三黃洗劑改善特應(yīng)性皮炎小鼠模型皮膚屏障的機制探討

陳文穎 ，劉冬梅 ，王坤 ，蘭燕琴 ，解凡 ，沈珍 ，羅宏賓 ，應(yīng)華忠

（1.金華市第五醫(yī)院，浙江 金華 321000，2.浙江省中醫(yī)院，浙江 杭州 310002，3.浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心，浙江 杭州 310013）

特應(yīng)性皮炎（Atopic dermatitis，AD）又稱特應(yīng)性濕疹，是一種常見慢性、易復(fù)發(fā)性的炎癥性皮膚病。多好發(fā)于嬰幼兒時期，部分遷延至兒童和成人。據(jù)統(tǒng)計，全世界本病兒童中患病率可高達15%～20%，而成人患病率約1%～3%[1]。近年來，我國的AD患病率呈逐年上升的趨勢。其不僅給患者生活質(zhì)量帶來不良影響，而且造成了嚴重的社會經(jīng)濟負擔(dān)。皮膚屏障功能的減弱或破壞是AD的主要發(fā)病機制。AD的一線療法是局部外用糖皮質(zhì)激素，但易出現(xiàn)“反跳現(xiàn)象”，長期使用易出現(xiàn)毛細血管擴張、皮膚萎縮、多毛等不良反應(yīng)，且部分患者對外用糖皮質(zhì)激素心存顧慮，依從性低。經(jīng)回顧性文獻研究[2-4]和筆者臨床觀察發(fā)現(xiàn)：中藥三黃洗劑外洗治療AD不僅有清潔、除菌、止癢作用，還有保濕、修復(fù)屏障功能的功效，有縮短療程、降低復(fù)發(fā)率、經(jīng)濟安全的特點。本研究擬運用三黃洗劑治療AD模型小鼠，觀察中間絲聚合蛋白（FLG）、水通道蛋白 3（AQP3）和角蛋白17（K17）的表達情況，以探尋三黃洗劑治療AD的部分作用機制?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物與材料 6周齡雌性BALB/c小鼠，由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供。中藥三黃洗劑（白鮮皮、黃柏、苦參、白蒺藜、黃連、大黃、地膚、連翹、皂刺）由浙江省景岳堂藥物有限公司提供。2，4-二硝基氯苯丙酮溶液來自美國Sigma公司。兔抗人FLG抗體購自Abcam公司，羊抗人AQP3抗體、鼠K17購自美國Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 AD模型制備 取60只小鼠，將小鼠背部剃毛，面積約2 cm×2 cm。隨機取出10只小鼠作為正常對照組，其他50只小鼠為造模組，于第1周在其剃毛區(qū)涂7%的2，4-二硝基氯苯丙酮溶液100 μL致敏。第2周開始至第7周，造模組小鼠每周在其剃毛區(qū)域涂抹2次1%的2，4-二硝基氯苯丙酮溶液進行激發(fā)，涂抹100 μL/次。正常對照組小鼠以等體積無菌水涂抹剃毛區(qū)。

1.2.2 給藥及免疫組化 造模第6周，將造模組小鼠隨機分為模型組、復(fù)方地塞米松軟膏組、三黃洗劑低劑量組、三黃洗劑中劑量組、三黃洗劑高劑量組，每組10只小鼠。從分組當(dāng)天開始，在剃毛區(qū)進行皮膚涂抹給藥2次/d，連續(xù)給藥2周。正常對照組和模型組涂抹無菌水0.2 mL/d，復(fù)方地塞米松軟膏組每次涂抹復(fù)方地塞米松軟膏0.2 mL，三黃洗劑低、中、高劑量組每次涂抹1g生藥/mL的三黃洗劑0.1、0.2、0.4 mL。

實驗第7周末次給藥2 h后處死小鼠，剝?nèi)√昝珔^(qū)皮膚組織分為2份，一份固定于10%福爾馬林溶液，后續(xù)采用免疫組化法檢測皮膚組織中FLG、AQP3和K17的表達；另一份稱量皮膚濕重后置60℃烘箱干燥一夜，于第2天稱量干重，計算失重比。

1.2.3 結(jié)果判定 免疫組化結(jié)果根據(jù)顯色程度和陽性細胞數(shù)量進行綜合評分。無著色、淡黃色、棕黃色、棕褐色分別記為0分、1分、2分、3分。陽性細胞≤2%、陽性細胞3%～20%、陽性細胞21%～60%、陽性細胞＞60%分別記為0分、1分、2分、3分。綜合評價值由兩類計分分值的乘積表示，0～3分為（-），4分為（+），6分為（++），9分為（+++）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。2組間計量資料比較采用獨立樣本t檢驗，計數(shù)資料的組間比較采用卡方檢驗或Fisher精確概率法。P＜0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 造模結(jié)果 與正常對照組相比，造模小鼠剃毛區(qū)皮膚于試驗第6周明顯可見紅腫、結(jié)痂等病理特征，顯示造模成功。見圖1。

圖1 造模圖片

2.2 皮損組織干燥失重結(jié)果 同正常對照組比，模型組、三黃洗劑低、中、高劑量組以及復(fù)方地塞米松乳膏組皮膚失重比均有所增加且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。見表1。

表1 小鼠皮損組織干燥失重比 （±s）

表1 小鼠皮損組織干燥失重比 （±s）

注：與正常對照組比較，*P<0.01。

平均失重比（%）正常對照組 1 0 0.1 4 5±0.0 3 9 0.0 4 7±0.0 1 3 6 7.8 9±1.9 1模型組 1 0 0.2 4 3±0.0 5 8 0.0 6 5±0.0 1 5 7 3.1 1±2.7 7*三黃免煎洗劑高劑量組 1 0 0.2 8 9±0.0 5 9 0.0 8 0±0.0 2 0 7 2.6 4±2.1 5*三黃免煎洗劑中劑量組 1 0 0.2 2 3±0.0 2 8 0.0 6 2±0.0 0 7 7 2.1 8±2.3 8*三黃免煎洗劑低劑量組 1 0 0.2 4 8±0.0 4 6 0.0 6 9±0.0 1 3 7 2.1 8±1.4 6*復(fù)方地塞米松乳膏組 1 0 0.1 5 8±0.0 3 9 0.0 4 1±0.0 1 0 7 3.7 3±1.2 7*組別 n 干燥前均重（g）干燥后均重（g）

2.3 皮損組織免疫組化結(jié)果 皮損組織中FLG的免疫組化結(jié)果顯示與正常對照組比較，模型組皮損組織FLG的表達明顯低于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；同模型組相比，三黃洗劑低、中、高劑量組和復(fù)方地塞米松乳膏組皮損組織中FLG表達量高于模型組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見圖2、表2。

圖2 皮損組織FLG免疫組化結(jié)果（SP染色×100）

表2 皮損組織FLG免疫組化結(jié)果

皮損組織中AQP3的免疫組化結(jié)果顯示與正常對照組比較，模型組皮損組織AQP3的表達明顯高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；同模型組相比，三黃洗劑低、中、高劑量組和復(fù)方地塞米松乳膏組皮損組織中AQP3表達量低于模型組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見圖3、表3。

圖3 皮損組織AQP3免疫組化結(jié)果（SP染色×100）

表3 皮損組織AQP3免疫組化結(jié)果

皮損組織中K17的免疫組化結(jié)果顯示與正常對照組比較，模型組皮損組織K17的表達明顯高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；同模型組相比，給藥組和復(fù)方地塞米松乳膏組皮損組織中K17表達量低于模型組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見圖4、表4。

圖4 皮損組織K17免疫組化結(jié)果（SP染色×100）

表4 皮損組織K17免疫組化結(jié)果

3 討論

皮膚屏障由角質(zhì)形成細胞和特定的脂質(zhì)組成，形成所謂的“磚墻”結(jié)構(gòu)。皮膚屏障物質(zhì)涉及有蛋白質(zhì)、脂類、水及電解質(zhì)等，其中蛋白質(zhì)包括FLG與角蛋白等。皮膚屏障功能對人體至關(guān)重要，不僅能阻擋外來的物理因素的刺激，抵御病原微生物的入侵和外界過敏原的滲入，而且能防止水分等重要物質(zhì)丟失[5]。皮膚屏障缺陷可促進過敏原致敏，并誘導(dǎo)全身過敏反應(yīng)，如高IgE水平和氣道高反應(yīng)性。研究發(fā)現(xiàn)，皮膚屏障結(jié)構(gòu)和功能異常是AD發(fā)病的最重要的機制，可能與免疫失調(diào)，F(xiàn)LG基因突變，抗微生物肽缺乏等有關(guān)。

FLG最初以無活性的絲聚合蛋白原前體形式聚集在顆粒細胞中，在顆粒層向角質(zhì)層分化過程中經(jīng)過脫磷酸化轉(zhuǎn)化為有活性的絲聚合蛋白。進一步通過脫氨基變成游離氨基酸，其終末產(chǎn)物乳酸、吡咯酮梭酸、尿刊酸、鳥氨酸、瓜氨酸等為天然保濕因子的主要來源。編碼FLG的基因位于人類常染色體lq21上，包含2個內(nèi)含子和3個外顯子[6]。編碼基因的突變可導(dǎo)致其表達降低，引起水合功能障礙，最終導(dǎo)致皮膚屏障功能障礙。本研究發(fā)現(xiàn)，AD小鼠模型皮損組織FLG的表達明顯低于正常皮膚，符合AD小鼠模型皮膚屏障受損，經(jīng)表皮水丟失多；經(jīng)過三黃洗劑的治療后，給藥組皮損組織中FLG表達量高于模型組，證明三黃洗劑對恢復(fù)皮膚屏障、防止水分丟失有較好的作用。

AQP3是哺乳動物細胞膜上特異性的跨膜蛋白，主要分布在表皮的基底層，并且從基底層到角質(zhì)層的分布呈銳減梯度。AQP3能把內(nèi)循環(huán)的水分、甘油、尿素等物質(zhì)通過跨膜轉(zhuǎn)運的方式輸送到表皮，其對調(diào)節(jié)皮膚屏障功能起到至關(guān)重要的作用。AQP3基因缺陷的小鼠，水分和甘油的通透性降低，表皮的含量水偏低，皮膚屏障受損，對外界微生物的抵御能力降低。Olsson等[7]發(fā)現(xiàn)AD患者AQP3表達水平顯著高于正常人群，水分丟失嚴重，易出現(xiàn)皮膚干燥，且AD患者皮膚pH值偏高，可進一步加重了水分丟失量。筆者研究發(fā)現(xiàn)，正常對照組AQP3在基底層表達，而模型組的基底層、棘層及顆粒層全層表達，且表達水平明顯高于對照組。經(jīng)三黃洗劑的治療后，給藥組皮損組織中AQP3表達量低于模型組，證明三黃洗劑能有效的抑制AD小鼠的AQP3表達，減輕炎性水腫，修復(fù)皮膚屏障的功效。

角蛋白是角質(zhì)形成細胞和其他上皮細胞的主要結(jié)構(gòu)蛋白和標(biāo)志性成分。正常情況下，K17在健康皮膚中不表達，或在皮膚附屬器中少量表達，但在炎癥性和增生性皮膚病中可過度表達[8]。筆者的結(jié)果提示K17在正常對照組少量表達，而模型組可見全層表達呈強陽性，提示AD存在表皮細胞的增殖和炎性反應(yīng)。經(jīng)三黃洗劑治療后，給藥組AD小鼠K17表達較模型組明顯減少，并且其表達量隨三黃洗劑濃度的增加而遞減，證實三黃洗劑能改善AD表皮的過度增殖和代謝，能顯著改善皮膚屏障功能。

三黃洗劑為我院制劑室提供的協(xié)同處方，在我院應(yīng)用已有10年之久，筆者臨床中驗證了其治療AD療效確切，安全性好。三黃洗劑主要成分為白鮮皮、黃柏、苦參、白蒺藜、黃連、大黃、地膚、連翹和皂刺等，查閱文獻發(fā)現(xiàn)具有清熱解毒、止癢潤膚之功效，治療AD有很好的療效。經(jīng)現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明三黃洗劑不僅有止癢潤膚、修復(fù)皮膚屏障功能，對金黃色葡萄球菌、化膿性鏈球菌等細菌有較強的抑菌殺菌，抑制念珠菌等真菌感染的作用[9]，而且有抗阻胺、抗炎性因子釋放、穩(wěn)定溶酶體膜、免疫調(diào)節(jié)的作用。

綜上，本研究中三黃洗劑治療AD小鼠后能減輕炎性反應(yīng)水腫，提高FLG含量，降低AQP3、K17的表達，可證明其提高水合能力，促進皮膚屏障的修復(fù)，為闡明三黃洗劑治療AD的分子生物學(xué)機制提供了理論依據(jù)。