不同生育期臭氧熏蒸對水稻光合作用及生長的影響差異

付嬈，尚博，張國友，馮兆忠

（南京信息工程大學應用氣象學院，江蘇省農業(yè)氣象重點實驗室，南京 210044）

近地表臭氧（O3）是光化學煙霧的主要組成部分，由氮氧化物與一氧化碳（CO）、甲烷（CH4）和揮發(fā)性有機化合物（VOCs）等前體物經過一系列的光化學氧化生成的二次污染物[1?2]。隨著工業(yè)化和城市化的快速發(fā)展及人類活動的加劇，O3前體物排放的增加導致全球地表 O3濃度已經從 19 世紀末的 10 nmol·mol?1上升到超過40 nmol·mol?1[3]，并將持續(xù)增加。在夏季，全球近四分之一的國家和地區(qū)正面臨近地層O3濃度高于60 nmol·mol?1的威脅[4]，超過 O3對植物的危害閾值（40 nmol·mol?1）[5]。O3污染已成為我國嚴重的生態(tài)環(huán)境問題[6]，尤其是長三角地區(qū)[7?8]。據統計[9]，O3污染導致長江三角洲地區(qū)水稻年平均減產量為2.445×109t，占實際產量的9.1%，造成年經濟損失為10.27 億美元。可見，當前O3濃度已對我國水稻產量造成了嚴重損失。

地表O3是一種動態(tài)的、存在時間較短的空氣污染物，它直接通過氧化作用破壞細胞[10]，對敏感植物造成諸多不利影響[11]，有害于人類健康和植被生長。葉片是O3直接的危害器官，O3通過氣孔擴散進入葉片后會首先進入質外體空間，在質外液中溶解后與質外體的物質反應生成多種活性氧自由基（ROS），存在于質外體中的抗氧化物質作為第一道防線，將部分O3/ROS 解毒，而未與質外體反應的O3/ROS 則進入共質體內，啟動次級解毒響應機制[12]。然而，在長時間高濃度的O3熏蒸下，一旦ROS 的累積量超過植物自身的解毒防御閾值，便會引起細胞程序性死亡[13]，從而加速葉片衰老[14]、降低葉綠素含量，導致光合速率下降[15?16]，抗氧化系統被破壞[17?18]，造成葉片可見損傷[11]，最終導致作物產量下降[19?20]，礦質元素含量升高[21]，造成嚴重的經濟損失[22]?？梢?，研究O3污染對作物的影響對于農業(yè)環(huán)境保護和經濟發(fā)展具有重要意義。

目前已開展了大量關于O3對水稻葉片生長[14]、生理生化[15，18]、產量[20]以及營養(yǎng)元素利用[21]影響的研究。AINSWORTH 等[23]通過整合分析發(fā)現當O3濃度平均升高到 62 nmol·mol?1時，水稻的光合速率降低 28%，氣孔導度（Gs）降低23%，最終導致產量下降14%。然而這些研究都是在水稻的整個生育期進行O3熏蒸，對不同生育期O3熏蒸對水稻生長的影響差異的研究較少。PANG 等[24]利用江都開放式 O3熏蒸（O3?FACE）平臺，在整個生育期對兩個水稻品種（汕優(yōu)63和武育粳3號）進行1.5倍大氣O3濃度熏蒸試驗，結果表明，汕優(yōu)63 比武育粳3 號光合及產量更敏感，但是兩個水稻品種在應對不同生育期O3熏蒸時是否有差別仍然未知。水稻是世界三大主要糧食作物之一，其中90%以上的水稻生長和消費均發(fā)生在亞洲[25]?？紤]到作物不同生育期對O3的敏感性有所差異，因此探究不同生育期O3熏蒸對水稻的影響可為O3防護時段提供科學依據，從而在水稻生長的特定生育期采取精準的調控措施，最終為有效減緩O3污染對水稻造成的傷害提供理論依據?；诖耍狙芯坷瞄_頂式氣室（OTC）在水稻生長的不同生育期（分蘗拔節(jié)期和抽穗灌漿期）進行O3熏蒸試驗，探究兩個水稻品種（汕優(yōu)63 和武育粳3 號）在不同生育期暴露于相同的O3劑量下，植株生長及葉片光合特性的響應差異，為有效防治O3污染提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗區(qū)概況

試驗區(qū)位于江蘇省揚州市江都區(qū)南京信息工程大學揚州綠色農業(yè)研究與示范基地（119°43′E，32°25′N），屬亞熱帶季風氣候，該地2009—2018 年平均氣溫16.2 ℃，年平均降水量1 131.3 mm，年日照時間1 936.1 h，年無霜期>290 d，當地實行長期的稻麥輪作體系，是典型的農田生態(tài)系統。

1.2 試驗設計

本試驗在OTC 中進行，OTC 為高2.3 m、直徑4.8 m 的正八面柱體，頂部留有直徑約3 m 的開口。以潔凈的氧氣（O2）作為氣源，用O3發(fā)生器（HY003，濟南創(chuàng)成科技有限公司）產生O3，通過鼓風機（CX?125，上海全風實業(yè)有限公司）將混合空氣送入每個OTC 內，最終使OTC 內O3均勻分布。使用49i O3分析儀（美國Thermo Scientific 公司）對OTC 內中心位置O3濃度進行實時監(jiān)測與記錄，根據OTC 內O3濃度與設定目標O3濃度的差異，通過質量流量計控制供應的O2流量來控制氣室內O3的濃度。使用HOBO 氣象站（美國Onset Computers公司）每隔5 min監(jiān)測OTC內外溫度、濕度及光合有效輻射參數，每日熏蒸時間最長為10 h（8：00—18：00），遇到雨天則關閉儀器停止通氣。

本試驗選用的兩種供試水稻品種分別為雜交稻汕優(yōu)63和粳稻武育粳3號，均是當地普遍種植的水稻品種。2020 年 5 月 20 日進行育苗，7 月 2 日將長勢一致的幼苗插秧至底部直徑22 cm、高31 cm 的圓形花盆中，花盆中所用土為當地農田土壤。同時將每個品種的各10 盆水稻隨機放入氣室內，適應氣室內的生長環(huán)境。

試驗設置2 個O3處理：CF（過濾大氣，使用活性碳吸附空氣中的O3）和NF40（環(huán)境大氣+40 nmol·mol?1O3），每個 O3處理設置 3 個 OTC 重復（n=3）。本試驗共設置3 種處理：CF，即水稻始終位于CF 氣室中；O3?1，即水稻在分蘗拔節(jié)期位于NF40 氣室進行O3熏蒸，其他生育期在CF 氣室中（O3熏蒸自7 月25日開始，8 月 25 日結束，共計熏蒸 32 d）；O3?2，即水稻在抽穗灌漿期位于NF40 氣室進行O3熏蒸，其他生育期在 CF 氣室中（O3熏蒸自 8 月 26 日開始，9 月 18日結束，共計熏蒸 24 d）。其中，O3?1 和 O3?2 處理下的O3累計劑量AOT40 值（試驗期間小時O3濃度超過40 nmol·mol?1的累計值）分別為（9.54±0.41）μmol·mol?1·h 和（9.61±0.23）μmol·mol?1·h，兩個水稻品種在分蘗拔節(jié)期和抽穗灌漿期暴露于近似相等的AOT40 中。此外，CF 處理的 AOT40 值為 0.49 μmol·mol?1·h。所有的試驗都在相同的 OTC 內開展，試驗期間OTC 內外溫度分別為32.8 ℃和30.4 ℃，相對濕度分別為72.4%和74.0%，雖然OTC 內溫度比室外溫度高約2.4 ℃，但當前研究是比較不同O3處理的影響，不涉及室內外比較。

1.3 指標測定

1.3.1 株高和比葉重指標測定

株高：9 月19 日在每個OTC 內不同處理的水稻中各隨機選取2 盆植株，測量植株主莖基部到葉頂的長度。

比葉重（LMA）：9月21日隨機取下每個OTC中不同處理的兩片水稻旗葉葉片，使用HP LaserJet MFP M227?M231 打印機掃描葉片，利用 Image J 計算葉片表面面積，之后將葉片裝入信封中放進80 ℃烤箱烘干至恒質量，用萬分之一天平稱取其干質量，比葉重（g·m?2）=葉片干質量（g）/葉面積（m2）。

1.3.2 光合特性指標測定

采用 Li?6800 便攜式光合測定儀（美國 LI?COR公司）于 9 月19 日和20 日測定光合速率?CO2濃度響應曲線（A?Ci曲線），對不同CO2濃度對應的光合速率進行擬合，具體測定方法：晴天9：00—15：00 在每個OTC內每個品種每種處理隨機選取兩盆植株，在飽和光下誘導15~30 min 后，選擇受光照條件好的旗葉葉片進行測定，共測定36條A?Ci曲線。參數設置如下：每條曲線設置12 個 CO2濃度，分別為400、300、200、100、60、400、600、800、1 000、1 200、1 400、1 600μmol·mol?1，光合有效輻射設置為 1 500 μmol·m?2·s?1，葉室溫度控制在（32±2）℃，空氣相對濕度為50%±5%。隨后從每條曲線的數據中挑選出第一個CO2濃度為400 μmol·mol?1時的葉片的氣體交換參數和葉綠素a 熒光參數作為光飽和下的光合作用特征數據。其中氣體交換參數包括飽和光合速率（Asat）、Gs 和胞間 CO2濃度（Ci），葉綠素 a 熒光參數包括：PSⅡ反應中心激發(fā)能捕獲效率（F′v/F′m）、光化學淬滅系數（qP）、PSⅡ實際光化學量子效率（PhiPS2）。根據SHARKEY 等[26]的方法擬合確定最大羧化速率（Vcmax）和最大電子傳遞速率（Jmax），并將Vcmax和Jmax的值校準到25 ℃。氣孔限制值（Ls）=1?胞間CO2濃度（μmol·mol?1）/大氣 CO2濃度（μmol·mol?1）。

1.3.3 光合色素指標測定

光合色素的測定：9月21日選取完成測定光合速率的葉片，用打孔器取直徑為0.7 cm的圓形葉片放入2 mL 95%的乙醇中浸泡，并放入4 ℃冰箱中黑暗保存，直至完全褪色。將提取液分別于664、649 nm 與470 nm 處測定吸光度，根據LICHTENTHALER[27]的方法得到葉綠素a（Chl a）、葉綠素b（Chl b）、葉綠素總量（Chl a+b）和類胡蘿卜素（Car）的含量。

1.3.4 葉片氮含量指標測定

將已烘干至固定質量的葉片放在球磨儀中進行研磨，使用元素分析儀（Flashsmart CN，意大利）測定單位質量的葉片氮含量（Nmass），單位面積的葉片氮含量（Narea，g·m?2）=單位質量葉片氮含量（mg·g?1）×比葉重（g·m?2）×10?3。

1.4 數據處理

試驗數據先用Excel 2010進行初步整理，經SPSS 23.0 檢驗數據的正態(tài)性與方差齊性后，運用JMP 10.0進行不同品種和處理間的雙因素方差分析，采用Tukey?Kramer HSD進行檢驗，分析不同處理間的差異顯著性。運用Sigmaplot 14.0做圖，柱形圖中的數據為平均值±標準差（SD），統計結果（P值）附圖中。

2 結果與分析

2.1 不同生育期臭氧熏蒸對水稻株高和比葉重的影響

不同時期O3熏蒸導致兩種水稻的株高顯著降低（P<0.01）。綜合所有處理，汕優(yōu)63 的平均株高比武育粳3 號高36.5%且達到顯著性差異（P<0.01）。與CF 相比，O3?1和O3?2處理導致汕優(yōu)63的株高分別下降7.5%和6.9%，武育粳3 號的株高分別下降4.5%和3.3%，其中汕優(yōu)63的降幅達到顯著水平（圖1）。兩種供試水稻的LMA值在不同處理間無顯著性差異，株高和LMA值均未出現處理和品種間的顯著交互作用。

2.2 不同生育期臭氧熏蒸對水稻葉片光合特性參數的影響

不同生育期O3熏蒸導致兩種供試水稻的Asat和Gs 變化達到顯著水平（P<0.01）。相對于CF 處理，汕優(yōu) 63 在 O3?2 處理下的Asat和 Gs 分別顯著下降 44.3%和 55.2%，兩個水稻品種的Asat和 Gs 值均為 O3?1 處理大于O3?2處理。而不同時期O3熏蒸對兩種供試水稻的Ci值無顯著影響（圖2）。

在不同生育期進行O3熏蒸顯著降低了兩種供試水稻的F′v/F′m 與PhiPS2 值（P<0.01），qP 變化不顯著。相對于 CF 處理，汕優(yōu) 63 和武育粳 3 號在 O3?2 處理下的F′v/F′m 值分別顯著下降10.9%和11.0%，武育粳 3 號 O3?2 處理下的 PhiPS2 值比 CF 處理顯著低25.8%（圖3）。

由圖4 可見，不同生育期O3熏蒸處理下，兩種供試水稻的Vcmax和Jmax的降幅均達到顯著水平（P<0.01和P<0.05）。其中，汕優(yōu) 63 和武育粳 3 號在 O3?2 處理下的Vcmax值比CF 處理分別低48.2%和38.2%，O3?2處理下的汕優(yōu)63的Jmax值較CF 處理低51.8%，差異達到顯著水平。Ls 與Ci 變化趨勢相反。兩種水稻的Vcmax/Jmax值均表現為 O3?1>O3?2。不同品種及處理與品種的交互作用對光合特性的影響均未達到統計學顯著。

2.3 不同生育期臭氧熏蒸對水稻葉片光合色素含量的影響

不同時期O3熏蒸處理下兩種水稻的Chl a、Chl b和Chl a+b 的變化一致，雖未達到顯著水平，但O3?2處理降幅大于O3?1 處理，兩個水稻品種的Chl b 含量差異達到顯著水平（P<0.01）。對于Car，汕優(yōu)63 表現為 O3?1 處理大于 O3?2 處理，而武育粳 3 號則相反。不同O3處理和處理與品種的交互作用均未達到顯著水平（圖5）。

2.4 不同生育期臭氧熏蒸對水稻葉片氮含量的影響

不同生育期O3熏蒸處理下水稻的Narea的變化達到顯著水平（P<0.05），同時兩個水稻品種的Narea差異顯著（P<0.05），Nmass變化不顯著，兩種水稻品種的Nmass和Narea含量均表現為O3?1>CF>O3?2，但未出現顯著的O3處理與品種交互作用（圖6）。

3 討論

光合作用是綠色植物積累有機物的最重要方式，并最終決定植物生物量。葉綠素熒光是光合作用光反應的重要指標，也是了解逆境下生長的植物光化學和非光化學現象的重要工具[28]。本研究發(fā)現，與CF相比，汕優(yōu) 63 的Asat值和武育粳 3 號的 PhiPS2 值在O3?2處理下顯著降低，同時兩個水稻品種的F′v/F′m的平均值也顯著降低，這表明O3對兩個水稻品種不同生育期光合作用的影響存在差異，在抽穗灌漿期影響更大。已有的研究表明，O3能加劇葉綠體膜系統的膜脂過氧化作用，使水稻的膜系統遭到損害，進一步導致葉綠素降解，葉綠素含量下降，最終使得葉片加速衰老。葉綠素是植物進行光合作用的主要色素，通常被認為是影響光合作用的重要因素之一[29]。與光合參數一致，不同生育期O3熏蒸導致葉綠素含量下降，O3?2處理降幅大于O3?1處理，表明水稻抽穗灌漿期對O3響應更大。這與前人對其他作物的研究結論一致，即O3對作物的灌漿期影響較大[30]。PLEIJEL等[31]在春小麥的不同生育期進行相同劑量的O3熏蒸試驗，發(fā)現在開花期至成熟期進行O3熏蒸引起的產量損失達到11%，而開花期前熏蒸產量損失僅為2%，證實O3對小麥開花期至成熟期影響更大。此外，在對豆類[32]作物的研究中也有相似結論，開花后O3暴露對豆莢產量的影響比開花前更大。

在田間試驗中，Asat往往受到氣孔和非氣孔兩個因素共同限制，有研究表明O3引起的Asat降低主要原因是非氣孔因素[33]。葉片內Rubisco 的活性Vcmax以及RuBP 再生的最大速率Jmax都能夠反映限制植物光合的非氣孔因素[34]。FENG 等[35]和 LI 等[36]對小麥和木本植物進行了整合分析，結果表明，平均O3濃度為73 nmol·mol?1時小麥Vcmax降低 18%，平均 O3濃度為 71 nmol·mol?1時 我國木本植物Vcmax和Jmax分別降低 了19%和20%。FENG 等[17]利用FACE 平臺探究O3對5個不同冬小麥品種光合作用影響的差異，結果表明O3對不同小麥品種影響的差異主要歸因于非氣孔因素（如抗氧化酶）而不是Gs。在本研究中，O3對兩個水稻品種的影響也更多是由非氣孔因素限制。相對于 CF，O3?2 處理導致汕優(yōu) 63 的 Gs 和Jmax的降幅均達到顯著水平，兩種水稻品種在O3?2 處理下的Vcmax平均值較CF 處理顯著降低43.2%，Ls 變化不顯著。光合、熒光及Vcmax和Jmax參數表明O3對水稻抽穗灌漿期影響更大。

LMA 是衡量植物對O3敏感性的重要指標，已有大量研究表明O3能顯著降低木本植物葉片的LMA[37]，LMA 值越大，植物對 O3敏感性越低[38]。在本文研究中，不同時期O3熏蒸導致兩個水稻品種的LMA 降低，但降幅未達到顯著，這與PENG 等[39]對玉米的研究結果一致，可能與O3熏蒸時間較短或水稻抗性較強有關。兩個水稻品種在O3?1處理下的LMA更高，這表明分蘗拔節(jié)期處理下的水稻O3敏感性更低，抗性更高。葉片氮主要存在于蛋白質、核酸和葉綠體中，對植物光合作用起關鍵作用，其濃度與光合速率、電子傳遞速率、羧化速率及葉片抗氧化能力密切相關。已有的研究表明O3濃度升高不僅增加Nmass、降低Narea，還改變了氮在葉片不同功能上的分配[40]。而在本研究中，O3?1 處理下的Nmass和Narea值相對 CF處理有所增加，而O3?2 處理下則相對減少，這說明在抽穗灌漿期進行O3熏蒸會使葉片的抗氧化能力減弱，抗氧化系統對ROS 的解毒和修復功能減弱，導致ROS累積，使植物的光合作用和生理代謝機能受到限制。LMA 與葉片氮含量的變化證實O3對兩個水稻品種生長在抽穗灌漿期影響更大。

已有的研究表明[24]，O3導致汕優(yōu) 63 比武育粳 3 號的Asat和葉綠素含量下降時間更早、幅度更大，結合產量數據，認為在整個生育期進行O3熏蒸時，汕優(yōu)63比武育粳3號更敏感。本研究發(fā)現，不同生育期O3熏蒸導致兩個水稻品種的光合與生長指標降幅接近，表明在不同生育期進行O3熏蒸，兩個水稻品種對O3的敏感性是相似的。此外，兩個水稻品種僅在株高、Chl b和Narea值方面存在顯著差異，而其他光合指標品種間無顯著差異，并且水稻的生長及光合參數均未表現出顯著的品種與O3處理的交互作用，表明本試驗中汕優(yōu)63 與武育粳3 號在應對不同生育期O3熏蒸時的響應相似。

本試驗結果表明不同生育期O3熏蒸對兩個水稻品種的光合作用及生長的影響存在顯著性差異，水稻抽穗灌漿期對O3響應更強，但兩個水稻品種應對不同生育期O3熏蒸時的響應是相似的。本試驗在OTC內進行，與外界自然環(huán)境存在一定差距，而且盆栽試驗易受到在氣室中所處位置的影響及根系限制。因此，可進一步在大田試驗中利用O3?FACE 平臺，在水稻生長的不同生育期開展O3熏蒸試驗，驗證本試驗結論，為水稻生長的不同生育期對O3脅迫敏感度提供可靠依據。本試驗結果有利于更加準確且有針對性地采取防治措施，如采取水肥一體化管理措施或外源噴施O3防護劑等，對水稻生長的關鍵生育期進行精準的防護，從而有效減緩O3造成的水稻減產。

4 結論

（1）O3對兩個水稻品種的不同生育期影響不同，對抽穗灌漿期光合作用及生長的影響更大。

（2）雜交稻汕優(yōu)63 和粳稻武育粳3 號對O3的響應相似。