo)記為基礎(chǔ)發(fā)展起來(lái)的遺傳標(biāo)記方式，因具有多位點(diǎn)性、高變異性、簡(jiǎn)單而穩(wěn)定的遺傳性，已廣泛應(yīng)用在品種鑒定、種質(zhì)資源分類等多方面[26]。崔學(xué)強(qiáng)[27]采用ISSR分子標(biāo)記用3個(gè)引物構(gòu)建DNA指紋圖譜單獨(dú)鑒別出22種石斛蘭。陳必芹[28]利用ISSR標(biāo)記，建立了44個(gè)四照花栽培品種及其親本的指紋圖譜。但未見(jiàn)利用ISSR分子標(biāo)記建立丁香屬植物指紋圖譜的報(bào)道，本研究利用UBC836單獨(dú)鑒別出40份丁香材料，每個(gè)材料都有一套獨(dú)特的指紋圖譜，為丁香屬植物的鑒定提供了更高效的依據(jù)。

本研究利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)，在分子生物學(xué)水平上揭示不同丁香材料具有豐富的遺傳多樣性，并對(duì)我國(guó)不同丁香屬材料的親緣關(guān)系進(jìn)行了區(qū)分和鑒定，證明了ISSR分子標(biāo)記法是有效和可靠精準(zhǔn)鑒定丁香種質(zhì)資源的方法，為雜交育種親本選育提供理論依據(jù)。