60Co-γ輻射對半夏愈傷組織成苗及植株特性的影響

趙中瑩 李青苗 田孟良 楊小倩 康瑤 邱玉潔 張慶玲 劉帆

（1. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，成都 611130；2. 四川省中醫(yī)藥科學(xué)院中藥資源與種植研究所，成都 610041；3. 石棉縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，雅安 625400）

半夏（Pinellia ternata（Thunb）Brie）為天南星科半夏屬多年生草本植物，該屬植物野生資源豐富，分布廣泛。半夏以塊莖入藥，含生物堿、β-谷甾醇、有機酸等，有燥濕化痰，降逆止嘔，消痞散結(jié)、抗癌等功效，具有很高的藥用價值［1］。半夏通常以珠芽、種子及小塊莖進行繁殖，繁殖系數(shù)低，且此種繁殖方式會引起病毒積累，進而導(dǎo)致半夏塊莖逐漸退化致使藥材質(zhì)量不穩(wěn)定，藥效降低，嚴重影響了半夏種植業(yè)的發(fā)展［2］。因此，利用輻射誘變技術(shù)，確定半夏半致死劑量及獲得優(yōu)良的突變體，為半夏育種提供切實可行的技術(shù)方法及基礎(chǔ)性研究材料。

植物誘變技術(shù)可加快物種遺傳變異，從而在較短時間內(nèi)獲得有利用價值的突變體，為選育新品種、新種質(zhì)及相關(guān)功能基因的研究創(chuàng)造條件［3］。輻射誘變育種具有創(chuàng)造多種突變體，豐富種質(zhì)資源；打破基因連鎖，實現(xiàn)基因重組；保持優(yōu)良特性，改良個別不利性狀；后代穩(wěn)定快，育種年限較短等特點。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，輻射誘變技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于藥用植物上，如紅花、海州常山、白刺花、人參、陽春砂等［4-8］；國內(nèi)外學(xué)者普遍認為組織培養(yǎng)材料繁殖系數(shù)高，敏感性強，突變頻率高，既能降低或避免常規(guī)處理易產(chǎn)生嵌合體的問題，提高突變頻率，又能在人為可控的實驗條件下重復(fù)多次試驗，使誘變效率得到提高，因此將組織培養(yǎng)技術(shù)與輻射誘變技術(shù)相結(jié)合可提高育種效率［9-10］。植物經(jīng)射線照射后，部分植株會表現(xiàn)出不同于未經(jīng)輻射植株的性狀，如葉片增大，增厚、葉色加深，葉形上發(fā)生改變，植株粗壯，變矮，花朵變大等［11］。植物接受輻射處理后生理生化指標會發(fā)生一定的變化，如植株體內(nèi)的光合色素量、蛋白質(zhì)含量、同工酶及過氧化物酶的活性和譜帶等［12］。目前利用60Co-γ射線輻射愈傷組織獲得突變體植株已在藥用植物中有所應(yīng)用，但使用60Co-γ射線輻射半夏愈傷組織的研究還鮮有報道。

由國內(nèi)外的研究現(xiàn)狀可知，輻射育種的材料都以農(nóng)作物和花卉植物為主，有關(guān)藥用植物的輻射生物學(xué)研究相對零散，因此對60Co-γ射線、離子束注入和空間誘變等不同輻射誘變技術(shù)在我國藥用植物育種中的應(yīng)用還需進行進一步的探索［10］。目前，已有人采用適當劑量的微波輻射提高菘藍、射干、龍膽、北柴胡和丹參等種子的萌發(fā)率，縮短萌發(fā)時間，使芽的生長速度得到顯著提高［13-14］。在藥用植物育種研究中，張美萍等［15］利用60Co-γ射線照射西洋參的愈傷組織，獲得高產(chǎn)細胞系。本試驗以半夏葉柄為外植體，獲得愈傷組織，以60Co-γ射線為輻射源，采用不同輻射劑量進行處理，篩選出半夏愈傷組織半致死劑量，旨在探究60Co-γ射線對半夏愈傷組織分化成苗及再生植株生長的影響，在短期內(nèi)獲得優(yōu)良突變體材料。

1 材料與方法

1.1 材料

由四川喜瑪高科農(nóng)業(yè)生物工程有限公司提供，經(jīng)四川農(nóng)業(yè)大學(xué)田孟良教授鑒定為桃葉型半夏的植株。

1.2 方法

1.2.1 半夏愈傷組織誘導(dǎo) 以半夏葉柄為外植體，采用植物組織培養(yǎng)常規(guī)技術(shù)進行外植體的表面滅菌，在無菌條件下將半夏葉柄切為0.5 cm小段，接種于前期試驗篩選出的愈傷組織誘導(dǎo)最適的培養(yǎng)基中，即MS+1.0 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+5.5 g/L瓊脂粉，pH5.8；培養(yǎng)20 d后得到大量質(zhì)地一致的黃綠色愈傷組織用于后續(xù)試驗。培養(yǎng)條件，溫度（22±2）℃，黑暗培養(yǎng)10 d后進行光照培養(yǎng)，光照強度為30-40 μmol·m-2·s-1，光照時數(shù)14 h/d。1.2.260Co-γ射線輻射半夏愈傷組織 本試驗采用單因素試驗設(shè)計，輻射劑量分別為0 Gy、15 Gy、20 Gy、25 Gy、30 Gy，輻射劑量率為1 Gy/min，每處理組10瓶，每瓶5塊質(zhì)地相同的愈傷組織，設(shè)3次重復(fù)。輻射處理于2019年4月21日在四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院輻照中心進行。將不同處理組的愈傷組織進行繼代培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同上。繼續(xù)培養(yǎng)觀察，待愈傷組織分化形成再生植株后，計算不同處理的分化率、成苗率及死亡率，根據(jù)死亡率得出輻射半致死劑量（LD50），即引起50%愈傷組織死亡的輻射劑量。半致死劑量（LD50）的計算方法：本試驗以不同輻射劑量x為自變量，不同劑量下的死亡率y為因變量，利用直線回歸方程y=a+bx和公式LD50=（50-a）/b進行計算。

芽分化率（%）=半夏愈傷組織分化數(shù) /接種的愈傷組織塊數(shù)×100%

成苗率（%）=再生植株數(shù)/接種的愈傷組織塊數(shù)×100%

死亡率（%）=死亡愈傷組織數(shù)/接種的愈傷組織塊數(shù)×100%

1.2.3 突變體篩選 半夏形態(tài)學(xué)考察主要包括半夏葉型、株高、珠芽數(shù)、塊莖等，其中珠芽作為半夏的繁殖器官，塊莖作為其營養(yǎng)器官為重要考察指標［16-17］。當再生植株根長達到3 cm以上時，已完全展葉，分化出珠芽及塊莖等器官，即可進行觀察測定。統(tǒng)計性狀包括：株高、葉型、珠芽著生位置及珠芽數(shù)。對形態(tài)變異的再生植株進行進一步的生理生化測定，包括葉綠素含量（分光光度法）［18］、酯酶（EST）同工酶篩選（聚丙烯酰胺凝膠電泳法）［19］。

塊莖大小：用游標卡尺測量半夏塊莖最大直徑。

突變頻率（%）=篩選出的突變體株數(shù)/再生植株株數(shù)×100%

變異系數(shù)：為標準差與平均值之比；株高：用直尺測量半夏根尖到最長葉端的長度；葉型：按長寬比例及最寬的位置來確定；珠芽數(shù)：記錄整個生育期內(nèi)產(chǎn)生的珠芽數(shù)。

葉綠素含量測定：取半夏新鮮葉片中間葉片1 cm×1 cm進行測定，設(shè)3次重復(fù)，計算其平均值。計算公式：

Chla含量（mg/cm2）=（12.7OD663-2.69OD645）×V/（S×1000）

Chlb含量（mg/cm2）=（22.9OD645-4.68OD663）×V/（S×1000）

Chl總含量（mg/cm2）=（20.2OD645+8.02OD663）×V/（S×1000）

OD：測定波長下的吸光度值；V：葉綠素提取液總體積（mL）；S：材料葉面積（cm2）。

1.2.4 統(tǒng)計分析 采用Excel 2013進行數(shù)據(jù)處理，SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行方差分析及多重比較。

2 結(jié)果

2.1 輻射劑量對半夏愈傷組織分化及成苗的影響

由表1可知，在0-30 Gy隨輻射劑量增加芽分化率逐漸降低，表明輻射對半夏愈傷組織分化具有抑制作用（圖1），當輻射劑量為0 Gy，芽分化率最高，為100%（圖2），其次是輻射劑量為15 Gy，芽分化率為72%，輻射劑量為30 Gy，芽分化率最低，為30%。輻射劑量為15-30 Gy時，與0 Gy處理比較，芽分化率差異顯著。在輻射劑量15 Gy及20 Gy處理下，芽分化率差異顯著。在輻射劑量25 Gy和30 Gy處理下，芽分化率差異不顯著，且芽分化率較低。由此說明，輻射劑量在0-30 Gy范圍內(nèi)，芽分化率與輻射劑量成負相關(guān)，死亡率與輻射劑量成正相關(guān)，且芽分化率與成苗率相同，即分化出芽即可成苗。各處理再生植株生長情況如圖3所示，0 Gy處理愈傷組織分化苗數(shù)最多，隨著輻射劑量的增加，愈傷組織分化苗數(shù)逐漸減少，地上部分長勢隨著輻射劑量的增加逐漸變差。

圖1 芽分化抑制Fig. 1 Inhibition of bud differentiation

圖2 芽正常分化Fig. 2 Buds differentiated normally

圖3 不同輻射劑量處理后再生植株生長情況Fig. 3 Growth of regenerated plants treated with different radiation doses

2.2 60Co-γ輻射半夏愈傷組織半致死劑量的確定

通過對輻照劑量與死亡率進行相關(guān)性與回歸性分析，得到線性方程為y = 2.3981x - 3.566，相關(guān)系數(shù)R2=0.960 8，說明半夏愈傷組織死亡率和輻照劑量存在正相關(guān)關(guān)系。根據(jù)直線回歸方程計算出半致死劑量，即半夏愈傷組織的半致死劑量為LD50為22.34 Gy。

2.3 輻射劑量對半夏愈傷組織再生植株形態(tài)影響

2.3.1 不同輻射劑量對株高的影響 由圖4可知，突變頻率最高為20 Gy處理，為20.0%，15 Gy次之，為16.9%，25 Gy最低，為11.8%；由圖5可知，20 Gy處理株高變異程度最大，25 Gy處理株高變異程度最低。

圖4 不同輻射劑量處理再生植株株高突變頻率Fig. 4 High mutation frequency of regenerated plants treated with different radiation doses

圖5 不同輻射劑量處理再生植株株高變異系數(shù)Fig. 5 Variation coefficient of plant height of regenerated plants treated with different radiation doses

2.3.2 不同輻射劑量對塊莖的影響 由圖6可知，25 Gy處理，塊莖大小突變頻率最高為20.0%，20 Gy處理次之，為11.8%，30 Gy處理中未見塊莖大小變異；塊莖鮮重突變頻率，25 Gy最高為16.8%，其次是15 Gy為13.3%，20 Gy最低為7.8%；由圖7可知，25 Gy及30 Gy處理塊莖鮮重變異程度最大，20 Gy處理塊莖鮮重變異程度最??；25 Gy處理塊莖大小變異程度最大，30 Gy處理塊莖大小變異程度最低。篩選出的變異植株與未經(jīng)輻射處理比較塊莖大小均低于未經(jīng)輻射處理；塊莖鮮重表現(xiàn)為，未經(jīng)輻射處理鮮重均在0.15-0.2 g，15 Gy處理的5株塊莖鮮重在0.1 g以下，8株2.5 g以上，20 Gy處理的2株塊莖鮮重在0.1 g以下，5株2.5 g以上，25 Gy處理的1株塊莖鮮重在0.1 g以下，9株2.5 g以上，30 Gy處理的1株塊莖鮮重在0.1 g以下，4株2.5 g以上。

圖6 不同輻射劑量處理再生植株塊莖大小及鮮重突變頻率Fig. 6 Tuber size and fresh weight mutation frequency of regenerated plants treated with different radiation doses

圖7 不同輻射劑量處理再生植株塊莖大小及鮮重變異系數(shù)Fig. 7 Variation coefficient of tuber size and fresh weight of regenerated plants treated with different radiation doses

2.3.3 不同輻射劑量對葉的影響 由圖8可知，葉型突變頻率最高為30 Gy處理，為15.5%，其次是25 Gy處理，為15.2%，最低為15 Gy處理，為8.2%，未經(jīng)輻射處理葉型為卵形，葉端急尖（圖9-a），葉型變異有闊卵形（圖9-b）、披針形（圖9-c）、闊橢圓形（圖9-d）、闊卵形，裂葉大小不一致（圖9-e）、闊卵形，葉端驟尖（圖9-f）。

圖8 不同輻射劑量處理再生植株葉型重突變頻率Fig. 8 Leaf type mutation frequency of regenerated plants treated with different radiation doses

圖9 輻照處理后代葉型變異情況Fig. 9 Variation of progeny leaf shape after irradiation

2.3.4 不同輻射劑量對珠芽的影響 由圖10可知，突變頻率最高為25 Gy及30 Gy處理，為8.6%，15 Gy與20 Gy處理為2.2%；未經(jīng)輻射處理半夏株芽位于葉柄中部，且只有一個珠芽（圖11-a），15 Gy、30 Gy處理變異植株珠芽位于葉片基部（圖11-b），20 Gy處理1株變異植株珠芽位于葉片基部（圖11-b），1株變異植株的為雙珠芽（圖11-c），25 Gy處理中1株變異植株珠芽位于葉片基部（圖11-b），1株變異植株為雙珠芽（圖11-c）。

圖10 不同輻射劑量處理再生植株珠芽突變頻率Fig. 10 Bead mutation frequency of regenerated plants treated with different radiation doses

圖11 輻照處理后珠芽變異情況Fig. 11 Variation of bead buds after irradiation

2.4 輻射劑量對半夏再生植株葉綠素含量的影響

葉綠素含量變異程度由圖12可知，30 Gy處理變異程度最大，其次是15 Gy處理，25 Gy處理的變異程度最低，由表2可知，變異頻率最高為25 Gy處理，變異頻率為14.3%，篩選出變異植株9株，其次是30 Gy處理，變異頻率為12.2%，篩選出變異植株6株，20 Gy處理變異頻率最低為8.6%，篩選出變異植株8株，且4組處理間均差異不顯著。

圖12 不同輻射劑量處理葉綠素變異系數(shù)Fig. 12 Chlorophyll variation coefficient under different radiation doses

表2 不同輻射劑量處理葉綠素含量變化篩選結(jié)果Table 2 Screening results of chlorophyll content under different radiation doses

2.5 輻射劑量對半夏愈傷組織再生植株EST同工酶的影響

由表3及圖13可知，經(jīng)EST同工酶篩選出的變異植株與未經(jīng)輻射處理的EST同工酶酶譜在遷移率、酶帶數(shù)和酶帶強弱差異顯著。圖上共顯示出18條酶帶，酶帶的Rf值在0.09-0.95之間，篩選出的突變體材料在Rf值=0.09及Rf值=0.86處均與未經(jīng)輻射處理有相同酶帶。由于遷移率的差異，整個酶譜從負極到正極可劃分為3個區(qū)域，即A區(qū)、B區(qū)和C區(qū)，A區(qū)Rf值=0.09，B 區(qū)Rf值在0.38-0.60，C區(qū)Rf值在0.81-0.95。A區(qū)有4條酶帶，B區(qū)有9條酶帶，C區(qū)有5條酶帶。25 Gy與30 Gy處理酶條帶數(shù)目最多，說明遺傳性最為豐富。由表4可知，變異頻率最高為30 Gy，變異頻率為8.6%，篩選出變異植株4株，其次是25 Gy處理，變異頻率為7.9%，篩選出變異植株5株，15 Gy、20 Gy處理變異頻率最低，均為2.2%，各篩選出變異植株2株；經(jīng)酯酶同工酶測定后共獲得13株變異半夏植株（表5）。

表4 不同輻射處理EST同工酶篩選結(jié)果Table 4 Screening results of EST isozymes under different radiation treatments

表5 對照處理與突變植株各變異性狀測定結(jié)果Table 5 Results of different characters of mutant plants were compared with those of treatment

圖13 EST同工酶圖譜Fig. 13 EST isozyme map

表3 變異植株EST同工酶酶帶數(shù)及遷移率結(jié)果Table 3 EST isozyme band number and migration rate of mutant plants

3 討論

目前我國半夏品種選育還處于傳統(tǒng)的常規(guī)育種技術(shù)，遠遠落后于農(nóng)作物和園藝植物，隨著半夏中藥材產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，半夏生產(chǎn)基地由于缺乏優(yōu)良品種而限制了其品質(zhì)和產(chǎn)量的提高，輻射誘變技術(shù)可為半夏的品種改良和種質(zhì)資源的創(chuàng)造開辟新的途徑。

前人研究表明在一定劑量范圍內(nèi)，60Co-γ射線對愈傷組織分化的抑制作用顯著，且隨著輻射劑量的增加抑制作用逐步加強，如楊麗等［20］利用660Co-γ射線照射白三葉愈傷組織、尚偉等［21］利用60Co-γ射線照射紅掌愈傷組織的研究結(jié)果均表現(xiàn)為愈傷組織分化率與輻射劑量成負相關(guān)，與本研究結(jié)果相同。

大量研究表明適宜的輻照劑量對生物體系的誘變效應(yīng)至關(guān)重要，60Co-γ輻射劑量過高就會造成較高的死亡率，使輻射植株失去篩選機會；劑量不足又無法誘導(dǎo)顯著變異，獲得好的誘變效果［22-23］。由芽分化率結(jié)果表明，半夏愈傷組織的半致死劑量在20-30 Gy，與彭文君等［24］對同科植物紅掌愈傷組織60Co-γ輻射得出紅掌愈傷組織半致死劑量范圍在20-30 Gy的研究結(jié)果一致，通過直線回歸方程計算得到型半夏愈傷組織半致死劑量為22.34 Gy。

本試驗中經(jīng)輻射后的半夏愈傷組織部分能夠繼續(xù)分化，但分化率受輻射影響顯著，且分化時間與0 Gy處理的愈傷組織相比，時間更長，同時會抑制葉片的分化與生根。輻射后的損傷效應(yīng)潛伏期較長，隨著植株生長，射線對植株的損傷才逐漸表現(xiàn)出來［25］。經(jīng)輻射后獲得的部分再生植株，形態(tài)上發(fā)生不定向變異，植株變矮、葉型、塊莖、珠芽數(shù)目及其著生位置均發(fā)生變異，這些現(xiàn)象都符合60Co-γ射線對植物生長的誘變效應(yīng)，與曾文丹［26］輻射木薯，突變植株主要變現(xiàn)在葉形變異或株型變異的研究結(jié)果基本一致，且在25 Gy輻射處理下有8株再生植株塊莖鮮重增加，在15 Gy及20 Gy處理下各獲得一株雙珠芽再生植株，可進行后續(xù)栽培，以期獲得性狀穩(wěn)定的變異植株。試驗中發(fā)現(xiàn)，部分再生植株的葉綠素含量有所增加，此結(jié)果與范菁［27］、李瑜等［28］的研究的結(jié)論不一致，可能是因輻射誘變導(dǎo)致半夏再生植株的葉綠素生物合成增強，具體的作用機理有待進一步研究。但葉綠素含量的增高，有利于半夏干物質(zhì)的積累。由半夏EST同工酶酶譜可以看出，變異植株與未經(jīng)輻射處理比較差異顯著，具體表現(xiàn)為遷移率、酶帶數(shù)和酶帶強弱差異顯著，呈現(xiàn)出豐富的多態(tài)性，這與劉波等［29］的研究結(jié)果相似，有利于新品系的篩選。

4 結(jié)論

本研究共獲得變異植株13株，在25 Gy下突變頻率最高，獲得變異植株5株，該輻射劑量與半致死劑量接近，為最佳輻射劑量，該研究結(jié)果可為后續(xù)的半夏育種材料的獲得提供試驗依據(jù)。