基于實(shí)時熒光PCR技術(shù)的羊乳摻偽檢測分析

尹丹韓,肖舒珺,杜黎丹,方陳玉,肖海龍

(1.杭州市食品藥品檢驗(yàn)研究院,杭州 310022;2.浙江科技學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院,杭州 310023)

羊乳富含200多種營養(yǎng)素和生物活性物質(zhì),是世界公認(rèn)最接近人乳的乳品,其營養(yǎng)成分全面,且易于被人體吸收[1-3]。在古代,中醫(yī)對羊乳有很高的評價,據(jù)《本草綱目》記載,羊乳性甘溫,能補(bǔ)寒冷虛乏、潤心肺、治消瘦、療虛勞、益精氣、和小腸氣、利大腸、醫(yī)小兒驚厥[4];在現(xiàn)代,許多研究也證明羊乳具有極高的營養(yǎng)價值,在國際營養(yǎng)學(xué)界被譽(yù)為“乳中之王”,因此越來越多的消費(fèi)者傾向于選擇羊乳制品來代替牛乳。羊乳的成分比例與人乳接近,羊乳中最主要的蛋白質(zhì)酪蛋白顆粒及脂肪球比牛乳小,更利于人體吸收。由于羊乳的消費(fèi)量不斷上漲,但其產(chǎn)量相對較少,并隨季節(jié)波動較大,導(dǎo)致市場上供不應(yīng)求,價格遠(yuǎn)高于牛乳。為了謀求暴利,一些廠家在羊乳制品中摻入牛乳對外銷售,而羊乳消費(fèi)的主力軍是嬰兒和老人或是一些牛乳過敏者,若食用了摻假羊乳,會對消費(fèi)者造成經(jīng)濟(jì)與身體健康的雙重?fù)p害。目前中國關(guān)于乳與乳制品的研究主要在安全性指標(biāo)、標(biāo)簽、膳食營養(yǎng)方面[5-7],乳與乳制品中成分摻假的檢測技術(shù)很少涉及。因此,找到一種能較準(zhǔn)確地檢測羊乳中牛源性成分摻假情況的分析方法十分重要。目前應(yīng)用于乳品摻假的檢驗(yàn)方法主要有色譜法[8-9]、毛細(xì)管電泳法[10]、分子生物技術(shù)[11]、酶聯(lián)免疫[12]和近紅外光譜法[13-14]等,其中實(shí)時熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time fluorescent polymerase chain reaction,實(shí)時熒光PCR),因其低耗時、強(qiáng)特異性、高靈敏度及高通量的優(yōu)勢,廣泛應(yīng)用于乳制品摻假摻雜檢測中[15-16]。近年來陸續(xù)出現(xiàn)利用實(shí)時熒光PCR技術(shù)定量檢測動植物源性成分的研究[17-18],但研究對象主要集中于肉制品,對乳制品很少涉及。同時,仍存在一些有待研究的問題,如復(fù)雜樣品的DNA提取、混合樣品的檢出限和定量曲線的適用性等。本研究在牛源性成分檢測方法的基礎(chǔ)上,針對乳制品特殊性探索樣品前處理方法,構(gòu)建羊乳制品中牛源性成分檢測體系,并對檢測體系的定量檢測潛力進(jìn)行初步探索;同時收集70批次市售羊乳制品,對羊乳進(jìn)行牛源性成分鑒定,欲為鑒別羊乳真假提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 樣品采集

目前市場上銷售的羊乳制品主要以液態(tài)羊乳和羊乳粉為主,因此我們此次收集的樣品為這兩類產(chǎn)品。共收集市售羊乳樣品70批次,其中42批次為羊乳粉,28批次為液態(tài)羊乳。所有樣品包裝完整,有食品標(biāo)簽。樣品收集后,固態(tài)乳粉和常溫液態(tài)乳置于干燥常溫環(huán)境中保存,鮮乳置于0～5 ℃冰箱冷藏保存。鮮羊乳及鮮牛乳均購于本地乳品企業(yè)。

1.1.2 試 劑

血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒,北京天根生化科技有限公司;2倍濃度熒光PCR預(yù)混液,生工生物工程(上海)股份有限公司;引物,生工生物工程(上海)股份有限公司;磷酸鹽緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline,PBS),生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ViiA7實(shí)時熒光定量PCR儀,美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司;X-30R超速冷凍離心機(jī),美國貝克曼庫爾特公司;MK-10干式恒溫器,杭州奧盛儀器有限公司;超微量紫外分光光度計(jì),賽默飛世爾科技。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 DNA提取及濃度檢測

液態(tài)乳提取步驟如下:取10 mL液態(tài)乳制品樣品,4 ℃條件下5 000×g離心10 min后,棄上清及上層脂肪層,將離心產(chǎn)物中加入1 mL PBS后渦旋數(shù)秒混勻;4 ℃條件下13 000×g離心5 min,棄上清及上層脂肪層,留下沉淀,后續(xù)步驟按照血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行DNA提取,并對提取的DNA進(jìn)行質(zhì)量濃度和純度的檢測。

固態(tài)乳提取步驟如下:直接取樣品2 g至離心管,加入10 mL PBS后渦旋數(shù)秒混勻;4 ℃條件下5 000×g離心10 min后,棄上清及上層脂肪層,將離心產(chǎn)物中加入1 mL PBS后渦旋數(shù)秒混勻;4 ℃條件下13 000×g離心5 min,棄上清及上層脂肪層,留下沉淀,后續(xù)步驟按照血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行DNA提取,并對提取的DNA進(jìn)行質(zhì)量濃度和純度的檢測。

1.3.2 實(shí)時熒光PCR反應(yīng)體系

測定用引物和探針序列見表1。本試驗(yàn)所用引物和探針均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 引物和探針序列Table 1 Primer and probe sequences

反應(yīng)體系(25 μL)如下:2倍濃度熒光PCR預(yù)混液12.5 μL、上下引物各1 μL(10 μmol/L)、探針1 μL(10 μmol/L)、樣品DNA 1 μL、無菌雙蒸水8.5 μL,同時做陰性和陽性對照反應(yīng)體系,即分別用1 μL無菌雙蒸水和1 μL陽性DNA代替1 μL樣品DNA。

牛源性成分反應(yīng)條件如下:95 ℃預(yù)變性10 s;95 ℃變性5 s,60 ℃退火延伸30 s,40個循環(huán)每循環(huán)退火時收集熒光信號。

1.3.3 方法驗(yàn)證

用特異性引物及探針分別對牛乳、羊乳及其他植物蛋白飲料(豆、核桃、花生)的DNA及水(空白對照)進(jìn)行擴(kuò)增,以檢測方法的特異性。反應(yīng)循環(huán)閾值(cycle threshold,CT值)小于35的判定為檢出牛源性成分。DNA提取并定量后,用無菌雙蒸水將目標(biāo)DNA進(jìn)行梯度稀釋,共7個梯度,即每個反應(yīng)添加1 μL稀釋度分別為100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的DNA模板。以不同質(zhì)量濃度的DNA為模板進(jìn)行實(shí)時熒光PCR反應(yīng),確定本方法對單一模板的檢出限。每個質(zhì)量濃度重復(fù)檢測3次,通過標(biāo)準(zhǔn)差(standard deviation,SD)和相對標(biāo)準(zhǔn)差(relative standard deviation,RSD)來確定本方法的可重復(fù)性。使用已測得僅含羊源性成分的純羊乳,僅含牛源性成分的純牛乳,按照體積比例,分別配比出牛乳體積分?jǐn)?shù)為100%、80%、50%、10%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%、0.005%的混合樣品。分別提取混合樣品的DNA,對其進(jìn)行實(shí)時熒光PCR擴(kuò)增,確定本方法對混合模板中牛源性成分的檢出限,重復(fù)3次。

1.3.4 市售羊乳樣品牛、羊源性成分檢測

測定樣品DNA質(zhì)量濃度,用特異性引物及探針擴(kuò)增檢測樣品中牛源性成分,同時設(shè)空白對照(用無菌雙蒸餾水代替模板)、陰性對照(羊乳DNA)、陽性對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA質(zhì)量濃度及純度測定

乳制品主要包含蛋白質(zhì)、脂肪、糖類等物質(zhì),DNA含量相對較少,且主要物質(zhì)會嚴(yán)重干擾DNA提取和后續(xù)PCR效率。因此在探索檢測方法時,首先需要考慮優(yōu)化羊乳制品DNA提取方法,以提高樣本代表性同時減少其他物質(zhì)的污染。研究過程中我們在通用的柱式過濾提取法的基礎(chǔ)上,增加了羊乳制品DNA提取的前處理過程,通過多次低溫離心的方式富集DNA,同時去除脂肪,減少脂肪等雜質(zhì)對后續(xù)提取步驟的干擾,優(yōu)化了羊乳制品的DNA提取過程,大幅增加DNA的提取效率和純度。經(jīng)過紫外分光光度計(jì)測定,樣品DNA質(zhì)量濃度在10.6～121.5 ng/μL,260 nm與280 nm的吸光度比值(OD260/280)在1.4～1.9之間,DNA中存在少量的蛋白質(zhì)污染,基本上能滿足實(shí)時熒光PCR檢測的要求。通過檢測發(fā)現(xiàn)從液體和固體樣本獲得的DNA在含量和純度上無明顯差別,這可能是由于乳制品在加工的過程中溫度不高,有效DNA降解少,因此在后續(xù)試驗(yàn)中可采用一種類型樣本(液態(tài))DNA進(jìn)行方法驗(yàn)證。在肉類及植物蛋白成分鑒定的研究中,有不少研究者對樣品質(zhì)量與相應(yīng)物種DNA含量的比值進(jìn)行了研究,獲得了兩者間的顯著線性關(guān)系[17-18],但還未在乳制品成分鑒定中開展類似研究,因此本研究對羊乳制品質(zhì)量與DNA含量的線性關(guān)系進(jìn)行的初步摸索是有意義的。本研究發(fā)現(xiàn)從相同蛋白含量的羊乳樣品提取獲得的DNA量存在一定差異,相同蛋白質(zhì)含量與對應(yīng)DNA含量之間無顯著的線性關(guān)系。這可能是由于樣品基質(zhì)復(fù)雜或DNA分布不均勻?qū)е碌摹?/p>

2.2 特異性試驗(yàn)結(jié)果

用引物和探針對羊乳、牛乳、植物蛋白飲料(大豆源、花生源、核桃源)的DNA進(jìn)行牛源性成分實(shí)時熒光PCR擴(kuò)增試驗(yàn)。7個樣品的牛源性成分?jǐn)U增曲線如圖1所示。3個牛乳樣品(1個牛乳粉、2個液態(tài)牛乳)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線,CT值分別為17.693、20.754、18.857,羊乳、豆源植物蛋白飲料、花生源植物蛋白飲料、核桃源植物蛋白飲料4個樣品DNA均未出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線。以上結(jié)果表明,本研究用于成分檢測的引物和探針具有特異性,適用于羊乳中牛源性成分的鑒定。

1—牛乳粉;2—液態(tài)牛乳1;3—液態(tài)牛乳2;4—陽性對照;5—液態(tài)羊乳;6—大豆植物蛋白飲料;7—花生植物蛋白飲料;8—核桃植物蛋白飲料;9—無菌雙蒸水。圖1 7個樣品的牛源性成分?jǐn)U增曲線Fig.1 Amplification curves of bovine derived materials in 7 samples

2.3 方法的檢出限

單一模板的檢出限試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。當(dāng)牛乳的DNA質(zhì)量濃度稀釋至0.001 ng/μL時,實(shí)時熒光PCR檢測結(jié)果均有擴(kuò)增曲線,CT值分別為32.167±0.019,小于35;而當(dāng)樣本DNA質(zhì)量濃度達(dá)到0.000 1 ng/μL時,CT值均大于35。這說明本方法單一成分檢出限可達(dá)0.001 ng?；旌夏０宓臋z出限試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。對體積分?jǐn)?shù)分別為100%、80%、50%、10%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%、0.005%的牛乳樣品DNA進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增試驗(yàn)。如圖3所示,當(dāng)牛乳體積分?jǐn)?shù)達(dá)到0.005%仍有擴(kuò)增曲線,CT值為33.508±0.018,小于35,這說明在復(fù)雜成分的樣本中使用本方法檢出限可達(dá)0.005%(相當(dāng)于0.001 ng/μL),復(fù)雜成分中牛源性成分的檢出限與單一成分檢出限基本上一致?？梢?在混合樣本中檢測羊源性成分不對牛源性成分的檢測產(chǎn)生干擾。

1—稀釋度100;2—稀釋度10-1;3—稀釋度10-2;4—陽性對照;5—稀釋度10-3;6—稀釋度10-4;7—稀釋度10-5;8—稀釋度10-6;9—陰性對照;10—無菌雙蒸水。圖2 單一模板的檢出限試驗(yàn)結(jié)果Fig.2 Detection limit test results of single template

1—體積分?jǐn)?shù)100%;2—體積分?jǐn)?shù)80%;3—體積分?jǐn)?shù)50%;4—體積分?jǐn)?shù)10%;5—體積分?jǐn)?shù)1%;6—體積分?jǐn)?shù)0.5%;7—陽性對照;8—體積分?jǐn)?shù)0.1%;9—體積分?jǐn)?shù)0.05%;10—體積分?jǐn)?shù)0.01%;11—體積分?jǐn)?shù)0.005%;12—陰性對照;13—無菌雙蒸水。圖3 混合模板的檢出限試驗(yàn)結(jié)果Fig.3 Detection limit test results of mixed templates

2.4 DNA含量與CT值之間的定量曲線

方法重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果見表2,牛源性DNA的擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖4所示,x為物種DNA質(zhì)量濃度的對數(shù),y為對應(yīng)平均CT值。表2顯示各平行試驗(yàn)的相對標(biāo)準(zhǔn)差均小于5%,這表明本方法的可重復(fù)性滿足要求。利用圖4中的線性關(guān)系,通過檢測乳品中牛源性的CT值可計(jì)算樣品中牛源性DNA模板質(zhì)量濃度。這表明檢測方法中的引物和探針不僅可以對乳制品的牛源性進(jìn)行定性檢測,而且可定量檢測樣品中牛羊源性DNA質(zhì)量濃度,有一定的定量檢測能力。

表2 方法重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of repeated test

圖4 牛源性DNA的擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Amplification standard curve of bovine derived DNA

2.5 市售羊乳樣品牛源性成分檢測結(jié)果

利用建立的實(shí)時熒光PCR方法對70批次市售羊乳樣品的牛源性成分進(jìn)行檢測分析,取2次平均值進(jìn)行計(jì)算。由于實(shí)時熒光PCR的靈敏度較高,容易出現(xiàn)假陽性,因此根據(jù)2.3節(jié)中檢出限的結(jié)果,將CT值大于32小于35的樣品歸為可疑樣品,進(jìn)行重新取樣檢測。若第二次CT值小于32判定為檢出;若第二次仍大于32則判定未檢出。在70批次市售羊乳樣品中,30批次檢出牛源性成分,檢出率為42.86%。檢出牛源性成分的30批次樣品中,有9批次配料表中標(biāo)明加入了脫鹽牛源乳清粉,總的問題樣品率為30%。具體如下:在28批次液態(tài)羊乳樣品中,有9批次檢出了牛源性成分,問題樣品率為32.14%;在20批次嬰兒配方羊乳粉中,有9批次檢出了牛源性成分,但這9批次配料表已標(biāo)明含牛源性成分,問題樣品率為0;在22批次成人羊乳粉中,有12批次檢出牛源性成分,問題樣品率為54.54%。從樣品類型看,羊乳粉的檢出率要高于液體羊乳,但一般嬰兒配方羊乳粉生產(chǎn)企業(yè)相對比較規(guī)范,會在配料表中將添加的成分標(biāo)識清楚,3種類型產(chǎn)品中成人羊乳粉的問題樣品率最高。檢出牛源性成分的30批次樣品牛源性成分對應(yīng)的CT值在20～31之間(DNA質(zhì)量濃度0.002～3 ng/μL),由此可見,即使檢測發(fā)現(xiàn)羊乳樣品中牛源性DNA質(zhì)量濃度較低時,也不能排除人為摻入的可能性。從對市售羊乳制品進(jìn)行風(fēng)險調(diào)查的總體結(jié)果中可以看出,市場上的確存在羊乳制品尤其是羊乳粉中添加牛源成分的風(fēng)險,添加的成分可能為乳清粉等牛源蛋白類物質(zhì),在不同類型的產(chǎn)品中,成人羊乳粉的摻偽摻雜風(fēng)險最高。

3 結(jié) 語

通過檢測體系引物探針特異性、靈敏度及模擬混摻樣品的檢出限等試驗(yàn),我們確定牛源性成分的檢測限為0.001 ng/μL,羊乳中摻入牛乳的檢測限可達(dá)到0.005 %(0.001 ng/μL),這說明建立的檢測體系具有檢測速度快、準(zhǔn)確性高、特異性好、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。經(jīng)市售乳制品檢測驗(yàn)證了其可行性和適用性,可快速有效地甄別羊乳制品中摻假摻雜牛源性成分,實(shí)現(xiàn)基因水平的定量分析。由于缺乏合適的質(zhì)量和DNA質(zhì)量濃度定量模型,本研究還無法實(shí)現(xiàn)質(zhì)量水平的定量分析,因此我們將在后續(xù)的研究中探索可以實(shí)現(xiàn)羊乳制品摻假成分的定量分析技術(shù),從而為制定相關(guān)產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)。