橡膠樹膠孢炭疽菌Zn2Cys6型轉(zhuǎn)錄因子CgAswA的生物學功能

劉沙玉 曹健 李蒙 柳志強 李曉宇

（海南大學生命科學與藥學院，海口 570228）

橡膠樹作為一種重要的熱帶經(jīng)濟作物，該樹產(chǎn)的橡膠具有良好的絕緣性、彈性、可塑性耐磨等特點，因而被廣泛應用于國防、農(nóng)業(yè)、工業(yè)、機械制造和醫(yī)療衛(wèi)生等領域［1］。橡膠炭疽病由膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）引起，是造成橡膠產(chǎn)量下降的主要原因之一。膠孢炭疽菌通常以菌絲體和分生孢子的形式在果實、葉片和枝干等發(fā)病部位進行越冬，條件適宜時，分生孢子可以通過風雨和昆蟲落在寄主組織表面，隨后孢子萌發(fā)形成芽管、附著胞以及侵染釘，使植物發(fā)病，導致橡膠產(chǎn)量下降［2-3］。膠孢炭疽菌的寄主范圍非常廣泛，對不同植物具有多種侵染策略，對該病菌的防治較為困難［4］。因此，了解膠孢炭疽菌相關基因在生長發(fā)育及致病過程中的生物學功能，為深入開展膠孢炭疽菌分子致病機制研究和防治提供重要的理論和實踐基礎。

轉(zhuǎn)錄因子在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中可以特異地識別或結合到靶基因調(diào)控區(qū)的順式作用元件的核心序列上，參與調(diào)控真菌形態(tài)發(fā)育、寡營養(yǎng)環(huán)境適應、脅迫反應和毒素合成等過程，從而調(diào)控病原真菌對寄主的侵染［5-7］。根據(jù)DNA結合域的空間結構特征，轉(zhuǎn)錄因子主要分為4個家族：鋅指（zinc finger）、螺旋-環(huán)-螺旋（helix-loop-helix，HLH）、螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋（helix-turn-helix，HTH）、堿基亮氨酸拉鏈（basic leucine zipper，bZIP）。鋅指蛋白家族根據(jù)其半胱氨酸和組氨酸殘基的數(shù)目和位置將鋅指蛋白分為Cys2His2（C2H2）、Cys4（C4）和Zn2Cys6（C6）三個類群［8］。Zn2Cys6蛋白是真菌中特有的一類轉(zhuǎn)錄因子。目前，Zn2Cys6型轉(zhuǎn)錄因子在稻瘟病菌［7，9］、灰霉菌［10］、構巢曲霉［11］、禾谷鐮刀菌［12］、馬爾尼菲青霉［13］和黃曲霉［14］等真菌中得到鑒定，參與調(diào)控菌絲生長、孢子萌發(fā)、附著胞形成、外界脅迫應答反應、次生代謝產(chǎn)物的形成、色素及毒素的產(chǎn)生和致病性等重要生理過程。然而，目前關于膠孢炭疽菌Zn2Cys6型轉(zhuǎn)錄因子的研究較少。本研究從膠孢炭疽菌中克隆出一個Zn2Cys6型轉(zhuǎn)錄因子，其與黃曲霉中的aswA基因同源，將該轉(zhuǎn)錄因子命名為CgaswA，通過同源重組的方法獲得該基因的敲除突變體，并構建其互補株，通過表型分析確定CgaswA的生物學功能。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗菌株 菌株膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeospo-rioides）野生型菌株由海南大學生命科學與藥學院保存。

1.1.2 試劑 RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、限制性內(nèi)切酶（EcoRⅠ，HindⅢ，XbaⅠ）及 PCR試劑等均購自 TaKaRa 公司；引物合成和測序均由上海生工生物工程股份有限公司完成；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基 MM培養(yǎng)基（g/L）葡萄糖 10.0 g、NaNO31.0 g、MgSO40.5 g、K2HPO41.0 g、FeSO40.01 g、KCl 0.5 g、瓊脂粉 18.0 g。PDA培養(yǎng)基、CM培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基和Czapek培養(yǎng)基的配方均參照文獻［15］。

1.2 方法

1.2.1 CgaswA基因的克隆及序列分析利用 TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit（TaKaRa，中國）提取膠孢炭疽菌總RNA，采用 PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa，中 國）合成 cDNA。以膠孢炭疽菌cDNA為模板，利用引物CgaswAF 和 CgaswAR（表 1）擴 增CgaswA的ORF框，該PCR 產(chǎn)物經(jīng)切膠回收、連接、轉(zhuǎn)化、鑒定后送上海生工測序公司測序。利用 SMART（http：//smart. embl-heidelberg. de/）預測蛋白結構域，從GenBank（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）下載不同真菌CgAswA的同源序列。使用Clustal_W進行序列比對，并利用MEGA7.0軟件采用鄰近相接法（neighbor-joining，NJ）構建系統(tǒng)發(fā)育樹（No.of Bootstrap：1 000；Model/Method：Poisson model；Rates among Sites：Uniform rates；Gaps/Missing Data Treatment：Complete deletion）。利用NovoPro（https：//www.novopro.cn/）預測蛋白質(zhì)核定位信號。

表1 引物名稱及序列Table 1 Primer and sequence

1.2.2 CgaswA基因的敲除和互補 圖1為CgaswA基因敲除原理圖。參照文獻［16］的方法提取膠孢炭疽菌基因組DNA，利用引物CgaswAupF和CgaswAupR，CgaswAdownF和CgaswAdownR（表1）擴增CgaswA基因的上下游序列。將該基因上下游片段回收純化后依次連接到 pCB1532載體，酶切驗證無誤，得到敲除載體pKno-CgaswA。將pKno-CgaswA用EcoRⅠ 酶切線性化后，轉(zhuǎn)入膠孢炭疽菌野生型菌株的原生質(zhì)體中，原生質(zhì)體的制備及轉(zhuǎn)化方法參照文獻［17］。轉(zhuǎn)化子在含有氯嘧磺?。?00 μg/mL）的培養(yǎng)基進行篩選后，提取抗性轉(zhuǎn)化子的基因組，利用3對引物CgaswAF+ CgaswAR、CgaswAUU+PI、CgaswADD+PI1（表1）對 轉(zhuǎn) 化 子 進 行PCR驗證，引物的設計位點如圖1所示：引物CgaswAF+CgaswAR擴增不出目的條帶，而引物CgaswAUU+PI、CgaswADD+PI1 能擴增出目的條帶的轉(zhuǎn)化子為陽性轉(zhuǎn)化子。

圖1 CgaswA基因的同源重組原理Fig. 1 Homologous recombination principle of the gene CgaswA

以膠孢炭疽菌基因組DNA為模板，利用引物CgaswAhbF和CgaswAhbR擴增CgaswA基因的互補片段，將該片段與潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（HPT）的DNA片段（來自質(zhì)粒pCB1003）相連后，連接到pUC18質(zhì)粒上，得到互補載體pComp-CgaswA。將互補載體轉(zhuǎn)化到CgaswA敲除突變體制備的原生質(zhì)體中，轉(zhuǎn)化制備方法如上所述。將轉(zhuǎn)化子在含有潮霉素（300 μg/mL）的平板上篩選。以轉(zhuǎn)化子基因組DNA為模板，以CgaswAF 和CgaswAR為引物，進行PCR驗證，能擴增出CgaswA基因片段的為互補轉(zhuǎn)化子。

1.2.3 突變體表型分析

1.2.3.1 營養(yǎng)生長和脅迫因子敏感性分析 用直徑5 mm的打孔器在活化7 d的野生型菌株、敲除突變株和互補株的菌落邊緣打取菌餅，分別接種到PDA、CM、Czapek和MM固體培養(yǎng)基上，每處理設3個重復，28℃培養(yǎng)7 d，測量菌落的直徑。

將不同菌株的菌餅接種至含有山梨醇（濃度為1.0 mol/L），甘油（濃度為1.0 mol/L），NaCl（濃度為0.8 mol/L），H2O2（濃度為10 mmol/L）以及 0.01%SDS（sodium dodecyl sulfate，十二烷基硫酸鈉）的MM平板上，每處理設3個重復。28℃培養(yǎng)7 d后觀察，計算抑制率。

1.2.3.2 分生孢子產(chǎn)量、萌發(fā)及附著胞的形成 將野生型菌株、敲除突變株和互補株于PDA平板活化7 d后，用打孔器打取菌落邊緣的菌餅接種至PDB培養(yǎng)基中，在28℃，150 r/min下培養(yǎng)2 d后，過濾除菌絲，取濾液7 000 r/min，離心8 min，棄上清，用無菌水洗3次，使用血球計數(shù)板統(tǒng)計分生孢子數(shù)量。將25 μL孢子懸浮液滴在載玻片上，28℃培養(yǎng)4 h、8 h、12 h后，在顯微鏡下觀察，計算孢子萌發(fā)率和附著孢形成率。

1.2.3.3 洋蔥表皮和玻璃紙的穿透試驗 撕取洋蔥內(nèi)表皮細胞，用無菌水洗3次，然后將其平鋪于滅菌的載玻片上。取孢子懸浮液10 μL（濃度為：5×103個/mL）滴于洋蔥表皮，28℃培養(yǎng)8 h和12 h后觀察附著胞的穿透和侵入，每處理設3個重復。

將玻璃紙平鋪在PDA培養(yǎng)基上，取20 μL（濃度為：5×105個/mL）孢子懸浮液和菌餅分別接種于玻璃紙上。28℃培養(yǎng)2 d和3 d，分別揭去玻璃紙，并再培養(yǎng)1 d后觀察，每處理設3個重復。

1.2.3.4 致病性分析 （1）活化7 d的野生型菌株、敲除突變體和互補株PDA平板上打取5 mm膠孢炭疽菌菌餅，以有傷的方式接種到離體橡膠葉片表面，28℃保濕，2 d后將菌餅揭去，4 d后觀察發(fā)病情況，每處理設3個重復。（2）將野生型菌株、敲除突變株和互補株分生孢子懸浮液濃度調(diào)至1×106個/mL，取20 μL孢子懸浮液以有傷的方式接種到離體橡膠葉片表面。28℃保濕，5 d后觀察發(fā)病情況，每個處理設3個重復。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 實驗數(shù)據(jù)采用Excel 2019進行數(shù)據(jù)的運算和處理，采用IBM SPSS Statistics 23.0數(shù)據(jù)處理軟件進行單因素試驗統(tǒng)計分析。

2 結果

2.1 CgaswA基因的克隆及序列分析

通過PCR擴增獲得了CgaswA基因的ORF框，生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，CgaswA基因ORF框全長2 142 bp（GenBank登 錄 號：MW324529），編碼蛋白長度713個氨基酸，含有一個GAL4結構域（GAL4-like Zn（II）2Cys6 binuclear cluster DNAbinding domain）、一 個AT_ hook結 構 域（DNA binding domain with preference for A/T rich regions）和一個真菌特異轉(zhuǎn)錄因子結構域，為Zn2Cys6型鋅指蛋白（圖2-A）。CgaswA在GenBank中利用BLASTp工具進行比對，將其在12種不同真菌中的同源蛋白構建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2-B）。CgAswA蛋白在炭疽菌屬里比較保守，與C. fructicola（KAF4888992.1）和C. siamense（XP_036493040.1）中的同源蛋白的相似度都在99%以上，此外CgAswA與Verticillium longisporum、Stachybotrys chartarum、Fusarium graminearum、Fusarium oxysporum、Valsa mali和Pyricularia oryzae中同源蛋白的相似度較高，均在48%以上，而與Saccharomyces cerevisiae同源蛋白的相似率較低，僅為26%。經(jīng)NovoPro預測，CgAswA蛋白在128-143個氨基酸之間有一段核定位信號序列（KQKRPRGRPRKHPLAP），概率為94.6%。

圖2 CgAswA蛋白結構域和系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 2 Protein domain and phylogenetic tree of CgAswA protein

2.2 CgaswA基因的敲除和互補

對基因敲除載體pKno-CgaswA線性化后，轉(zhuǎn)入野生型原生質(zhì)體中，共得到105個轉(zhuǎn)化子。提取全部轉(zhuǎn)化子基因組，利用CgaswAF+CgaswAR、CgaswAUU+PI、PI1+CgaswADD三對引物（引物的設計位點詳見圖1）進行3輪PCR驗證。結果顯示3號、8號和11號轉(zhuǎn)化子利用引物CgaswAF+CgaswAR無法擴增出CgaswA基因ORF框的目的條帶，且引物CgaswAUU+PI和PI1+CgaswADD能夠擴增出預期大小的目的條帶（圖3-A和B）。最終確定3號、8號和11號轉(zhuǎn)化子為敲除轉(zhuǎn)化子，分別命名為ΔCgaswA-3、ΔCgaswA-8和ΔCgaswA-11（圖3）。

將互補載體pComp-CgaswA轉(zhuǎn)化到已敲除突變株ΔCgaswA-11制得的原生質(zhì)體中，在含有潮霉素的平板上篩選，共獲得32個抗性互補轉(zhuǎn)化子，經(jīng)PCR驗證，發(fā)現(xiàn)16號轉(zhuǎn)化子利用引物CgaswAF+CgaswAR可擴增出CgaswA基因ORF框的目的條帶，確定其為互補株，命名為ΔCgaswA/aswA（圖3-A）。

圖3 CgaswA 基因的敲除和互補驗證Fig. 3 Verification of CgaswA gene knockout and complementation

2.3 突變體表型分析

2.3.1 CgaswA對膠孢炭疽菌營養(yǎng)生長和脅迫因子的影響 野生型菌株、敲除突變體ΔCgaswA和互補株在4種培養(yǎng)基中的生長情況見圖4-A。敲除突變體ΔCgaswA較野生型菌株及互補株生長緩慢，尤其在CZAPEK培養(yǎng)基上，野生型菌株培養(yǎng)7 d的直徑為7.93 cm，而突變體的菌落平均直徑為6 cm，差異顯著（P＜0.05），互補株的生長速率與野生型菌株相似（圖4-B）。

圖4 菌株在4種培養(yǎng)基上生長情況比較Fig. 4 Comparison of strains’ growth on four media

將菌株接至含不同脅迫因子的MM平板上，結果表明，同野生型相比，1.0 mol/L山梨醇，1.0 mol/L甘油，0.8 mol/L NaCl，10 mmol/L H2O2和0.01%SDS對突變體生長的抑制作用并不顯著。以上結果說明CgAswA參與調(diào)控膠孢炭疽菌的營養(yǎng)生長。

2.3.2 CgaswA突變體的分生孢子產(chǎn)量、萌發(fā)及附著胞的形成 與野生型相比，敲除突變株ΔCgaswA產(chǎn)生的分生孢子明顯較少，互補株的分生孢子產(chǎn)量與野生型相似（圖5-A）。野生型菌株的孢子在4 h萌發(fā)率為85.87%，敲除突變體ΔCgaswA在4 h時，孢子的萌發(fā)率僅為32.54%，附著胞的形成率也明顯低于野生型，只有28.84%；隨著時間的延長，12 h時，敲除突變體的孢子萌發(fā)率和附著胞的形成率分別增加到71.94%和69.41%（圖5-B-C）。從整體上來看，敲除突變體ΔCgaswA的孢子萌發(fā)和附著胞的形成較野生型滯后（圖5-D）。由此可見，CgAswA參與調(diào)控膠孢炭疽菌的分生孢子產(chǎn)生、孢子的萌發(fā)和附著胞形成。

圖5 野生型、ΔCgaswA與ΔCgaswA/aswA分生孢子的產(chǎn)生、萌發(fā)和附著胞的形成Fig. 5 Sporulation，germination and appressorium formation of wild type，ΔCgaswA and ΔCgaswA/aswA

2.3.3 洋蔥表皮和玻璃紙穿透試驗 為了了解突變體的附著胞是否能進一步發(fā)育成侵染結構，在洋蔥表皮細胞和玻璃紙上分別進行了穿透試驗。由圖6-A可以看出，野生型菌株在洋蔥表皮細胞上，8 h后附著胞開始分化出侵染結構，12 h后進一步形成明顯的侵染菌絲，敲除突變體ΔCgaswA在8 h僅部分附著胞開始分化出侵染結構，12 h雖然大部分附著胞分化出侵染結構，但該侵染結構明顯小于野生型，互補株基本能恢復到野生型水平。

在玻璃紙穿透試驗中，無論是分生孢子懸液還是菌餅接種，野生型菌株、敲除突變體ΔCgaswA和互補株都能穿透玻璃紙，在2 d形成菌落，但敲除突變體ΔCgaswA形成的菌落比野生型小，互補株與野生型菌株無顯著差異（圖6-B）。以上結果表明，CgAswA參與調(diào)控膠孢炭疽菌的侵入過程。

圖6 洋蔥表皮侵染和玻璃紙穿透試驗Fig. 6 Onion epidermis infection and cellophane penetration assays

2.3.4 致病性分析 將野生型菌株、敲除突變株ΔCgaswA與互補株ΔCgaswA/aswA的菌餅和孢子懸浮液分別接種到有傷的離體橡膠樹葉片上。敲除突變體ΔCgaswA形成的病斑明顯小于野生型，其致病力明顯減弱，互補株ΔCgaswA/aswA基本可以恢復到野生型水平（圖7）。此結果說明CgAswA參與調(diào)控膠孢炭疽菌的致病力。

圖7 野生型、ΔCgaswA與ΔCgaswA/aswA致病性分析Fig. 7 Pathogenicity analyses of wild type，ΔCgaswA and ΔCgaswA/aswA

3 討論

轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控真菌生長發(fā)育及致病過程中起著重要的作用。本研究從膠孢炭疽菌中鑒定了一個Zn2Cys6型轉(zhuǎn)錄因子CgAswA，獲得其敲除突變株ΔCgaswA。ΔCgaswA在Czapek和MM培養(yǎng)基上生長速率明顯低于野生型，孢子產(chǎn)量顯著低于野生型菌株，孢子萌發(fā)和附著胞形成較野生型滯后。在洋蔥表皮和玻璃紙上，突變株孢子形成的侵染結構較野生型延遲，且穿透能力明顯減弱，在橡膠葉片上致病力也減弱。目前關于CgaswA同源基因功能的研究較少，僅在曲霉中有報道。在黃曲霉中，CgaswA的同源基因aswA參與調(diào)節(jié)菌核發(fā)育，同時影響菌核中特異性代謝物的生物合成和積累［14］。在構巢曲霉中，aswA的同源基因是oefC（over-expressed fluffy），該基因過量表達時，形成大量的氣生菌絲，但對于該基因是否參與無性產(chǎn)孢等生理過程，并未有報道［18］。

研究發(fā)現(xiàn)，Zn2Cys6型轉(zhuǎn)錄因子在不同真菌中的功能并不保守，此類轉(zhuǎn)錄因子在進化過程中功能不斷分化，參與調(diào)控不同的生長發(fā)育過程［19］。在禾谷鐮刀菌中，EBR1參與調(diào)控菌絲生長、分生孢子的產(chǎn)生、萌發(fā)和致病性［12］。RosA和NosA是構巢曲霉有性發(fā)育的負調(diào)控因子，過表達RosA導致菌絲生長減少，且RosA可抑制NosA的表達［20-21］。在大麗輪枝菌中，VdFTF1參與調(diào)控細胞壁降解酶相關基因的表達，進而影響其致病性［22］。在稻瘟病菌中，GCC1、GPF1和GTA1參與調(diào)控菌絲生長，其中敲除突變體Δgpf1完全喪失對水稻的致病能力［23］。在梨樹腐爛病菌中，VpPf2不影響該病菌的生長、菌絲形態(tài)和分生孢子形成，但參與調(diào)控細胞壁的完整性與致病性［24］。

在膠孢炭疽菌中，也有一些轉(zhuǎn)錄因子得到研究。bZIP型轉(zhuǎn)錄因子CgAP1參與調(diào)控該菌的氧化應激反應和致病力［25］。C2H2型轉(zhuǎn)錄因子pacC作為一種重要的pH調(diào)節(jié)因子，調(diào)控許多在堿性條件下表達的致病基因［26-27］。C2H2型轉(zhuǎn)錄因子CgAzf1參與調(diào)控黑色素的合成、分生孢子發(fā)育和致病力［28］。SltA和CrzA也是C2H2型轉(zhuǎn)錄因子，其中SltA參與調(diào)控膠孢炭疽菌附著胞的形成及致病性，而CrzA參與調(diào)控生長，分生孢子的產(chǎn)生和萌發(fā)，附著胞的形成和致病性［29］。本文所研究的Zn2Cys6型轉(zhuǎn)錄因子CgAswA參與調(diào)控營養(yǎng)生長、分生孢子發(fā)育和致病力，這將為膠孢炭疽菌中Zn2Cys6型轉(zhuǎn)錄因子的功能研究添加新的內(nèi)容，同時也為深入認識該病原菌致病的分子機理奠定一定的基礎。

4 結論

在膠孢炭疽菌中，CgAswA是一個Zn2Cys6型轉(zhuǎn)錄因子，參與調(diào)控該病原菌的營養(yǎng)生長、分生孢子的產(chǎn)生和萌發(fā)、附著胞的形成、侵入及致病性。