銅綠假單胞菌對(duì)鱟素耐藥前后的差異表達(dá)基因及SNP變化研究

洪軍 衛(wèi)夏怡 吉冰潔 葉延欣 程天賜

（河南城建學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，平頂山 467036）

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）作為一種人畜共患條件性致病菌，通常感染肺部、尿道、燒傷等部位，已成為醫(yī)院和養(yǎng)殖廠等感染的三大致病菌之一。由于對(duì)抗生素的多重耐藥性，在臨床抗感染治療中有著特殊重要的地位。該菌極易形成生物膜，單獨(dú)使用抗生素的治療效果并不理想。目前對(duì)銅綠假單胞菌感染的防治是醫(yī)學(xué)界迫切需要解決的問題，對(duì)其耐藥性產(chǎn)生的研究為預(yù)防和治療由銅綠假單胞菌引起的感染具有重要的指導(dǎo)意義。

鱟素（Tachyplesin I）是1988年由Nakamura等［1］從中國(guó)鱟血細(xì)胞的酸性提取物中分離出來的一種具有17個(gè)氨基酸殘基的典型環(huán)狀β-折疊結(jié)構(gòu)的陽(yáng)離子抗菌肽。已研究證明鱟素具有廣譜抗菌活性，可開發(fā)成抗菌藥物、抗腫瘤藥物、免疫調(diào)節(jié)劑和飼料添加劑等。2019年12月份國(guó)家農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布194號(hào)公告指出：自2020年元旦起，我國(guó)飼料中全面禁止添加抗生素，減少濫用抗生素造成的危害，維護(hù)動(dòng)物源食品安全和公共衛(wèi)生安全。因此尋找一些新型抗菌劑替代抗生素已成為新時(shí)代綠色環(huán)保養(yǎng)殖行業(yè)的重中之重。作為抗生素替代品的侯選開發(fā)抗菌肽之一，除了作為抗菌藥物使用外，也可以作為新型功能性添加劑應(yīng)用到飼料中。然而，已有研究報(bào)道表明一些細(xì)菌（尤其人類病原菌）已對(duì)部分抗菌肽產(chǎn)生了耐藥性［2-3］。本課題組在實(shí)驗(yàn)室條件下通過長(zhǎng)期連續(xù)增高濃度鱟素誘導(dǎo)后，銅綠假單胞菌CGMCC 1.2620和ATCC 27853菌株均能對(duì)鱟素產(chǎn)生不同程度的耐藥性［4-5］，但是銅綠假單胞菌耐藥前后能引起哪些基因的差異表達(dá)以及是否引起SNP和sRNA的變化，以及sRNA是否能調(diào)控這些差異表達(dá)基因尚不清楚。

隨著高通量測(cè)序技術(shù)的迅速發(fā)展，細(xì)菌轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究可幫助人們探究細(xì)菌耐藥前后發(fā)生差異表達(dá)的基因以及篩選出具有調(diào)控作用的非編碼RNA。sRNA（small RNA）是一類廣泛存在于原核生物基因組中能被轉(zhuǎn)錄但不編碼蛋白質(zhì)的一類RNA 分子，長(zhǎng)度為50-300 nt的核苷酸，位于基因組2%-12%的基因間區(qū)域。有研究表明，細(xì)菌為適應(yīng)各種不同的外界環(huán)境，通過較為復(fù)雜的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)來對(duì)其做出反應(yīng)，而其中sRNA發(fā)揮了重要的作用［6-7］，并揭示sRNA與細(xì)菌耐藥性密切相關(guān)［8］。通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究手段篩選細(xì)菌中存在的sRNA并研究sRNA所發(fā)揮的功能，對(duì)揭示細(xì)菌耐藥基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控具有重要意義。Miller等［9］表明銅綠假單胞菌中存在著一系列sRNA，其中Rsm W的過度表達(dá)及Rsm Z的表達(dá)水平降低均有助于增強(qiáng)生物膜的形成，而Rsm Z的過度表達(dá)則會(huì)抑制生物膜的形成。劉翠翠［10］利用RNA-Seq技術(shù)對(duì)福氏志賀菌的耐藥株中差異表達(dá)的sRNA進(jìn)行了GO富集分析和KEGG Pathway分析，為揭示福氏志賀菌sRNA與其耐藥性的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。Zhang等［11］表明在環(huán)境適應(yīng)過程中，細(xì)菌利用sRNAs來抑制或激活其蛋白質(zhì)組的大部分表達(dá)，并且已經(jīng)鑒定出了兩個(gè)sRNAs（Sr0161和ErsA）主要是與負(fù)責(zé)碳青霉烯類抗生素?cái)z取的主要孔蛋白OprD mRNA相互作用。這兩個(gè)sRNAs與oprD的5'UTR堿基配對(duì)導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)美羅培南的耐藥性增加。Sr0161在沒有Hfq的情況下，正調(diào)控PagL的表達(dá)，降低其促炎特性并導(dǎo)致多粘菌素抗性。通過RNASeq技術(shù)等轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究手段可篩選出對(duì)細(xì)菌外排泵系統(tǒng)、生物被膜形成等具有調(diào)控作用的sRNA及靶基因，從RNA水平揭示了sRNA對(duì)細(xì)菌耐藥性形成的影響。

SNP（single nucleotide polymorphism）主要是指基因組在核苷酸水平上發(fā)生變異引起的DNA序列多態(tài)性，包括單個(gè)堿基轉(zhuǎn)換、顛換以及單個(gè)堿基插入和缺失等。在基因組DNA中，任何堿基都可能發(fā)生突變，因此SNP可存在于基因的任意序列中，可能位于非編碼序列中，也可能位于基因序列中。張棟等［12］采用直接測(cè)序法從P0代尼羅羅非魚的β2m基因組序列中篩選出30個(gè)SNP，獲取其位置信息，并利用Popgen32和picc -calc軟件分析其遺傳參數(shù)，結(jié)果表明24個(gè)SNPs的基因型和等位基因頻率與無乳鏈球菌的耐感/易感態(tài)顯著相關(guān)。

本研究通過對(duì)銅綠假單胞菌野生株CGMCC1.2620（PA1.2620）和 高 抗 鱟 素 突 變 株CGMCC1.2620-99（PA-99）進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，在轉(zhuǎn)錄組水平上通過對(duì)差異表達(dá)基因以及差異表達(dá)的sRNA的靶基因進(jìn)行功能富集和SNP分析，找到與抗藥相關(guān)的差異表達(dá)的sRNA基因及其相關(guān)通路信息以及SNP變化，為進(jìn)一步探討銅綠假單胞菌對(duì)鱟素的耐藥性機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)菌株：銅綠假單胞菌CGMCC1.2620（PA1.2620）由中國(guó)微生物菌種保藏中心（CGMCC）提供。耐鱟素突變株銅綠假單胞菌PA-99是由PA1.2620菌株在本實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期連續(xù)暴露的增高鱟素濃度選擇壓力下轉(zhuǎn)接99代獲得的突變株。鱟素對(duì)PA1.2620和PA-99菌株的最小抑制濃度值分別為10 μg/mL和150 μg/mL。

抗菌肽：鱟素（tachyplesin I，含有兩個(gè)二硫鍵的環(huán)行肽）由吉爾生化（上海）有限公司合成，純度為95%以上。

1.2 方法

1.2.1 測(cè)序樣品制備及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序 PA1.2620原始菌株和PA-99突變株在30℃恒溫?fù)u床上180 r/min培養(yǎng)12 h后，按OD600=0.2的濃度轉(zhuǎn)接到新鮮的MHB培養(yǎng)基中，并生長(zhǎng)至OD600=1.0時(shí)開始收集。用細(xì)菌總RNA純化試劑盒提取和純化總RNA（Sangon Biotech Co.，Ltd.，Shanghai，China）。為 了 確 保總RNA能滿足轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析的質(zhì)量，分別采用Nanodrop、Qubit 2.0、Agilent 2100、電泳方法檢測(cè)RNA樣品的純度、濃度、完整性和是否有基因組DNA污染等。每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)?？俁NA樣本檢測(cè)合格后，委托百邁客生物科技有限公司對(duì)樣品進(jìn)行cDNA文庫(kù)構(gòu)建和有參轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析；測(cè)序平臺(tái)Illumina HiSeq2500。

1.2.2 基因表達(dá)量及差異表達(dá)基因功能分析 利用DESeq軟件進(jìn)行差異表達(dá)分析，基因表達(dá)量的計(jì)算使用RPKM（Reads Per Kilobase of transcript per Million fragments mapped）法。將Fold Change≥2且FDR＜0.01作為篩選差異表達(dá)基因標(biāo)準(zhǔn)，即log2FC≥1 是上調(diào)表達(dá)，log2FC≤1下調(diào)表達(dá)［13］。得到差異表達(dá)基因后，對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行功能注釋、KEGG Pathway和GO功能分析［14-16］。利用KEGG和Gene Ontology數(shù)據(jù)庫(kù)找出與整個(gè)基因組背景相比在顯著差異表達(dá)基因中q-Value≤0.05的顯著性富集的Pathway及GO條目。

1.2.3 RT-qPCR驗(yàn)證 用RT-qPCR來驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測(cè)序檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。分別從PA-99突變株和原始菌株P(guān)A1.2620中選擇5個(gè)靶基因進(jìn)行RT-qPCR分析。每個(gè)基因設(shè)3個(gè)重復(fù)。此外，使用KAPA SYBR FAST qPCR試劑盒在ABI7900實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行RT-qPCR測(cè)定。利用Primer Premier 5軟件根據(jù)銅綠假單胞菌基因組序列設(shè)計(jì)特異性引物。反應(yīng)條件：95℃ 2 min，94℃ 20 s，60℃ 20 s，72℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。以16S rRNA為內(nèi)參，基因的相對(duì)表達(dá)水平用2-ΔΔCt方法定量［17］。

1.2.4 差異表達(dá)sRNA及靶基因的分析 利用miRDeep2 軟件將測(cè)序Read比對(duì)到基因組上后，看那段區(qū)域是否能形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，且Read位于臂上，得到一個(gè)分值，篩選后得到預(yù)測(cè)結(jié)果，用的軟件是miRDeep2。篩選出PA1.2620與PA-99差異表達(dá)的sRNA；對(duì)篩選出來的差異sRNA靶基因數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，找出差異表達(dá)的基因，并對(duì)其進(jìn)行GO功能和KEGG通路富集分析。

1.2.5 差異表達(dá)基因和sRNA靶基因的SNP分析 基于各樣品Reads與參考基因組序列的Bowtie比對(duì)結(jié)果，使用GATK軟件識(shí)別測(cè)序樣品與參考基因組間的單堿基錯(cuò)配，查找基因區(qū)潛在的單核苷酸多態(tài)性SNP位點(diǎn)。

在有參轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的結(jié)果上進(jìn)行比對(duì)，對(duì)實(shí)驗(yàn)中所用對(duì)照組與處理組的各個(gè)樣品組內(nèi)發(fā)生的SNP進(jìn)行比對(duì)統(tǒng)計(jì)，并對(duì)其類型和數(shù)目統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)行分析。通過百邁客云平臺(tái)的基于基因ID過濾GFF信息小工具，在銅綠假單胞菌的gff文件中提取得到基因?qū)?yīng)的位置信息。將SNP的位置信息與基因?qū)?yīng)的位置信息比對(duì)，可以得到差異基因中產(chǎn)生SNP的數(shù)目和類型。所得數(shù)據(jù)主要通過百邁客云平臺(tái)分析。

2 結(jié)果

2.1 測(cè)序數(shù)據(jù)及表達(dá)量分析

對(duì)原始測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾和質(zhì)量控制，之后對(duì)兩個(gè)樣品的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行評(píng)估，包括與參考基因組的比對(duì)（比對(duì)效率都在87.65%及以上）、rRNA統(tǒng)計(jì)、測(cè)序隨機(jī)性評(píng)價(jià)以及Reads在參考基因組上的分布等，這些分析結(jié)果表明該測(cè)序結(jié)果較為理想。在銅綠假單胞菌6 318個(gè)基因中，PA-99與PA1.2620菌株的表達(dá)差異的基因有1 459個(gè)，其中上調(diào)表達(dá)的基因?yàn)?72個(gè)，下調(diào)表達(dá)的基因?yàn)?87個(gè)。其中l(wèi)og2FC值上調(diào)表達(dá)倍數(shù)為3.0以上有35個(gè)基因，下調(diào)表達(dá)倍數(shù)為3.0以上基因有58個(gè)，且下調(diào)倍數(shù)log2FC大于11為28個(gè)基因。此結(jié)果表明，銅綠假單胞菌對(duì)鱟素產(chǎn)生耐藥性導(dǎo)致許多基因發(fā)生差異表達(dá)。

2.2 PA1.2620與PA-99菌株差異表達(dá)基因的功能富集分析

2.2.1 差異表達(dá)基因的GO功能富集分析 由GO富集的前20個(gè)GO條目圖1可知，在分子功能方面發(fā)生富集的亞類主要有：核苷酸結(jié)合（nucleotide binding，18）、甲酸脫氫酶（NAD+）活性（formate dehydrogenase（NAD+）activity，6）、錯(cuò) 配DNA結(jié)合（mismatched DNA binding，4）、受體結(jié)合（receptor binding，3）等等；在生物過程發(fā)生主要富集的GO條目有：細(xì)胞呼吸（cellular respiration，4）、錯(cuò)配修 復(fù)（mismatch repair，4）、細(xì) 胞 溶 解（cytolysis，4）等；在細(xì)胞組分主要發(fā)生富集的GO 條目是細(xì)胞膜的組成部分（integral component of membrane，158）。最為富集的前3條GO Term依次為：integral component of membrane、nucleotide binding、formate dehydrogenase（NAD+）activity。在GO功能研究中，我們重點(diǎn)關(guān)注GO富集的前20個(gè)GO條目。

圖 1 PA1.2620 與 PA-99 菌株差異基因的 GO 富集圖Fig. 1 GO enrichment analysis of differentially expressed genes between PA1.2620 vs. PA-99 strains.

2.2.2 KEGG通路富集分析 根據(jù)PA1.2620與PA-99菌株差異表達(dá)基因的KEGG結(jié)果可知，此次分析將395個(gè)基因注釋到KEGG的98條通路上，涉及到各種氨基酸、脂質(zhì)、能量、糖類等代謝（266個(gè)基因，最多）、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)（36個(gè)基因）、雙組分系統(tǒng)（43個(gè)基因）、細(xì)菌分泌系統(tǒng)（16個(gè)基因）、細(xì)菌趨化性（16個(gè)基因）、氨酰生物合成（14個(gè)基因）等通路。由圖2富集的前20個(gè)通路可知，無顯著富集的通路。其中細(xì)菌趨化性（bacterial chemotaxis）、氨酰生物合成（aminoacyl-tRNA biosynthesis）通路中所涉及的基因通常與抗藥性密切相關(guān)。但Toluene degradation、Chlorocycchexane and chiorobenzene degradgfion、Phosphonate and phosphinate melaboisn、Novobiocin biosynthesis、Aminobenzoate degradation這些通路需要我們重點(diǎn)關(guān)注。

圖2 PA1.2620與PA-99菌株差異基因的KEGG富集圖Fig.2 KEGG pathway enrichment analysis of differentially expressed genes between PA1.2620 vs. PA-99 strains

2.3 RT-qPCR驗(yàn)證

為了驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及后續(xù)SNP和sRNA靶基因等分析的結(jié)果，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道挑選了疑似耐藥性的ParR、phoB、PA3573和opr86差異表達(dá)基因以及上調(diào)表達(dá)量最高的PA0912基因進(jìn)行RT-qPCR測(cè)定。如圖3所示，所有選擇的差異表達(dá)基因在RNA-Seq和RT-qPCR結(jié)果之間顯示一致的表達(dá)模式，但是整體而言RT-qPCR數(shù)值較RNA-Seq表達(dá)量數(shù)值偏高。

圖3 RT-qPCR驗(yàn)證結(jié)果Fig. 3 RT-qPCR validation results

2.4 SNP分析

2.4.1 SNP突變類型統(tǒng)計(jì) 對(duì)PA-99突變株各樣品對(duì)比PA1.2620樣品篩選出SNP位點(diǎn)數(shù)目、轉(zhuǎn)換類型比例、顛換類型比例以及雜合型SNP位點(diǎn)比例進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，如表1所示。以及對(duì)比分析得到各個(gè)處理樣品組的SNP類型進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)如圖4所示。根據(jù)圖和表可知：相對(duì)于對(duì)照基因組來講，各個(gè)樣品組間發(fā)生的SNP類型頻率相對(duì)一致，在其中發(fā)生轉(zhuǎn)換類型的頻率遠(yuǎn)高于顛換類型，在轉(zhuǎn)換之中數(shù)量最多的為A/G，其次是C/T。

表1 SNP位點(diǎn)統(tǒng)計(jì)表Table 1 Statistical table of SNP sites

圖4 PA-99突變株樣品的SNP突變類型分布圖Fig. 4 Distribution of SNP mutation types in PA-99 mutant samples

2.4.2 差異表達(dá)基因上產(chǎn)生的SNP分析 以PA1.2620菌株作為對(duì)照組，將PA-99組菌株與其對(duì)比結(jié)果匯總在一起查找差異表達(dá)基因的SNP。由PA1.2620與PA-99菌株的差異表達(dá)基因上產(chǎn)生的SNP可知，在1 459個(gè)差異表達(dá)基因中，共有SNP發(fā)生的基因數(shù)目為43個(gè)（25個(gè)上調(diào)和18個(gè)下調(diào)基因），其中新基因是10個(gè)如Novel_244、Novel_137、Novel_28等，差異表達(dá)值最大的基因是未知功能基因（ID為Novel_28基因）。對(duì)這些發(fā)生SNP基因過濾掉僅在一個(gè)生物學(xué)重復(fù)中發(fā)生的堿基突變，在這43個(gè)差異表達(dá)基因中SNP為PA-99菌株3個(gè)重復(fù)組共同發(fā)生的基因數(shù)目為22個(gè)（12個(gè)表達(dá)上調(diào)和10個(gè)表達(dá)下調(diào)基因）如表2所示，此結(jié)果也表明不僅不同處理組間存在SNP變化，而且重復(fù)組內(nèi)也存在SNP變化的差別。這22個(gè)發(fā)生SNP的基因中包括5個(gè)新基因，7個(gè)假定蛋白基因，10個(gè)已知功能基因，SNP主要發(fā)生在基因表達(dá)量log2FC值在1-3倍之間。Novel_745基因的差異表達(dá)值最大（上調(diào)表達(dá)log2FC=2.58倍以上），是一種未知功能蛋白，但僅發(fā)生了一個(gè)堿基突變。這些發(fā)生SNP突變的已知基因，如pagL 基因是脂質(zhì)A脫酰基酶，是參與脂質(zhì)A代謝過程功能，下調(diào)表達(dá)log2FC=2.3倍以下；opr86是一個(gè)編碼外膜蛋白基因；PmrB雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)信號(hào)傳導(dǎo)激酶，與脂多糖的修飾有關(guān)。

表2 PA1.2620與PA-99菌株差異表達(dá)基因的SNP信息Table 2 SNP analysis of differentially expressed genes in PA1.2620 vs. PA-99 strains

2.5 PA1.2620與PA-99菌株差異表達(dá)sRNA分析

2.5.1 差異表達(dá)sRNA及其靶基因數(shù)目分析 由表3和圖5可知：按照篩選差異表達(dá)基因的標(biāo)準(zhǔn)，篩選到PA1.2620與PA-99菌株的差異表達(dá)sRNA共有11個(gè)，其中1個(gè)sRNA上調(diào)表達(dá)，10個(gè)下調(diào)表達(dá)，且均是未知功能sRNA。通過對(duì)其靶基因進(jìn)行篩選，篩選到的靶基因總數(shù)為5 840個(gè)，其中差異表達(dá)靶基因?yàn)? 247個(gè)。每個(gè)sRNA所對(duì)應(yīng)的靶基因個(gè)數(shù)差別較大，其中sRNA Novel_583有968個(gè)靶基因包括223差異表達(dá)靶基因，而Novel_33有25個(gè)靶基因，僅存在4個(gè)差異表達(dá)靶基因。這些結(jié)果表明，sRNA所對(duì)應(yīng)的靶基因越多，調(diào)控的基因功能越多，且存在不同sRNA基因調(diào)控同一靶基因的現(xiàn)象。因其存在不同sRNA有相同的靶基因，過濾掉重復(fù)后其靶基因總數(shù)為4 027個(gè)，其中差異表達(dá)靶基因?yàn)?63個(gè)。隨后重點(diǎn)關(guān)注這些sRNA的差異表達(dá)靶基因。

圖5 PA1.2620與PA-99菌株差異表達(dá)的sRNA靶基因數(shù)目統(tǒng)計(jì)圖Fig.5 Statistical diagram of the number of sRNA target genes of differentially expressed genes in PA1.2620 vs. PA-99 strains

表3 PA1.2620與PA-99菌株差異表達(dá)sRNATable 3 sRNA of differentially expressed genes in PA1.2620 vs. PA-99 strains

2.5.2 sRNA差異表達(dá)靶基因GO功能富集分析 根據(jù)PA1.2620與PA-99的 差 異 表 達(dá)sRNA靶 基 因的GO富集前20個(gè)GO Term可知（圖6），在分子功能大類下主要發(fā)生富集的GO Term有：高絲氨酸激酶活性（homoserine kinase activity，3）、5-羧甲基-2-羥基黏液酸δ-異構(gòu)酶活性（5-carboxymethyl-2-hydroxymuconate delta-isomerase activity，3）、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合（transcription factor binding，8）等等；在生物學(xué)過程大類下主要發(fā)生富集的GO Term有：組氨酸生物合成（histidine biosynthetic process，7）、蘇氨酸氨基甲酰胺腺苷生物合成過程（threonylcarbamoyladenosine biosynthetic process，3）、細(xì)胞蛋白質(zhì)代謝過程（cellular protein metabolic process，13）等。最富集的前5個(gè)GO Term依次為：組氨酸生物合成（histidine biosynthetic process）、高絲氨酸激酶活性（homoserine kinase activity）、5-carboxymethyl-2-hydroxymuconate delta-isomerase activity（3）、threonylcarbamoyladenosine biosynthetic process、transcription factor binding，均為極顯著富集水平。

圖6 PA1.2620與PA-99菌株表達(dá)差異sRNA靶基因的GO富集圖Fig.6 GO enrichment of sRNA target genes of DEGs in PA1.2620 vs. PA-99 strains

2.5.3 差異sRNA靶基因的KEGG富集分析 通過KEGG富集圖7可知，沒有顯著富集的通路。但是Biosynthesis of unsaturated fatty acids、Phosphotransferase system（PTS）、Degradation of aromatic compounds、Carbon metabolism等通路所涉及的差異表達(dá)基因富集較可靠。

圖7 PA1.2620與PA-99菌株表達(dá)差異sRNA靶基因的KEGG富集圖Fig.7 KEGG enrichment of differentially expressed sRNA target genes in PA1.2620 vs. PA-99 strains

2.5.4 差異表達(dá)sRNA靶基因的SNP分析 對(duì)PA1.2620與PA-99菌株的差異表達(dá)的11個(gè)sRNA發(fā)生的SNP的數(shù)據(jù)為0個(gè)。對(duì)其差異表達(dá)sRNA的863個(gè)差異表達(dá)靶基因上發(fā)生的SNP的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，共有22個(gè)靶基因發(fā)生SNP變化，其中在PA-99菌株的3個(gè)生物學(xué)重復(fù)中兩者或兩者以上共同發(fā)生的有10個(gè)靶基因（表4）。sRNA靶基因發(fā)生SNP變化的較少，且多發(fā)生在較低差異表達(dá)靶基因，僅有pvdL基因有2個(gè)位點(diǎn)突變，其余9個(gè)基因均發(fā)生一個(gè)位點(diǎn)突變。這些SNP的變化主要涉及的sRNA所作用的靶基因除了3個(gè)靶點(diǎn)新基因外，還涉及到編碼外膜蛋白基因opr86；雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)信號(hào)傳導(dǎo)激酶pmrB，該雙組分調(diào)控系統(tǒng)調(diào)控PA3552-PA3559 脂多糖修飾操縱子，該操縱子是陽(yáng)離子抗菌肽和多粘菌素B陽(yáng)離子抗菌肽耐藥所必需的；以及編碼肽合成酶基因pvdL，主要參與銅綠假單胞菌鐵載體合成和脂類生物學(xué)合成過程，參與催化活性的分子功能。sRNA如何參與這些靶基因的功能有待進(jìn)一步研究及驗(yàn)證。

表4 sRNA相關(guān)靶基因的SNP變化分析Table 4 SNP analysis of sRNA target genes

3 討論

通過對(duì)耐藥菌株中差異表達(dá)基因的分析，有助于研究者們從眾多差異表達(dá)的基因中篩選出與細(xì)菌耐藥性密切相關(guān)的基因及其可能參與的代謝途徑，可為揭示細(xì)菌耐藥性機(jī)制提供新的思路，同時(shí)為新型抗耐藥菌藥物的研究奠定理論基礎(chǔ)。sRNA是一類新發(fā)現(xiàn)的基因表達(dá)調(diào)控因子，通過與靶mRNA或靶蛋白配對(duì)，從而調(diào)控細(xì)胞的生理功能以應(yīng)對(duì)各種環(huán)境變化，尤其在細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生方面至關(guān)重要。這些差異表達(dá)的sRNA主要是通過作用于相應(yīng)的靶mRNA，進(jìn)而發(fā)揮其調(diào)控作用。在基因組水平上，由單個(gè)核苷酸變異引起的DNA序列多態(tài)性即稱為SNP，SNP可進(jìn)行復(fù)雜性狀的關(guān)聯(lián)分析，從而揭示相關(guān)性狀的遺傳機(jī)理?；蛲蛔儺a(chǎn)生的耐藥性是一個(gè)長(zhǎng)期積累的過程，不同于轉(zhuǎn)錄組，基因組較穩(wěn)定，不易發(fā)生突變，在經(jīng)過特殊的誘導(dǎo)處理后可產(chǎn)生定向的突變以應(yīng)對(duì)環(huán)境中的選擇性壓力。這些突變可能是菌株生存環(huán)境變化后為適應(yīng)新環(huán)境做出的一些應(yīng)對(duì)調(diào)整，可能與耐藥性、毒力等相關(guān)基因的特異性突變無關(guān)。對(duì)于差異表達(dá)基因、sRNA所對(duì)應(yīng)靶基因與相應(yīng)SNP進(jìn)行分析，可從轉(zhuǎn)錄組和基因組層面來預(yù)測(cè)銅綠假單胞菌對(duì)鱟素耐藥性產(chǎn)生的原因，從而對(duì)于耐藥性機(jī)制的預(yù)測(cè)作為相互補(bǔ)充。因此，本研究基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的基礎(chǔ)上，對(duì)差異表達(dá)基因的SNP和sRNA的靶基因進(jìn)行了預(yù)測(cè)分析，以期為銅綠假單胞菌對(duì)鱟素的耐藥性的產(chǎn)生提供一定的理論支持。

本研究通過對(duì)高抗鱟素銅綠假單胞菌PA-99菌株與PA1.2620敏感菌株進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，在轉(zhuǎn)錄組水平上通過對(duì)差異表達(dá)基因及sRNA靶基因進(jìn)行富集分析，發(fā)現(xiàn)這些基因大多與氨基酸、糖類等物質(zhì)的代謝通路、DNA轉(zhuǎn)錄、金屬離子的轉(zhuǎn)運(yùn)以及代謝、細(xì)菌趨化性、雙組分調(diào)控系統(tǒng)等通路有關(guān)以及涉及到細(xì)胞膜組成部分、核苷酸結(jié)合及酶的活性等功能。對(duì)于差異表達(dá)基因和sRNA靶基因的SNP變化，主要涉及到編碼脂質(zhì)A脫?；?、外膜蛋白、冷休克蛋白、鐵代謝、以及與脂多糖修飾相關(guān)等已知基因和一些編碼的假定蛋白、部分編碼的新基因有關(guān)，這些靶基因的SNP變化是否與抗藥性相關(guān)有待進(jìn)一步驗(yàn)證。這些結(jié)果表明sRNA在調(diào)控銅綠假單胞菌對(duì)鱟素的抗藥性方面也發(fā)揮了重要作用。

典型的雙組分調(diào)控系統(tǒng)由組氨酸激酶和相關(guān)的應(yīng)答調(diào)控蛋白組成，組氨酸激酶感受外界環(huán)境變化后調(diào)節(jié)應(yīng)答蛋白的磷酸化水平，而后對(duì)一系列應(yīng)答基因進(jìn)行調(diào)控。雙組分調(diào)控系統(tǒng)在銅綠假單胞菌的致病性、毒力、生物膜形成和耐藥性等方面起著重要作用［18］。PmrA-PmrB雙組分調(diào)控系統(tǒng)在革蘭氏陰性菌對(duì)多黏菌素B耐藥過程中起重要作用［19］。本研究發(fā)現(xiàn)耐鱟素銅綠假單胞菌PA-99菌株中雙組分調(diào)控系統(tǒng)有43個(gè)差異表達(dá)基因，包括一些受調(diào)控的抗性基因，如pmrA-pmrB、反應(yīng)調(diào)節(jié)因子PhoP（基因ID：Novel_194）。PhoA編碼的堿性磷酸酶（基因ID：Novel_498，499）和PA-99突變體中的兩個(gè)成分反應(yīng)調(diào)節(jié)因子PhoB；并預(yù)測(cè)到sRNA靶基因中有29個(gè)差異表達(dá)基因，且僅編碼修飾脂多糖PmrB基因的SNP發(fā)生堿基突變。此結(jié)果表明，雙組分調(diào)控系統(tǒng)在銅綠假單胞菌對(duì)鱟素的耐藥中同樣發(fā)揮作用，且sRNA也有可能參與調(diào)節(jié)雙組分系統(tǒng)表達(dá)。

氨酰-tRNA生物合成（aminoacyl-tRNA biosynthesis）的功能是將氨基酸與含有相應(yīng)反密碼子的tRNAs精確匹配。除了在蛋白質(zhì)合成和某些細(xì)菌革蘭氏陽(yáng)性菌肽聚糖交聯(lián)或膜磷脂修飾中發(fā)揮重要作用外，氨酰基-tRNA生物合成還直接參與抗生素生物合成和耐藥性［20］。例如，MprF蛋白通過催化細(xì)胞內(nèi)膜脂的氨基?；瘉碚{(diào)控細(xì)胞壁對(duì)陽(yáng)離子抗菌肽的通透性，從而介導(dǎo)抗菌肽的耐藥性［21］。膜脂的氨?；ㄟ^調(diào)控細(xì)胞膜雙分子層的凈負(fù)電荷，其方式依賴于氨酰化 tRNA底物。在本研究中，氨?；?tRNA生物合成通路在高抗鱟素銅綠假單胞菌PA-99菌株中有14個(gè)差異表達(dá)基因以及預(yù)測(cè)的sRNA靶基因中有10個(gè)差異表達(dá)基因在此通路中，但這些基因無SNP發(fā)生變化。這個(gè)結(jié)果表明銅綠假單胞菌對(duì)鱟素抗藥性也涉及到此通路。

生物膜形成的耐藥機(jī)制在銅綠假單胞菌中起著關(guān)鍵作用。銅綠單胞菌生物膜的形成途徑包括群體感應(yīng)、細(xì)菌分泌系統(tǒng)和化學(xué)感覺系統(tǒng)等。在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中，我們發(fā)現(xiàn)有許多與生物形成相關(guān)的差異表達(dá)基因及部分sRNA靶基因，如鞭毛組裝（ko02040）、細(xì)菌分泌系統(tǒng)（ko03070）和細(xì)菌趨化（ko02030）通路，這些通路涉及基因之前被認(rèn)為與生物膜形成途徑有關(guān)。在前期研究中發(fā)現(xiàn)，PA-99突變體比原始菌株P(guān)A1.2620更容易形成生物膜，胞外多糖含量也高于原始菌株［5］。已有學(xué)者探討了sRNA在某些細(xì)菌的鐵代謝、糖代謝以及氨基酸代謝中所發(fā)揮的調(diào)控作用［22］。針對(duì)鐵代謝，許多細(xì)菌都會(huì)進(jìn)化出自身特殊的鐵調(diào)控系統(tǒng)來限制鐵的攝取。Fur作為一種較為重要的鐵調(diào)控蛋白參與到sRNA對(duì)鐵的調(diào)節(jié)過程中。在本研究中，sRNA的靶基因vreR是與鐵代謝相關(guān)基因，也發(fā)生了SNP堿基突變。葡萄糖、氨基酸等是細(xì)菌的能源物質(zhì)，在細(xì)菌耐藥過程中也是受到了嚴(yán)格的調(diào)控。有研究指出細(xì)菌可以通過sRNA調(diào)節(jié)群體感應(yīng)系統(tǒng)，進(jìn)而調(diào)控毒力產(chǎn)生、抗菌藥物耐藥等過程。但是，相對(duì)于大腸桿菌、沙門氏菌等細(xì)菌，關(guān)于銅綠假單胞菌的sRNA調(diào)控耐藥機(jī)制的相關(guān)報(bào)道相對(duì)來說較少，這其中的機(jī)制尚不清楚。

4 結(jié)論

銅綠假單胞菌對(duì)鱟素的耐藥性導(dǎo)致許多基因發(fā)生差異表達(dá)，且有些差異表達(dá)基因受到sRNA的表達(dá)調(diào)控，并有極個(gè)別相對(duì)低差異表達(dá)基因的SNP發(fā)生堿基突變，這些突變基因主要與膜蛋白修飾、鐵代謝和編碼的假定蛋白等有關(guān)。盡管本研究未涉及這些SNP突變基因的功能驗(yàn)證，但在文獻(xiàn)中已有報(bào)道這些已知基因是與抗藥性相關(guān)，且已選擇5個(gè)代表性差異表達(dá)基因通過熒光定量證實(shí)差異表達(dá)基因的表達(dá)趨勢(shì)與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序表達(dá)量基本一致。