miR-22-3p/5p抑制小鼠成肌細(xì)胞增殖的功能研究

蓋 凱，叢百林，陳 鵬，齊曉龍，邢 凱，王相國，肖龍菲，

倪和民，郭 勇，楊佐君*，盛熙暉*

(北京農(nóng)學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京102206)

在骨骼肌生長發(fā)育過程中，肌肉前體細(xì)胞通過分裂增殖和細(xì)胞分化，成肌細(xì)胞的遷移、相互黏附與融合產(chǎn)生多核肌纖維，最后通過進(jìn)一步分化形成骨骼肌。microRNAs(miRNAs)，一類非編碼核糖核酸，已被發(fā)現(xiàn)在動(dòng)物骨骼肌發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，例如miR-378a、miR199a和miR-206等[1-3]。mmu-miR-22定位于小鼠11號(hào)染色體，其前體可以產(chǎn)生2個(gè)成熟miRNA，即分別從前體的5’和3’端加工而來的miR-22-5p和miR-22-3p。研究表明，miR-22-5p/3p是很多癌癥的診斷標(biāo)記物,分別與急性心肌梗塞[4]、乳頭狀甲狀腺癌[5]、短暫性腦缺血[6]、卵巢癌[7]、肝癌[8]、膀胱癌[9]和非小細(xì)胞肺癌[10]等相關(guān)，但在骨骼肌發(fā)育過程中二者發(fā)揮的生物學(xué)功能尚不明確，具體的作用機(jī)制和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)尚未徹底闡明。為了研究mmu-miR-22-3p/5p在骨骼肌細(xì)胞生長發(fā)育過程中的作用，選擇可以在低血清誘導(dǎo)條件下分化為多核肌管的小鼠成肌細(xì)胞(C2C12)作為細(xì)胞模型，通過轉(zhuǎn)染mmu-miR-22-3p/5p的模擬物，應(yīng)用CCK-8法與流式細(xì)胞術(shù)兩種方法研究mmu-miR-22-3p/5p在小鼠成肌細(xì)胞在增殖過程中的作用，探究miR-22-3p/5p的生物學(xué)功能，目的是闡明miRNAs調(diào)控家畜骨骼肌生長發(fā)育的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及主要試劑

C2C12細(xì)胞購自于國家試驗(yàn)室細(xì)胞資源共享平臺(tái)。mmu-miR-NC、mmu-miR-22-3p/5p模擬物由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體Lipofectamine 2000和細(xì)胞裂解液Trizol均采購于美國Invitrogen公司。OPti-MEMI低血清培養(yǎng)基購自美國Gibco公司。細(xì)胞增殖-毒性檢測試劑盒 Cell Counting Kit-8(CCK-8)購自北京索萊寶科技有限公司。實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑購自北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 C2C12細(xì)胞培養(yǎng)、總RNA提取和實(shí)時(shí)熒光定量PCR C2C12細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液中，置于溫度37 ℃、含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在細(xì)胞增殖的第2、3、4 天收集細(xì)胞，加入800 μL Trizol，樣品裂解后加氯仿，分層后提取細(xì)胞總RNA，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。加入1 μL buffer 電泳檢測RNA完整性，利用紫外分光光度計(jì)測定純度和濃度，當(dāng)A260/A280比值為1.9～2.1時(shí)說明RNA的濃度和純度合格。利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測mmu-miR-22-3p/5p在C2C12細(xì)胞增殖的過程中表達(dá)的情況增殖的過程中表達(dá)的情況，以U6作為內(nèi)參基因，引物序列為：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′和5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；mmu-miR-22-3p 的引物序列為5′-AAGCTGCCAGTTGAAGAACTGT-3′和5′-TGCAGGTCAACTGGTGTCGT-3′；mmu-miR-22-5p的引物序列為5′-AGTTCTTCAGTGGCAAGCTTTA-3′和5′-TGCAGGTCAACTGGTGTCGT-3′。退火溫度為60 ℃，所有反應(yīng)均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔和3次技術(shù)重復(fù)，采用2 -△△Ct法計(jì)算相對表達(dá)量。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將處在對數(shù)生長期的C2C12細(xì)胞接種至6 孔的細(xì)胞培養(yǎng)板中，密度為1×105個(gè)/孔。轉(zhuǎn)染前1 d，將培養(yǎng)基更換為不含血清的高糖DMEM，使轉(zhuǎn)染時(shí)的細(xì)胞密度達(dá)65% ～ 70%。24 h后，按照lipofectamine 2000說明書對細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。首先用OPti-MEMI分別稀釋mmu-miR-NC、mmu-miR-22-3p/5p模擬物和lipofectamine 2000，混勻后離心。將二者充分混勻后制為50 nm的轉(zhuǎn)染劑，室溫靜置。將培養(yǎng)基換為含10 %血清的高糖DMEM，逐滴緩慢加入轉(zhuǎn)染試劑，將其置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h。

1.2.3 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖 將含有10 %FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基加入96 孔板中，用轉(zhuǎn)染mmu-miR-NC或者mmu-miR-22-3p/5p模擬物后的C2C12細(xì)胞鋪板，細(xì)胞密度為1×103個(gè)/孔。每隔24 h將待測孔培養(yǎng)基更換為不含有血清的高糖DMEM并加入CCK-8試劑(10∶1)，培養(yǎng)基與試劑充分混勻后，將板放入37 ℃、5 % CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h。2 h后取出96孔板并使用錫紙避光，使用多功能酶標(biāo)儀450 nm檢測待測時(shí)間(24、48、72、96 h)的OD值，得到結(jié)果后繪制曲線圖。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期 將C2C12細(xì)胞轉(zhuǎn)移至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入含有10 %FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染mmu-miR-NC或者mmu-miR-22-3p/5p模擬物(1×105個(gè)/孔)。轉(zhuǎn)染30 h后收集細(xì)胞，加入1 mL預(yù)冷PBS溶液洗滌兩次后離心4 min(1 000 r/min)，棄其上清液；加入1 mL預(yù)冷的75 %乙醇，于4℃下固定4 h以上，離心5 min(1 000 r/min)后棄上清液。再用3 mL預(yù)冷PBS洗滌2次后加入0.5 mL的PL溶液染色，混勻后使用流式細(xì)胞儀480 nm激光對紅光通道熒光信號(hào)進(jìn)行檢測，細(xì)胞周期百分比利用MODifitLT軟件進(jìn)行分析。

使用SPASS 25.0的單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 C2C12細(xì)胞增殖過程mmu-miR-22-3p/5p的表達(dá)情況

利用qRT-PCR方法檢驗(yàn)mmu-miR-22-3p和mmu-miR-22-5p在增殖期C2C12細(xì)胞中的表達(dá)情況。結(jié)果表明，mmu-miR-22-3p和mmu-miR-22-5p均有表達(dá)，其中mmu-miR-22-3p在C2C12細(xì)胞中第3天表達(dá)量降低，但差異不顯著；第4天表達(dá)量顯著升高(P<0.05)(圖1-A)。mmu-miR-22-5p在C2C12細(xì)胞中表達(dá)逐步升高，在不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量差異均顯著(P<0.05)(圖1-B)。

2.2 利用CCK-8法檢測mmu-miR-22-3p/5p對C2C12細(xì)胞增殖的影響

將轉(zhuǎn)染mmu-miR-22-3p/5p模擬物和mmu-miR-NC的C2C12細(xì)胞鋪板于96孔板中，分別在24、48、72、96 h應(yīng)用多功能酶標(biāo)儀檢測450 nm波長下的OD值。結(jié)果如圖2所示，轉(zhuǎn)染mmu-miR-22-3p模擬物組的OD值在24、48、72、96 h時(shí)均極顯著低于mmu-miR-NC對照組(P<0.01)(圖2-A)；轉(zhuǎn)染mmu-miR-22-5p模擬物組的OD值在24 h顯著低于mmu-miR-NC對照組(P<0.05)，72 h極顯著低于mmu-miR-NC對照組(P<0.01)(圖2-B)，即轉(zhuǎn)染mmu-miR-22-3p和mmu-miR-22-5p對C2C12細(xì)胞的增殖過程具有不同程度的抑制作用。

2.3 利用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期

轉(zhuǎn)染mmu-miR-22-3p/5p模擬物和mmu-miR-NC 30 h后，收集C2C12細(xì)胞。用75 %乙醇固定、PL染色液染色后在4 ℃避光孵育30 min，使用流式細(xì)胞儀480 nm檢測細(xì)胞周期。結(jié)果如圖3所示，轉(zhuǎn)染mmu-miR-22-3p模擬物組中處于G0G1期的細(xì)胞數(shù)極顯著高于對照組(P<0.01)；處于G2M期和S期的C2C12細(xì)胞數(shù)低于對照組，與對照組相比差異極顯著(P<0.01)(圖3A)。轉(zhuǎn)染mmu-miR-22-5p模擬物組中處于G0G1期和G2M期的細(xì)胞數(shù)顯著高于對照組(P<0.05)；處于S期的C2C12細(xì)胞數(shù)量低于對照組，但差異不顯著(圖3-B)。結(jié)果表明，在C2C12細(xì)胞中過表達(dá)的mmu-miR-22-3p和mmu-miR-22-5p均使細(xì)胞在增殖過程中于S期受到阻滯，與對照組相比增殖能力降低。

3 討 論

動(dòng)物骨骼肌在維持其機(jī)體正常功能中發(fā)揮著重要作用，更與畜禽動(dòng)物的產(chǎn)肉性能和生產(chǎn)效率息息相關(guān)，因此挖掘畜禽動(dòng)物骨骼肌生長發(fā)育的調(diào)控基因、解析其遺傳機(jī)制意義重大。骨骼肌細(xì)胞的發(fā)育過程復(fù)雜，包括體節(jié)細(xì)胞和成肌細(xì)胞的增殖、分化、遷移等環(huán)節(jié)，最終使得肌管成熟形成不同類型的肌纖維，其中涉及到眾多遺傳因子的網(wǎng)絡(luò)式調(diào)控以及基因表達(dá)。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了調(diào)控骨骼肌細(xì)胞發(fā)育的若干主效基因，例如轉(zhuǎn)化生長因子β超家族(TGF-β)促進(jìn)TGFBR的表達(dá)從而調(diào)控骨骼肌細(xì)胞的增殖及分化[11]；肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2家族(MEF2)可調(diào)控成肌細(xì)胞分化的高低[12]；生肌調(diào)節(jié)因子家族(MRFs)控制重要的肌肉特異性蛋白質(zhì)(如肌球蛋白重鏈和肌肉肌酸激酶)的轉(zhuǎn)錄[13]等，但有關(guān)骨骼肌生長發(fā)育的分子機(jī)制尚未被完全闡明。miRNAs作為遺傳通路里的微調(diào)基因或控制開關(guān)，已有眾多研究結(jié)果表明miRNAs能夠?qū)趋兰〉脑鲋撑c分化等過程進(jìn)行調(diào)控。例如miR-1、miR-206和miR-133等被稱為肌肉特異性miRNA，可以在骨骼肌和心肌組織中特異表達(dá)。其中，miR-1[14]與miR-206[15]均可促進(jìn)組蛋白去乙?；?(HDAC4)的靶基因表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控肌肉分化；miR-133通過調(diào)控MAML1和IGF-1R等靶基因的表達(dá)在成肌細(xì)胞的增殖過程發(fā)揮作用[16-17]。miRNAs除了能夠調(diào)節(jié)骨骼肌細(xì)胞的增殖之外，研究發(fā)現(xiàn)還可以通過調(diào)控靶基因表達(dá)促使骨骼肌細(xì)胞的凋亡等過程。例如miR-16可以靶向抑制因子Foxo1和基因Bcl2的轉(zhuǎn)錄，調(diào)控骨骼肌細(xì)胞的凋亡[18]。雖然miRNA在骨骼肌細(xì)胞的研究成果顯著，但是調(diào)控骨骼肌生長發(fā)育的miRNA網(wǎng)絡(luò)仍然有待完善。

大量研究表明，miR-22-3p可在不同的癌癥以及其他疾病中發(fā)揮生物學(xué)功能。在患有卵巢早衰的患者中，miR-22-3p的表達(dá)水平顯著低于對照組[19]；miR-22-3p可通過下調(diào)亞甲基四氫葉酸還原酶基因(MTHFR)的表達(dá)，在葉酸缺乏引起的肝癌細(xì)胞中發(fā)揮作用[20]；miR-22-3p及其靶基因eIF4E結(jié)合蛋白基因(eIF4EBP3)之間的相互作用可用于靶點(diǎn)改善臨床子宮頸癌的治療[21]；miR-22-3p通過靶向調(diào)節(jié)細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子3 (Socs3)的表達(dá)抑制妊娠期糖尿病小鼠肝臟胰島素抵抗的發(fā)生[22]。另有研究發(fā)現(xiàn)miR-22-3p，可通過靶向結(jié)合刺激蛋白1基因(SP1)來抑制其下游G1/S-特異性周期蛋白-D1基因(CCND1)和B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2基因(BCL2)基因的表達(dá)，抑制肝癌細(xì)胞(HCC)增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[23]；miR-22-3p通過調(diào)控Onecut 1(OC1)/血管內(nèi)皮生長因子A (VEGFA)信號(hào)通路抑制內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖和遷移[24]。本次研究結(jié)果表明，miR-22-3p可抑制小鼠成肌細(xì)胞增殖，提示miR-22-3p可在多種細(xì)胞類型中抑制細(xì)胞增殖過程，為今后miR-22-3p的生物學(xué)功能研究提供了理論參考。

miR-22-5p被認(rèn)為是心血管疾病和癌癥的候選生物標(biāo)志物。研究發(fā)現(xiàn)，在急性心肌梗死患者的血漿中，miR-22-5p的表達(dá)發(fā)生了顯著變化，被認(rèn)為是急性心肌梗死的潛在生物標(biāo)志物[25-27]；miR-22-5p上調(diào)可抑制棒狀體相關(guān)蛋白1癌基因家族成員/細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(RAP1/ERK)信號(hào)通路，從而保護(hù)心肌[28]。本研究結(jié)果表明，miR-22-5p可在成肌細(xì)胞增殖的過程中起到負(fù)調(diào)節(jié)作用，該結(jié)果對于miR-22-5p的生物學(xué)功能研究是一個(gè)重要的補(bǔ)充，同時(shí)為骨骼肌生長發(fā)育的miRNA調(diào)控機(jī)制提供了新的見解。但是，miR-22-3p/5p抑制成肌細(xì)胞增殖的具體調(diào)控機(jī)制尚不明確，需要通過更全面的體外或體內(nèi)試驗(yàn)進(jìn)一步研究。

本研究結(jié)果表明，mmu-miR-22-3p和mmu-miR-22-5p可不同程度的抑制小鼠成肌細(xì)胞的增殖，豐富了miR-22的生物學(xué)功能認(rèn)知，為今后動(dòng)物肌肉發(fā)育的分子育種研究提供了理論基礎(chǔ)。