非洲豬瘟病毒UBCv1的原核表達(dá)及多抗制備

蔣思文，房立春，馮澤新，焦 鵬，王玥超，梁 艷，史東宇，陳 青*

(1.北京農(nóng)學(xué)院 生物與資源環(huán)境學(xué)院/ 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北都市農(nóng)業(yè)重點實驗室，北京102206；2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，濟南250100)

非洲豬瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)是屬于非洲豬瘟病毒科(Asfarviridae)非洲豬瘟病毒屬(Asfarviridae)的大型包膜病毒，也是唯一已知的蟲媒DNA病毒，主要在胞質(zhì)中完成復(fù)制和組裝[1,2]。ASFV病毒粒子具有雙層囊膜結(jié)構(gòu)，呈二十面體形態(tài)，平均直徑200 nm，不同分離株的雙鏈DNA長度范圍在170 ～ 193 kbp之間[3, 4]，編碼150～200種蛋白質(zhì)，其中包括負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)病毒和宿主細(xì)胞功能的相關(guān)蛋白[5, 6]。

ASFV的I215L基因編碼一個與泛素結(jié)合酶(ubiquitin conjugating enzyme, UBC，E2)高度同源的基因序列，且在大腸桿菌中表達(dá)時具有UBC活性。它在純化的泛素激活酶(E1)和ATP存在下與泛素分子形成硫醚鍵，隨后將泛素轉(zhuǎn)移到特定的蛋白質(zhì)底物上[7]。這是迄今為止報道的唯一一個由病毒基因編碼的具有功能活性UBC酶，故將ASFV的I215L基因產(chǎn)物稱為泛素結(jié)合酶(UBCv1)[7-9]。重組UBCv1在體外可以自泛素化，也可以泛素化組蛋白以及ASFV病毒粒子核殼多蛋白pp62[10]。最新研究發(fā)現(xiàn)了病毒UBCv1與宿主發(fā)生互作的蛋白，Barrado推測UBCv1通過影響mTORC信號通路、調(diào)節(jié)宿主翻譯機制及ASFV生命周期中細(xì)胞蛋白的表達(dá)發(fā)揮作用，但具體機制仍不清楚[9]。本文作者將ASFV的I215L基因克隆至原核表達(dá)載體中構(gòu)建UBCv1重組質(zhì)粒，低溫誘導(dǎo)表達(dá)、親和標(biāo)簽純化該蛋白，并在此基礎(chǔ)上制備多克隆抗體，為非洲豬瘟病毒UBCv1蛋白生物學(xué)功能的深入研究提供材料，并為ASFV致病機理研究提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

pET-28a載體、p3XFLAG-CMV-7.1-I215L載體由北京畜牧獸醫(yī)研究所獸醫(yī)公共衛(wèi)生創(chuàng)新與管理團隊提供；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞和BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞均購自TIANGEN公司；6～8周齡的BALB/c小鼠購自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司，動物實驗均通過北京農(nóng)學(xué)院實驗動物福利與倫理審查(BUA2021028)。BamH I、HindIII限制性內(nèi)切酶、DNA Ligation Kit、2×PrimeSTAR? Max DNA Polymerase均購于TaKaRa生物公司；IPTG、His-tag抗體(小鼠單抗)和辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)、BeyoGoldTMHis-tag Purification Resin、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、SDS-PAGE Gel Kit和超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司；TIANgel Midi Purification Kit、DAB顯色試劑盒購自TIANGEN公司。

1.2 I215L基因的擴增與重組質(zhì)粒的構(gòu)建

以p3XFLAG-CMV-7.1-I215L質(zhì)粒為模板(其中I215L基因根據(jù)ASFV Georgia 2007/1株I215L序列(Gene ID:FR682468.1)合成)，以序列5′CGCGGATCCATGGTTTCCAGGTTTTTAATAG 3′(下劃線處為BamH I 酶切位點)和序列5′CCCAAGCTTTTACTCATCATCCTCCTCCTCTTC 3′(下劃線處為HindIII酶切位點)為引物進行PCR擴增。反應(yīng)結(jié)束后用1%瓊脂糖凝膠對PCR產(chǎn)物進行電泳，將含有I215L片段的膠塊，用試劑盒回收，回收產(chǎn)物用BamH I和HindIII雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)純化回收；pET-28a做同樣處理后，將二者連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化于E.coliDH5α，用含卡那霉素平板過夜培養(yǎng)進行篩選，挑取單菌落擴增培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，PCR及雙酶切鑒定后由公司測序，驗證序列的正確性。

1.3 誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白

用構(gòu)建好的pET-28a-I215L質(zhì)粒和pET-28a對照分別轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)，用含卡那霉素的平板過夜培養(yǎng)進行篩選，挑取單菌落于液體LB振蕩培養(yǎng)后，再以1∶100的體積比將活化的菌液擴大培養(yǎng)，將600 nm光下吸光度為0.6～0.8的菌液，加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，16 ℃條件下分別誘導(dǎo)10 h、21 h、24 h，離心收集菌體，PBS重懸菌體后超聲破碎至澄清，分別收集全菌液、沉淀、上清進行SDS-PAGE電泳，對其表達(dá)情況與可溶性進行分析。

16 ℃下IPTG誘導(dǎo)24 h的重組菌和陰性對照菌破碎上清液進行SDS-PAGE凝膠電泳后，轉(zhuǎn)印至PVDF膜，封閉液4 ℃封閉過夜，加入抗His標(biāo)簽的小鼠單抗(1∶1 000)稀釋液作為一抗，4 ℃孵育2 h；洗滌后，用HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(1∶1 000)稀釋液作為二抗，4 ℃孵育2 h；洗滌后，加DAB底物進行顯色，對重組蛋白進行Western blot鑒定。

1.4 表達(dá)蛋白的純化與鑒定

大量表達(dá)蛋白質(zhì)后，參照BeyoGoldTMHis-tag Purification Resin試劑盒說明書純化蛋白，離心收集菌體，用無菌的PBS洗滌2遍后，用裂解液重懸菌體，加入溶菌酶至終質(zhì)量濃度1 mg/mL，冰上放置30 min，超聲破碎后離心收集上清液，將上清加入預(yù)先處理好的Ni-NTA填料于4 ℃結(jié)合2 h，用1倍柱體積含5 mmol/L咪唑的洗滌液洗滌雜蛋白，洗柱5次，再用含有300 mmol/L的咪唑的Tris緩沖溶液(pH = 8.0)洗脫，收集洗脫液。純化后的蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)印至PVDF膜，封閉液4 ℃封閉過夜，加入抗His標(biāo)簽的小鼠單抗(1∶1 000)稀釋液為一抗，HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG(1∶1 000)稀釋液為二抗，對純化重組蛋白進行Western blot分析。

1.5 多克隆抗體的制備

將50 μg純化重組蛋白與等體積的弗氏完全佐劑混勻后，在BALB/c小鼠背部皮下多點注射進行首免，同時對照組接種等量體積的PBS。首免后14 d、28 d和42 d，分別將50 μg純化重組蛋白與等體積的弗氏不完全佐劑混勻后進行加強免疫。四免后7 d小鼠眼眶取血，收集血清。

1.6 多克隆抗體效價的測定

采用方陣滴定法，將純化的UBCv1稀釋為質(zhì)量濃度3 μg/mL包被酶標(biāo)板，每孔加入100 μL，4 ℃包被過夜；洗滌液洗滌后以含1% BSA的封閉液37 ℃封閉2 h；再用洗滌液洗滌。將不同稀釋度的多抗(1∶90 000、1∶270 000、1∶810 000、1∶2 430 000、1∶7 290 000、1∶21 870 000、1∶65 610 000)和陰性血清稀釋液作為一抗，每孔加入100 μL，37 ℃保溫1 h；洗滌液洗滌。二抗為稀釋的HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(1∶5 000)，每孔加入100 μL，37 ℃保溫1 h；洗滌液洗滌。每孔加入100 μL TMB顯色液，37 ℃避光反應(yīng)15 min后加入100 μL終止液(2 mol/L硫酸)終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀測定450 nm處吸光值，記錄并分析。

1.7 多克隆抗體的Western Blot鑒定

將純化的重組蛋白和陰性對照在同一凝膠上進行SDS-PAGE電泳后，采用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，經(jīng)過洗滌、封閉后，采用本文制備的多克隆抗體稀釋液(1∶1 000)作為一抗，37 ℃孵育1 h；洗滌后，用HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(1∶1 000)稀釋液作為二抗，37 ℃孵育2 h；洗滌后，加DAB底物進行顯色，拍照記錄并分析結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

對重組質(zhì)粒pET-28a-I215L進行PCR鑒定，得到639 bp的條帶(圖1)，與預(yù)期片段大小一致；經(jīng)HindIII和BamH I雙酶切，得到兩條條帶，大小約為5 500 bp和650 bp，條帶大小分別與載體5 369 bp及目的基因639 bp大小一致(圖1)。對陽性質(zhì)粒進行測序，測得序列經(jīng)BLAST分析，與ASFV Georgia 2007/1參考毒株的I215L序列一致。

2.2 UBCv1的誘導(dǎo)表達(dá)及可溶性分析

SDS-PAGE結(jié)果表明，IPTG終濃度1 mmol/L時，16 ℃誘導(dǎo)0 h、10 h、21 h、24 h后，在預(yù)測的28 kDa位置，出現(xiàn)一條逐漸加深的條帶，與預(yù)期大小相符(圖2)，并經(jīng)Western blot驗證，28 kDa位置處出現(xiàn)特異性條帶(圖2)，表明UBCv1獲得了正確表達(dá)。通過菌體裂解液上清、沉淀條帶結(jié)果可知，UBCv1以可溶性表達(dá)為主(圖2)。

2.3 UBCv1的純化及鑒定

利用帶His標(biāo)簽的填料來純化重組UBCv1，純化后進行SDS-PAGE、Western blot鑒定，由圖3可知，純化后出現(xiàn)特異的條帶，約28 kDa，與預(yù)期目的條帶大小一致。

2.4 重組蛋白多克隆抗體效價的檢測

以純化的UBCv1為包被抗原，倍比稀釋后包被酶標(biāo)板，采用間接ELISA 法測定UBCv1的鼠源多克隆抗體效價。以陽性孔OD值(P)與陰性孔OD值(N)的比值大于2.1的最高稀釋度為多抗效價。結(jié)果表明，純化后的多抗效價為1∶7 290 000。以制備的多克隆抗體作為一抗，進行Western blot檢測，28 kDa處出現(xiàn)明顯條帶(圖4)，說明多克隆抗體能夠特異性識別ASFV的UBCv1。

3 討 論

非洲豬瘟(ASF)是由非洲豬瘟病毒(ASFV)所致的一種烈性病毒性的豬傳染病，它主要具有高急性、高熱、高毒和高病死率等臨床癥狀和傳染特點，目前已經(jīng)擴散到非洲、亞洲和歐洲的許多國家和地區(qū)[11]。盡管近些年來，對ASFV的致病機制、入侵機制、病原與宿主互作和免疫逃逸機制等方面的研究有了很大的進展，但仍存在許多未知領(lǐng)域亟待深入研究。

泛素化是一種蛋白質(zhì)翻譯后修飾，可以介導(dǎo)蛋白質(zhì)通過泛素-蛋白酶體途徑進行選擇性降解，進而廣泛地調(diào)控細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞周期調(diào)控等過程[12, 13]。泛素結(jié)合酶(E2)又稱為泛素載體蛋白，可將激活的泛素分子從泛素活化酶(E1)轉(zhuǎn)移至E2。與E2結(jié)合的泛素分子進一步被轉(zhuǎn)移至泛素連接酶(E3)所識別的特異底物蛋白質(zhì)上[14]。在病毒感染過程中，很多病毒利用泛素化修飾啟動免疫逃逸，如皰疹病毒、痘病毒等大型DNA病毒可借助其編碼的E3泛素連接酶或去泛素化酶逃避宿主的先天免疫系統(tǒng)，促進病毒的復(fù)制傳播[15, 16]。

UBCv1是ASFV一種非常早期的病毒蛋白，其表達(dá)不依賴于病毒DNA復(fù)制，感染早期定位于細(xì)胞核之中，感染晚期在細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)中均有表達(dá)，這表明UBCv1隨著ASFV感染進程可以在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)之間動態(tài)穿梭[9]。UBCv1在ASFV感染中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，通過劫持細(xì)胞泛素-蛋白酶體系統(tǒng)，調(diào)節(jié)宿主蛋白及其自身蛋白的功能和亞細(xì)胞定位。ASFV很可能利用UBCv1干擾泛素機制，從而調(diào)節(jié)多種病毒機制(如轉(zhuǎn)錄、復(fù)制和衣殼化)和細(xì)胞功能(如抗病毒應(yīng)答、DNA損傷應(yīng)答、凋亡)[17]。

UBCv1是目前已知的唯一病毒泛素結(jié)合酶(E2)，因此該蛋白科學(xué)價值很高[10]。早期，有人報道了UBCv1影響細(xì)胞核蛋白SMCy的活性，但意義未知[18]；最近又有人報道了UBCv1與宿主細(xì)胞的40S核糖體蛋白RPS23，翻譯起始因子eIF4和細(xì)胞連接酶Culin 4B有相互作用，推測UBCv1會影響mTORC信號通路、宿主翻譯機制等細(xì)胞過程，但具體機制仍不清楚[9]。

本文作者利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)非洲豬瘟病毒泛素結(jié)合酶(UBCv1)，針對ASFV的I215L基因，采用了含有His標(biāo)簽的pET-28a原核生物表達(dá)載體，構(gòu)建了UBCv1的重組質(zhì)粒，低溫誘導(dǎo)BL21(DE3)表達(dá)UBCv1的重組蛋白，可溶性表達(dá)，經(jīng)過His標(biāo)簽純化柱純化后，免疫小鼠制備多克隆抗體，ELISA檢測多抗效價，效價較高，可為非洲豬瘟病毒UBCv1蛋白生物學(xué)功能及病毒相關(guān)致病機制的深入研究提供重要的生物材料。