高丹草低氫氰酸含量性狀主效QTL PA7-2的精細(xì)定位

吳國(guó)芳， 于 卓， 于肖夏， 楊東升， 盧倩倩， 李景偉， 李佳奇

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院， 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010019)

高丹草是高粱(Sorghumbicolor)與蘇丹草(Sorghumsudanense)種間雜交育成的一年生重要飼用牧草之一，具有雜種優(yōu)勢(shì)強(qiáng)、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、分蘗數(shù)多，再生性好、耐鹽堿、可多次刈割利用等優(yōu)良特性[1-4]，但是莖葉中含有一定量的氫氰酸含量，家畜采食過量會(huì)引起中毒現(xiàn)象[5-6]，生產(chǎn)上亟待培育低氫氰酸含量(每公斤鮮草≤15 mg)的高丹草新品種。

數(shù)量性狀QTL(Quantitative trait locus，QTL)定位分為初步定位和精細(xì)定位。初步定位到的QTL區(qū)域，精度一般>10 cM，難以確定QTL的具體位置，并且不能判斷該區(qū)域是含有1個(gè)主效QTL還是多個(gè)微效QTL[7]。精細(xì)定位是在初步定位的基礎(chǔ)上，針對(duì)主效QTL區(qū)域，構(gòu)建遺傳背景相同的次級(jí)分離群體，在已構(gòu)建遺傳圖譜的基礎(chǔ)上探索新的分子標(biāo)記，對(duì)現(xiàn)有的圖譜進(jìn)行補(bǔ)充，增大分子標(biāo)記的密度，將目標(biāo)基因位點(diǎn)控制在一個(gè)更精確的區(qū)間內(nèi)，精度一般在1～5 cM[8]。群體分離分析法(Bulked segregation analysis，BSA)是與分子標(biāo)記相結(jié)合快速篩選目標(biāo)性狀相關(guān)標(biāo)記的方法，通常與簡(jiǎn)單重復(fù)序列(Simple sequence repeats，SSR)分子標(biāo)記結(jié)合應(yīng)用，即基于BSA-SSR方法，借助緊密連鎖的分子標(biāo)記和表型數(shù)據(jù)進(jìn)行主效QTL定位[9-11]。通過主效QTL位點(diǎn)的兩個(gè)側(cè)翼標(biāo)記篩選等位基因重組株QIRs(Quantitative trait locus (QTL) isogenic recombinants)，選出與表型性狀相關(guān)的基因位點(diǎn)，并進(jìn)行選擇性基因分型、表型鑒定和精細(xì)定位[12,13]，這是從正向遺傳學(xué)角度發(fā)掘數(shù)量性狀主效基因、功能解析及標(biāo)記輔助育種的重要途徑[14-17]。目前在水稻、小麥、玉米和大豆等作物上已有相關(guān)研究報(bào)道[18-21]，而在飼草上迄今尚未見有報(bào)道。

本課題組前期通過研究高丹草高密度分子遺傳圖譜構(gòu)建、氫氰酸含量性狀的QTL定位發(fā)現(xiàn)，氫氰酸含量性狀是由多基因調(diào)控的數(shù)量性狀，受遺傳因子和環(huán)境因素的影響[5-6]。其中，房永雨等[22]定位了控制氫氰酸含量性狀的2個(gè)微效QTL cn1和cn2，位于高丹草5號(hào)和7號(hào)染色體上，遺傳貢獻(xiàn)率分別為7.4%和8.6%；于肖夏等[23]定位了1個(gè)低氫氰酸含量主效QTLPA7-1，其位于7號(hào)染色體，遺傳貢獻(xiàn)率為25.3%；吳國(guó)芳等[5]在多個(gè)環(huán)境下定位了控制氫氰酸含量性狀的16個(gè)QTLs，它們分布在1，2，4，6，7，8和10號(hào)染色體上，遺傳貢獻(xiàn)率范圍為0.87%～39.9%，其中貢獻(xiàn)率大于20%的主效QTLs共4個(gè)，與低氫氰酸含量性狀相關(guān)的有3個(gè)，分布在4、6和7號(hào)染色體上，在2個(gè)環(huán)境中表現(xiàn)穩(wěn)定的QTL有9個(gè)，在4個(gè)環(huán)境中找到一個(gè)新的表現(xiàn)穩(wěn)定的主效QTLPA7-2，遺傳貢獻(xiàn)率為33.1%。

本試驗(yàn)采用BSA-SSR方法，以高丹草F2分離群體和其親本為材料，從中選出等位基因重組株QIRs群體，并套袋自交獲得F3群體，通過鑒定F3群體低氫氰酸含量基因型得到重組株后，重點(diǎn)對(duì)主效QTLPA7-2進(jìn)行精細(xì)定位研究，以期為高丹草低氫氰酸含量性狀候選基因挖掘、功能解析及分子標(biāo)記輔助育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與種植

材料為散穗高粱×紅殼蘇丹草的F2分離群體1 200個(gè)單株、F3分離群體500個(gè)單株及其親本。分別于2019年4月22日與2020年5月24日種植在內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)場(chǎng)，行距為50 cm，株距為20 cm，試驗(yàn)地位于呼和浩特市賽罕區(qū)，土壤為沙壤土，pH=7.8～8.2，肥力中等(N為60.5 mg·kg-1，P為8.5 mg·kg-1，K為100.6 mg·kg-1)[5]。生長(zhǎng)期間根據(jù)生長(zhǎng)狀況及時(shí)施肥、灌水，確保植株對(duì)養(yǎng)分和水分的需求。

1.2 氫氰酸含量測(cè)定

在高丹草拔節(jié)期，株高約為100 cm時(shí)，田間剪取F2和F3分離群體單株及親本的新鮮莖葉，按單株用微型粉碎器粉碎混勻，每個(gè)樣品分別稱取1.0 g，進(jìn)行蒸餾。采用汪建飛等[24]提出的異煙酸-吡唑啉酮顯色測(cè)定法(λmax=636.5 nm)測(cè)定樣品中的氫氰酸含量，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次。

1.3 DNA提取及BSA基因池建立

用天根公司生產(chǎn)的植物基因組DNA提取試劑盒提取高丹草F2、F3代低氫氰酸含量(<15 mg·kg-1，簡(jiǎn)稱低氰)和高氫氰酸含量(>300 mg·kg-1，簡(jiǎn)稱高氰)的極端單株各10株及母本散穗高粱(高氰)和父本紅殼蘇丹草(低氰)的DNA。從極端株中各吸取5 μL的DNA進(jìn)行等量混合，形成低氰基因池和高氰基因池，用于篩選與低氫氰酸含量性狀相關(guān)的SSR標(biāo)記。

1.4 SSR引物設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增

根據(jù)高粱基因組EST序列，借助SSR Hunter軟件查找SSR位點(diǎn)，利用Primer 5軟件設(shè)計(jì)出SSR引物序列[25]，委托南京金瑞斯生物科技有限公司合成。

PCR反應(yīng)體系總體積為20 μL，其中含Mg2+的10×buffer 2.0 μL，2.5 mM的dNTP 1.5 μL，5 U·μL-1的Taq-poLymerase 0.2 μL，10 ng·μL-1上下游引物各1 μL，模板DNA 2 μL，ddH2O 12.3 μL。

擴(kuò)增程序?yàn)檠h(huán)前94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，38個(gè)循環(huán)；循環(huán)后72℃延伸10 min，4℃保存。PCR反應(yīng)結(jié)束后，加入5.0 μL變性劑，95℃變性5 min，迅速取出在冰上冷卻，置-20℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 等位基因重組株(QIRs)篩選

QTL等位基因重組株(QTL isogenic recombinants，QIRs)是指在檢測(cè)到的QTLs中，只在1個(gè)QTL位點(diǎn)是雜合的，目標(biāo)區(qū)域會(huì)發(fā)生大量重組，其他QTLs位點(diǎn)是純合的單株[26]。本試驗(yàn)用課題組前期得到的PA7-2的兩個(gè)側(cè)翼標(biāo)記(B4195-500和Xtxp31-600)對(duì)1200個(gè)F2分離群體進(jìn)行篩選，選出PA7-2區(qū)域?yàn)殡s合的單株，構(gòu)成QIRs群體。

1.6 遺傳連鎖圖譜構(gòu)建與QTL定位

1.6.1遺傳連鎖圖譜構(gòu)建 采用Join map 4.0遺傳作圖軟件，設(shè)置LOD閾值≥3.0條件下，對(duì)高丹草F3代群體分離單株基因組DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得的SSR多態(tài)性標(biāo)記及課題組前期得到的QTLPA7-2側(cè)翼的5個(gè)SSR標(biāo)記(B4195-500、Xtxp183-950-Xtxp121-470-Xtxp321-220和Xtxp31-600)進(jìn)行遺傳作圖，用Map chart 2.5軟件繪制出高丹草的新連鎖群圖譜。

1.6.2QTL定位 采用區(qū)間作圖法(Interval mapping，IM)，Map QTL 6.0分析軟件，在掃描步長(zhǎng)為1.0 cM、α=0.001的水平上，利用置換檢測(cè)(Permutation test)檢驗(yàn)法做1 000次重復(fù)，將假陽性錯(cuò)誤概率限制在5%，估算QTL范圍內(nèi)的LOD≥3.0閾值，對(duì)F3群體單株的低氫氰酸含量測(cè)定值進(jìn)行QTL定位分析，檢測(cè)出與低氫氰酸含量相關(guān)的QTLPA7-2。

1.7 主效QTL PA7-2精細(xì)定位

為了驗(yàn)證高丹草低氫氰酸含量主效QTLPA7-2的穩(wěn)定性及保證精細(xì)定位的準(zhǔn)確性，從F2群體中選取了在PA7-2處為雜合，PA7-1處為純合，并且在側(cè)翼標(biāo)記區(qū)域的標(biāo)記表型分別為低氫氰酸含量和高氫氰酸含量的極端重組株各5株套袋自交獲得F3種子，從每個(gè)極端單株中選取顆粒飽滿的50粒種子(共500粒種子)，于2020年5月10日在內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)場(chǎng)試驗(yàn)地種植形成500個(gè)單株的F3分離群體。

在精細(xì)定位區(qū)間內(nèi)進(jìn)一步開發(fā)SSR標(biāo)記以縮小定位區(qū)間。通過高粱基因組序列信息查找與氫氰酸性狀相關(guān)的基因序列，然后利用網(wǎng)站(http://archive.gramene.org/markers/)信息設(shè)計(jì)了12對(duì)特異SSR引物(表1)，對(duì)F3精細(xì)定位群體進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到SSR多態(tài)性標(biāo)記，建立遺傳圖譜并進(jìn)行主效QTLPA7-2精細(xì)定位[27]。進(jìn)而利用與QTLPA7-2緊密連鎖的SSR標(biāo)記對(duì)F3精細(xì)定位群體單株中的30個(gè)QIRs株進(jìn)行精細(xì)定位。極端個(gè)體挑選的原則為：低氫氰酸含量顯著小于隱性對(duì)照CK1(10.99 mg·kg-1)，高氫氰酸含量顯著大于雜合型對(duì)照CK2(134.37 mg·kg-1)；高氫氰酸含量極顯著大于顯性對(duì)照CK3(323.40 mg·kg-1)。從每個(gè)對(duì)照中隨機(jī)選取20個(gè)植株，測(cè)定其氫氰酸含量的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，將這些值與極端重組的值進(jìn)行比較，確定關(guān)鍵重組位點(diǎn)[27]。

表1 12對(duì)特異SSR引物序列Table 1 The nucleotide sequences of 12 pairs of specific SSR primers combinations

1.8 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)

用Excel 2007軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，利用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行氫氰酸含量性狀表型正態(tài)分布分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 氫氰酸含量性狀分布特征

在株高約100 cm時(shí)母本散穗高粱莖葉鮮草氫氰酸含量均極顯著地高于父本紅殼蘇丹草，其雜種F2代群體1 200個(gè)單株的氫氰酸含量性狀分離明顯，大多數(shù)個(gè)體介于雙親之間，少部分個(gè)體呈超親現(xiàn)象，且測(cè)定值頻率分布符合正態(tài)特征(圖1)，偏度和峰度均小于1(表2)，表明高丹草氫氰酸含量性狀呈數(shù)量性狀遺傳，可用于QTL定位分析。

圖1 高丹草F2群體氫氰酸含量測(cè)定值頻率分布圖Fig. 1 Frequency distribution of hydrocyanic acid contents in F2 populations of sorghum-sudangrass hybridF：♀散穗高粱；M：♂紅殼蘇丹草；n為群體大??；p為群體類型；箭頭表示各親本氫氰酸含量值F:Female parent scattered ear sorghum;M:Male parent red hull sudangrass;n is the population size;p is population type. Arrows represent the hydrocyanic acid content values of parents

表2 高丹草F2群體及其親本氫氰酸含量性狀表型變異Table 2 Phenotypic variation of hydrocyanic acid content in F2 population and its parents of sorghum-sudangrass hybrid 單位：mg·kg-1

2.2 重組株(QIRs)篩選

利用定位獲得的QTLs緊密連鎖的側(cè)翼標(biāo)記，以低氫氰酸含量主效QTLPA7-2(B4195-500、Xtxp31-600)區(qū)域?yàn)殡s合的單株進(jìn)行篩選，從1200個(gè)單株的F2大群體中篩選到121個(gè)重組株形成了PA7-2的QIRs群體，該群體呈偏正態(tài)分布，大部分單株氫氰酸含量≤60 mg·kg-1，比低氰父本紅殼蘇丹草的含量高，極顯著低于母本散穗高粱(260 mg·kg-1)，表明篩選出的重組株大部分屬于低氫氰酸含量，且是雜合的(圖2和表3)。

表3 主效QTL PA7-2區(qū)域的部分低氰QIRs的獲得Table 3 Partial low-cyanide QIRs obtainment in the major QTL PA7-2 region

圖2 高丹草F2代QIRs株氫氰酸含量測(cè)定值頻率分布圖Fig. 2 Frequency distribution of hydrocyanic acid contents in F2 generation quantitative trait locus isogenic recombinants of sorghum-sudangrass hybridF：♀散穗高粱；M：♂紅殼蘇丹草；n為群體大??；p為群體類型；箭頭表示雙親的氫氰酸含量值F:Female parent scattered ear sorghum;M:Male parent red hull sudangrass;N is the population size;P is population type. Arrows represent the hydrocyanic acid content values of each parent

2.3 F3精細(xì)定位QIRs群體的建立

從QIRs中獲得的極端單株(低氰植株≤15 mg·kg-1，高氰植株>260 mg·kg-1)經(jīng)套袋自交后，得到F3分離群體，用QTLPA7-2的側(cè)翼標(biāo)記(B4195-500、Xtxp183-950、Xtxp121-470、Xtxp321-220和Xtxp31-600)篩選該群體，得到130個(gè)重組株構(gòu)成了PA7-2的精細(xì)定位群體，其氫氰酸含量亦呈正態(tài)性分布，大多數(shù)重組株的氫氰酸含量<60 mg·kg-1，為低氰雜合型，表明該群體用于主效QTLPA7-2的精細(xì)定位是可行的(圖3,表4)。

表4 高丹草的F3代部分QIRs氫氰酸含量性狀分離Table 4 Segregation of hydrocyanic acid content characters of partial quantitative trait locus isogenic recombinants in F3 generation of sorghum-sudangrass hybrid

圖3 高丹草F3代QIRs株氫氰酸含量測(cè)定值頻率分布圖Fig. 3 Frequency distribution of hydrocyanic acid contents in F3 generation quantitative trait locus isogenic recombinants of sorgum-sudangrass hybridF：♀散穗高粱；M：♂紅殼蘇丹草；n為群體大小；p為群體類型；箭頭表示親本氫氰酸含量值F:female parent scattered ear sorghum;M:male parent red hull sudangrass;n is the population size;p is population type. Arrows represent the hydrocyanic acid content values of each parent

2.4 QTL PA7-2在遺傳圖譜上標(biāo)記區(qū)間的確定

利用新設(shè)計(jì)的12對(duì)SSR特異性引物對(duì)130個(gè)F3QIRs株精細(xì)定位群體及其親本基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，共得到43個(gè)多態(tài)性SSR標(biāo)記，加上PA7-2區(qū)域的5個(gè)標(biāo)記構(gòu)建了含有48個(gè)連鎖標(biāo)記的遺傳連鎖圖譜，其全長(zhǎng)為230.7 cM，各標(biāo)記間平均距離為4.81 cM(圖4)。利用該連鎖圖譜對(duì)130個(gè)重組單株的氫氰酸含量測(cè)定值進(jìn)行QTL定位發(fā)現(xiàn)，QTLPA7-2位于標(biāo)記Sobic.8 g1-600和XM00242-400之間，其低氫氰酸含量性狀的遺傳貢獻(xiàn)率為48.2%(表5)，表明PA7-2在F3群體中未丟失，可在物理圖譜上進(jìn)行精細(xì)定位。

表5 F3精細(xì)定位群體氫氰酸含量性狀QTL定位Table 5 The QTL of hydrocyanic acid contents identified by QIRs population of F3 fine-mapping generation

圖4 QTL PA7-2的連鎖標(biāo)記圖譜及定位區(qū)間的確定Fig.4 Linkage map and QTL mapping results of fine mapping population in sorghum-sudangrass hybrid在連鎖群的左側(cè)顯示標(biāo)記位置，右側(cè)顯示標(biāo)記名稱。黑色矩形代表檢測(cè)到的QTL。The marker position was shown on the left side of the linkage group,and the marker name was shown on the right side. The black rectangle represents the QTL detected.

2.5 QTL PA7-2的精細(xì)定位

利用與QTLPA7-2緊密連鎖的7個(gè)SSR標(biāo)記建立了物理圖譜(圖5a)，并與氫氰酸含量性狀相關(guān)的對(duì)照組(低氰CK1、中氰CK2和高氰CK3的QIR株)進(jìn)行比較，把從F3代130個(gè)QIRs株中選出的30個(gè)QIRs單株劃分目標(biāo)區(qū)域，按低氫氰酸含量和高氫氰酸含量性狀的基因型分成12組(G1-G12，圖5b)。進(jìn)而用植株的平均氫氰酸含量數(shù)據(jù)與對(duì)照組比對(duì)確認(rèn)，在標(biāo)記Sobic.8 g1-600和XM00242-400之間為13個(gè)低氫氰酸含量重組株G1-G6。其中G1-G4共12個(gè)QIRs株的氫氰酸含量范圍為4.06～10.11 mg·kg-1，顯著小于隱性對(duì)照組CK1的氫氰酸含量，據(jù)此可將低氫氰酸含量PA7-2區(qū)域確定到Sobic.8 g1-600標(biāo)記的下游，該區(qū)域只含1個(gè)SSR標(biāo)記(SORBI4G3-600)，表明該標(biāo)記為低氫氰酸含量性狀緊密連鎖分子標(biāo)記。而G7-G12的QIRs株的氫氰酸含量顯著增高(107.51～478.57 mg·kg-1)，逐漸接近或超過CK3的氫氰酸含量，為高氫氰酸含量區(qū)段，位于標(biāo)記XM00242-400的下游。

圖5 QTL PA7-2精細(xì)定位Fig. 5 Fine-mapping of QTL PA7-2a：連鎖群上PA7-2區(qū)域的物理圖，相鄰標(biāo)記間重組株的數(shù)量在圖a下方顯示。b通過分析30個(gè)重組株的基因型和表型，將PA7-2基因座縮小為Sobic.8 g1-600和XM00242-400；通過分析13個(gè)低氫氰酸含量重組株的基因型和表型，將PA7-2基因座確定在Sobic.8 g1-600和XM00242-400標(biāo)記之間的3.77 Mb區(qū)域；灰色矩形CK1為紅殼蘇丹草低氫氰酸等位基因純合子，白色矩形CK2為雜合子，黑色矩形CK3為散穗高粱高氫氰酸等位基因純合子，白色點(diǎn)狀矩形為重組位點(diǎn)。在右邊的表格中，表示分組、各組重組株的數(shù)量和基因型類別。每個(gè)CK的平均值±SD(隨機(jī)選擇的20個(gè)F3植株)a:A high-resolution physical map of the PA7-2 region on chromosome;The number of recombinants between adjacent markers are indicated below the map. b The PA7-2 locus was narrowed down to Sobic.8 g1-600 and XM00242-400 by analyzing the genotypes and phenotypes of the 30 recombinants;The PA7-2 locus was delimited to a 3.77 Mb region between the Sobic.8 g1-600 and XM00242-400 markers by analyzing the genotypes and phenotypes of the 13 QIRs of low cyanide;Gray rectangles CK1 indicate the homozygotes with the low cyanide allele of ‘Red hull sudangrass’,white rectangles CK2 represent the heterozygotes,black rectangles CK3 indicate the homozygotes with the high cyanide allele of ‘Scattered ear sorghum’,and white dotted rectangles represent the site of recombination. In the table on the right,group genotype category,the number of recombinants in each group；Mean values ± SD (n = 20 randomly chosen plants) are shown for each CK

經(jīng)與高粱基因組比對(duì)，最終將低氫氰酸含量主效QTLPA7-2縮小在SSR標(biāo)記Sobic.8 g1-600和XM00242-400之間，這2個(gè)標(biāo)記正好處于高粱8號(hào)染色體區(qū)段的51.415 Mb～55.182 Mb(53 912 597-57 862 260 bp)之間，該區(qū)域?yàn)?.77 Mb。

3 討論

氫氰酸是一種有毒的化合物，在植物中以生氰糖苷的形式存在，家畜采食過量會(huì)引起中毒現(xiàn)象[5-6]，因此，培育低氰高丹草品種尤為必要。目前，對(duì)低氫氰酸含量性狀的研究甚少，本研究選在氫氰酸含量上有極顯著差異的親本進(jìn)行雜交、自交獲得F2代分離群體，結(jié)合表型與分子標(biāo)記基因型進(jìn)行重組株篩選，從中獲得低氰重組單株，為明確低氰性狀遺傳提供作圖材料。

QTL定位可將目標(biāo)性狀基因定位在遺傳圖譜上的相對(duì)位置，而精細(xì)定位是將目標(biāo)性狀基因精確到某一染色體上的實(shí)際物理位置，是對(duì)植物數(shù)量性狀目標(biāo)基因圖位克隆、候選基因挖掘及功能解析的主要途徑[27]。在作物上，有不少學(xué)者進(jìn)行了重要數(shù)量性狀的QTL精細(xì)定位研究，如代資舉等[28]利用近等基因系將玉米雄穗分枝數(shù)qTBN5精細(xì)定位至13.2 Mb的物理區(qū)間，金迪等[29]利用小麥F2群體將抑制芒長(zhǎng)的QTL B2精細(xì)定位至4.84 Mb(471.28～476.12 Mb)物理區(qū)間。本試驗(yàn)以高丹草F3代QIRs群體首次將高丹草低氫氰酸含量主效QTLPA7-2精細(xì)定位至3.77 Mb(51.415 Mb～55.182 Mb)物理區(qū)間，這說明精細(xì)定位群體的選擇對(duì)定位結(jié)果有一定影響，即不同的作物種類其定位群體類型可以不同。另外，本試驗(yàn)為了降低或消除遺傳背景對(duì)精細(xì)定位結(jié)果的影響，直接利用QTLPA7-2的SSR側(cè)翼標(biāo)記對(duì)高丹草F2和F3群體進(jìn)行篩選，選取了QTLPA7-2區(qū)段為雜合的單株構(gòu)成QIRs，而基因組的其余部分均與親本相同，可對(duì)復(fù)雜數(shù)量性狀進(jìn)行遺傳分析，屏蔽了非重組單株對(duì)PA7-2的影響。為了確保精細(xì)定位的準(zhǔn)確性，在F3精細(xì)定位群體中只選取了具有極端表型的單株進(jìn)行精細(xì)定位，如在紅殼蘇丹草雜合類型的單株中，僅挑選氫氰酸含量小于紅殼蘇丹草單株的植株(≤15 mg·kg-1)；在散穗高粱雜合類型的單株中，僅挑選氫氰酸含量高于散穗高粱的植株，不僅可以減小遺傳背景的影響，而且還具有省時(shí)、減少工作量的優(yōu)點(diǎn)。

用BSA混池法篩選與作物目標(biāo)性狀相關(guān)的分子標(biāo)記，能夠克服沒有創(chuàng)建近等基因系NILs(Near isogenic lines)的限制[30]，但該方法需要考慮建池單株數(shù)量和分子標(biāo)記的圖譜密度。研究表明，若兩個(gè)親本的遺傳背景較一致時(shí)，建池單株數(shù)至少需要有2株；若親本的遺傳背景差異較大，則需要增加單株數(shù)量；而且建池單株數(shù)量還與供試材料的基因組大小有關(guān)，若基因組太大(如小麥17 Gb)，建池的單株數(shù)不宜太多，否則因多態(tài)性過高會(huì)影響試驗(yàn)結(jié)果；此外，需根據(jù)所選分子標(biāo)記圖譜密度的大小來確定建池株數(shù)，密度高(標(biāo)記間密度<5 cM)可以減少株數(shù)，密度低(標(biāo)記間密度>10 cM)可增加株數(shù)，但一般不超過20株[31-32]。本試驗(yàn)所用親本材料散穗高粱和紅殼蘇丹草均為二倍體高粱屬的兩個(gè)不同種，遺傳背景具一定的相似性，現(xiàn)已查明高粱基因組為750 Mb，基因組相對(duì)較小[33]。據(jù)此，我們選用F3代高氰和低氰的QIRs群體各10個(gè)單株建立低氰DNA基因池和高氰DNA基因池，篩選出12對(duì)特異性SSR引物，對(duì)高丹草雜種F3代130個(gè)QIRs株的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到SSR多態(tài)性標(biāo)記48個(gè)，建立了密度較高的遺傳連鎖圖譜，并精細(xì)定位了主效QTLPA7-2，因此，BSA法是快速尋找與低氫氰酸含量性狀相關(guān)標(biāo)記的有效方法。

4 結(jié)論

以高丹草F2和F3群體QIRs為材料，利用BSA-SSR技術(shù)首次將低氫氰酸含量性狀主效QTLPA7-2精細(xì)定位至3.77 Mb的物理區(qū)間，并確定了與其緊密連鎖的SSR標(biāo)記SORBI4G3-600，為高丹草低氫氰酸含量性狀PA7-2候選基因挖掘及分子標(biāo)記輔助育種等研究奠定了基礎(chǔ)。