血mmp-13和Toll樣受體2在單核細胞中的表達預測 宮內(nèi)感染的價值

王蕾，曾鳳梅，張麗珠，李小永，柳玉紅

(深圳市寶安區(qū)人民醫(yī)院產(chǎn)科，廣東 深圳 518101)

0 引言

胎膜早破(PROM)是妊娠常見的并發(fā)癥，發(fā)生率超過20%。感染是胎膜早破的主要原因[1]。絨毛膜羊膜炎是早產(chǎn)的常見原因，可能導致不良的新生兒結(jié)局，包括神經(jīng)發(fā)育后遺癥[2]。絨毛膜羊膜炎已被標記為以感染或炎癥或兩者兼有為特征的多種疾病，其次是母親及其新生兒的臨床實踐[3]。早產(chǎn)在臨床中顯示是圍產(chǎn)期增加死亡人數(shù)及長期發(fā)病率的主要原因。最近一項對871例妊娠的前瞻性研究發(fā)現(xiàn)，患有組織學絨毛膜羊膜炎的人，早產(chǎn)的發(fā)生率幾乎是沒有絨毛膜羊膜炎的人的兩倍[4]。本文檢測了胎膜早破產(chǎn)婦胎膜中的MMP-13及TLR2在單核細胞中的表達，同時探究其在宮內(nèi)感染中預測的價值，進而提高患者生活質(zhì)量。為早期診斷宮內(nèi)感染患者診斷提供可靠、全面的醫(yī)學依據(jù)，同時也有利于臨床上的規(guī)范診療，具有巨大的經(jīng)濟和社會效益?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

將2020年6月至2021年3月期間在我院進行住院的胎膜早破產(chǎn)婦40例及足月無早破初產(chǎn)婦30例，根據(jù)病理檢查有無絨毛膜羊膜炎將產(chǎn)婦分為感染組,28例及非感染組12例。其中感染組別產(chǎn)婦28例，年齡23～36歲，平均年齡為(28.9±2.5)歲，孕周為(35.2±0.9)周，非感染組別產(chǎn)婦12例，年齡22～36歲，平均年齡為(28.1±2.2)歲，孕周為(37.8±1.4)周，對照組為正常產(chǎn)婦30例，年齡23～37歲,年齡(27.8±2.2)歲，孕周為(39.4±1.1)周，兩組一般資料比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。

納入標準：符合以下標準的人被納入本次研究中，有明確的妊娠年齡，單胎，28-36個孕周，和(或)存在早期羊膜囊破裂，生殖和泌尿道感染。入選的產(chǎn)婦均無高血壓、心臟病、糖尿病、肝炎、腫瘤等病史。本研究經(jīng)我院倫理委員會批準?；颊呒捌浼覍僦橥獠⒑炇鹜鈺Ｔ\療過程嚴格遵循倫理原則，確保患者隱私和安全。將患者分為感染組和非感染組。對照組：孕齡，單胎，無子宮收縮，37周內(nèi)無分娩。

排除標準：病理性妊娠，例子妊娠期高血壓病癥、妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積病癥、前置胎盤、胎盤早剝、糖尿病、甲亢等內(nèi)外科疾病。

1.2 診斷標準

臨床診斷絨毛膜羊膜炎：母體發(fā)熱、母體及/或胎兒心動過速、母體白細胞增多、子宮壓痛、惡臭或膿性羊水。高倍鏡下中性粒細胞浸潤>5例，實驗室指標：白細胞計數(shù)>15×109/L，中性粒細胞百分比>0.80，胎盤培養(yǎng)陽性，胎膜炎性表現(xiàn)病理檢查，如有以上兩種情況，診斷為感染。

1.2 方法

禁食8h以上后，早晨采集靜脈血3mL和edta 抗凝1mL。收集單核細胞，檢測 toll 樣受體2的表達。其余送實驗室測定CRP。胎盤娩出后，嚴格無菌操作，取出大于4cm 的胎膜大小約為2cm×2cm×1cm。經(jīng)過濃度為10%的甲醛穩(wěn)定，將胎膜送病理檢查。(1)TLR2的檢測① 采集2份50μL EDTA抗凝的外周血標本，浸入5mL流動管底；② 加入5μL人CD14/PE抗體進行單核細胞校準，2.5μL人TLR4/FITC抗體與全血混合檢測TLR2表達；③ 另一管用5μL CD14/PE抗體進行單核細胞校準。將5μL IgG2a/FITC抗體的同源對照品加入流式細胞儀底部，與全血混合。細胞在室溫黑暗中培養(yǎng)20分鐘；④ 在兩個試管中分別加入250μL optilyse C?；旌虾?，試管避光10分鐘，以溶解紅細胞，直到液體變透明；⑤ 將LML-PBS洗滌液加入兩管后，輕輕混合，然后將樣品管放入離心機中，以1500rpm分離5分鐘，然后丟棄上清液；⑥ 向細胞沉淀中加入2mL PBS洗液，然后在1500rpm下丟棄上清液5min；⑦ 加入500μL PBS洗液后，輕輕混合，用上流式細胞儀檢測；⑧ 結(jié)果：TLR2蛋白在單核細胞表面有表達。⑨ 實驗結(jié)束后采用SPSS 25.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。(2)血清MMP-13水平檢測：采用雙抗體夾心ABC酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)和thermo multiskan MK3自動酶標儀檢測血清MMP-13水平，嚴格按照試劑盒說明書操作。采集兩個觀察者的切片在顯微鏡下觀察，根據(jù)黃色反映的陽性強度及面積來判斷結(jié)果，若陽性細胞的陽性強度分為無著色、淡黃色、棕黃色和棕褐色，則分別對應(yīng)計分為0、1、2、3分，最后應(yīng)用免疫組織化學積分計算總和。

1.3 觀察指標及診斷標準

胎膜早破合并感染組、胎膜早破無感染組和對照組母外周靜脈血中TLR2水平及mmp-13比較.

1.4 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 25.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料用(±s)表示，組間比較采用t檢驗，組內(nèi)比較采用配對t檢驗；計數(shù)資料以率(%)表示，比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 每組孕婦血清及羊水MMP-13水平比較

結(jié)果顯示感染組母體血清及羊水的MMP-13表達水平均顯著高于非感染組，組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。具體數(shù)據(jù)詳見表1。

表1 感染者及非感染者的MMP-13水平對比情況(±s，ng/L)

表1 感染者及非感染者的MMP-13水平對比情況(±s，ng/L)

組別 例數(shù) MMP-13血清 羊水感染組 28 382±105 95±28非感染組 12 153±80 68±25 t 6.744 2.881 P 0.000 0.007

2.2 三組產(chǎn)婦靜脈血收集的單核細胞表面TLR2蛋白水平的對比

結(jié)果顯示胎膜早破合并感染組外周血TLR2細胞顯著高于胎膜早破非感染組及正常對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而無絨毛膜羊膜炎者TLR2細胞與正常對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 三組產(chǎn)婦靜脈血收集的單核細胞表面TLR2 蛋白水平的對比(±s，%)

表2 三組產(chǎn)婦靜脈血收集的單核細胞表面TLR2 蛋白水平的對比(±s，%)

組別 例數(shù) TLR2感染組 28 12.2±4.52非感染組 12 1.98±0.25對照組 30 2.12±0.26 t 5.362 P 0.001

3 討論

基質(zhì)金屬蛋白酶是一類鋅依賴蛋白水解酶，負責切割多種ECM蛋白。它們主要分為膠原酶(MMP-1，-8，-13和-18)，明膠酶(MMP-2和-9)，膜型MMP(MMP-14，-15，-16，-17，-24和-25)和 其 他(MMP-7，-12，-19，-20，-23，-26和-28)。MMP是具有高度保守的信號肽，前肽域和催化域的多域蛋白[5]。除MMP-7，-23和-26外，所有MMP還包含富含脯氨酸的鉸鏈區(qū)和C端血紅素樣結(jié)構(gòu)域。由于MMP-13在OA中起著至關(guān)重要的作用，它已成為研究人員關(guān)注的熱點。如果能夠檢測或合成能夠阻斷MMP-13轉(zhuǎn)錄調(diào)控途徑中特定步驟，抑制其合成或與MMP-13結(jié)合以抑制其生長的物種，則或許能夠治療OA它的活動[6]。這種物質(zhì)稱為MMP-13抑制劑。結(jié)果顯示感染組母體血清及羊水的MMP-13表達水平均顯著高非感染組，MMP-13在感染細組中的表達顯著高于宮體部，研究表明胎膜宮頸部的結(jié)構(gòu)較為復雜且宮體部薄弱，可推測出MMP-13在胎膜宮頸部的高度表達影響了產(chǎn)婦部分膠原降解速度，使其速度加快，進而破壞底膜，加速了細胞凋亡，韌性降低最終導致宮頸部胎膜破裂，MMP-13的表達水平與孕周之間呈負相關(guān)，說明表達水平越高，胎膜破裂時間越早，感染率越高。MMP-13可調(diào)控細胞外基質(zhì)含量和胎膜結(jié)構(gòu),引起胎膜結(jié)構(gòu)弱化,從而導致胎膜早破[7-8]。MMP-9在孕中期含量甚微,但在破膜、分娩及宮內(nèi)感染的羊水中明顯升高。

Toll樣受體2(Toll-like receptor 2，TLR2)作為脂多糖的跨膜信號受體，啟動革蘭氏陰性菌的天然免疫應(yīng)答，是天然免疫和獲得性免疫之間的重要橋梁[9]。TLRs在急性炎癥、細胞信號轉(zhuǎn)導和細胞凋亡中起重要作用[10]。大多數(shù)研究集中在TLR-2和TLR-4上。本文比較了感染組和非感染組別的TLR-2mrna水平，結(jié)果表明，TLR-2mrna在感染組別早期顯著升高，提示機體激活了TLR信號轉(zhuǎn)導通路，產(chǎn)生炎癥介質(zhì)，胎膜早破宮內(nèi)感染早期誘導抗感染防御機制及免疫應(yīng)答的研究。巨噬細胞作為TLR2蛋白的信號轉(zhuǎn)導子，在免疫細胞的促炎癥反應(yīng)中起重要作用，主要作用于革蘭氏陰性菌。其意義體現(xiàn)在胎膜早破后導致新生兒出現(xiàn)宮內(nèi)感染早期機體已經(jīng)通過激活TLR信號傳導途徑，出現(xiàn)了炎癥介質(zhì)，誘導抗感染防御機制及免疫應(yīng)答反應(yīng)。早期羊膜囊破裂可以增加宮內(nèi)感染的速度和范圍。機體對感染產(chǎn)生免疫反應(yīng)，使單核巨噬細胞聚集，并在病原菌的作用下誘導TLR2的表達，起到抗感染的作用。

綜上所述，血MMP-13及TLR2在單核細胞中的表達與胎膜早破發(fā)生之間有著密切關(guān)聯(lián),均顯示高表達，可為后續(xù)臨床預測提供支持。作為感染標記物在預測宮內(nèi)感染時有重要意義，在臨床中增加了一項可靠指標。