煙草單萜合酶基因NtTPS2的克隆及功能鑒定

劉少華 趙希勝，2 楊晴 楊長青 潘旭浩 張建會(huì) 楊愛國 李依婷

（1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，青島 266100；2. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，成都 611130；3. 四川省煙草科學(xué)研究所，成都 610041）

在植物體內(nèi)，萜類物質(zhì)主要通過兩條相對(duì)獨(dú)立的代謝途徑合成，即位于細(xì)胞質(zhì)中的甲羥戊酸（mevalonate pathway，MVA）途徑和位于質(zhì)體中的甲基赤蘚醇4-磷酸（methylerythritol-4-phosphate pathway，MEP）途徑。萜烯合酶（terpene synthase，TPS）是催化形成萜類骨架的關(guān)鍵酶［7］。根據(jù)催化機(jī)理和形成產(chǎn)物的不同，萜烯合酶被分為Ⅰ類（ClassⅠ）和Ⅱ類（ClassⅡ）［8-9］。其中單萜合酶屬于Ⅰ類萜類合酶，包含保守的DDxxD和NSE/DTE結(jié)構(gòu)域，其中的氨基酸殘基通過結(jié)合二價(jià)金屬離子來促進(jìn)異戊二烯焦磷酸基團(tuán)的電離［10-11］。擬南芥中有多個(gè)萜類合酶參與單萜和倍半萜類化合物的生物合成［12-14］，其產(chǎn)物對(duì)吸引昆蟲授粉及在植物抵御病原體的入侵中有重要作用［15］。葡萄中已有多個(gè)單萜合酶和倍半萜合酶被克隆和功能鑒定，其中包括α-松油醇合成酶，對(duì)葡萄繁殖和品種改良具有重要意義［16］。除此之外，萜烯合酶還參與植物對(duì)各種生物脅迫和非生物脅迫的響應(yīng)，如龐強(qiáng)強(qiáng)等［17］對(duì)大白菜高溫脅迫前后不同組織和持續(xù)高溫脅迫下葉片的表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)大部分BrTPS可對(duì)高溫脅迫產(chǎn)生響應(yīng)；水稻松油烯合酶OsTPS24參與水稻茉莉酸誘導(dǎo)引發(fā)對(duì)白葉枯病菌的抗性［18］；OsTPS18參與合成的橙花叔醇可明顯抑制白葉枯病菌的生長［19］等。

茄科植物煙草的次生代謝產(chǎn)物豐富，遺傳轉(zhuǎn)化和表達(dá)體系完善，是研究植物次生代謝的理想植物。目前，煙草萜類物質(zhì)生物合成途徑上游MVA和MEP途徑中的關(guān)鍵合成酶基因已被相繼報(bào)道，如1-脫氧木糖-5-磷酸合酶（1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase，DXS）、3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶（3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A reductase，HMGR）、牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合酶（geranylgeranyl pyrophosphatesynthase，GGPPS）、法尼基焦磷酸合酶（farnesyl diphosphate synthase，F(xiàn)PPS）等，但是對(duì)合成途徑下游的關(guān)鍵萜烯合酶基因的研究鮮有報(bào)道。在普通栽培煙草中，共有68個(gè)TPS基因家族成員［20］，但目前已鑒定并明確功能的寥寥無幾。對(duì)煙草萜烯合酶基因的分離鑒定不僅可以完善煙草萜類物質(zhì)生物合成途徑，還能夠?yàn)楫愒春铣蔁煵葺祁愄烊划a(chǎn)物提供基礎(chǔ)元件。

本研究從煙草中克隆了一個(gè)定位在質(zhì)體中的萜烯合酶基因NtTPS2，利用qRT-PCR分析其時(shí)空表達(dá)模式和對(duì)逆境脅迫的響應(yīng)，并通過大腸桿菌代謝工程鑒定NtTPS2的生化功能，為煙草萜類天然產(chǎn)物的生物合成機(jī)理研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)所用材料普通栽培煙草品種K326（Nicotiana tabacum L.）由國家煙草種質(zhì)資源中期庫提供。載體質(zhì)粒pYJM26與pYJM14由中國科學(xué)院青島生物能源與過程研究所饋贈(zèng)；Plant Total RNA Kit購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司；Transcript Green One-Step qRT-PCR Supermix、2×Phanta Max Master Mix和2×ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix購自南京諾唯贊生物科技股份有 限 公 司；pEASY-Blunt Zero Cloning kit、DH5α Chemically Competent Cell、BL21（DE3）Chemically Competent Cell、EasyPure Quick Gel Extraction kit、DNA凝膠試劑盒，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；試驗(yàn)所用內(nèi)切酶與連接酶均購自NEB（北京）有限公司。

LB培養(yǎng)基（g/L）：10.0 g蛋白胨、5.0 g酵母粉、10.0 g NaCl，pH 7.0，用于大腸桿菌的培養(yǎng)。

發(fā) 酵 培 養(yǎng) 基（g/L）：5.0 g酵 母 浸 粉，1.0 g NH4Cl、15.2 g Na2HPO4·12H2O、3.0 g KH2PO4、0.5 g NaCl、0.48 g MgSO4·7H2O、20 g 葡萄糖，用于大腸桿菌的發(fā)酵。

1.2 方法

1.2.1 NtTPS2的克隆及序列分析 萜烯合酶在植物抗逆境脅迫過程中發(fā)揮著重要作用。通過對(duì)干旱和低溫脅迫處理的煙草轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)的分析篩選，獲得NtTPS2轉(zhuǎn)錄本序列并設(shè)計(jì)特異性引物NtTPS2-F和NtTPS2-R（表1）。使 用Plant Total RNA Kit提取煙草葉片總RNA，用超微量分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度和純度，利用Transcript Green One-Step qRT-PCR Supermix試劑盒反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA作為基因克隆的模板。使用引物NtTPS2-F和NtTPS2-R，以煙草cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為cDNA 2 μL、2×Phanta Max Master Mix 25 μL、NtTPS2-F和NtTPS2-R引 物 各2.5 μL，補(bǔ)充ddH2O 18 μL。反應(yīng)程序?yàn)?4℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，35個(gè) 循 環(huán)；72℃ 5 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)、純化后，連入pEASY-Blunt Zero Cloning kit載體，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化子用含有卡那霉素（50 mg/L）的LB固體培養(yǎng)基進(jìn)行篩選培養(yǎng)12 h，挑取單克隆進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證，陽性克隆進(jìn)行雙向測(cè)序，獲得含有NtTPS2序列的陽性質(zhì)粒Blunt-NtTPS2。

對(duì)照組患者單獨(dú)采用胺碘酮進(jìn)行治療，首次劑量為150 mg，溶于20 mL0.9%氯化鈉溶液中，10 min內(nèi)靜脈滴注完成，間隔15 min后可重復(fù)用藥。根據(jù)患者病情變化，可適當(dāng)減少給藥劑量。靜脈給藥停止后，改口服胺碘酮，每天600 mg，聯(lián)用7d后，改藥量為每天400 mg，同樣服藥7 d；觀察組患者在此基礎(chǔ)上，聯(lián)合服用倍他樂克緩釋片，口服，每次11.875 mg，每天服藥1次，觀察無明顯不良反應(yīng)后，則每2周增加藥量，達(dá)到目標(biāo)劑量后可長期口服。

利 用ORF finder（http：//www.bioinformatics.org/sms2/orf_find.html）軟件分析NtTPS2開放閱讀框及氨基酸序列；利用在線程序PSORT II Prediction（https：//www.genscript.com/psort.html）預(yù) 測(cè)NtTPS2蛋白的亞細(xì)胞定位；使用InterProScan（https：//www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence/）軟件對(duì)NtTPS2蛋白保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)，利用MEGA7軟件鄰接（NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，Bootstrap值設(shè)定為1 000。1.2.2 NtTPS2的組織與時(shí)空表達(dá)模式 分別提取盛花期煙草根、莖、上部葉、中部葉、下部葉、花瓣、雄蕊和雌蕊的總RNA，反轉(zhuǎn)錄后，進(jìn)行qRT-PCR分析。根據(jù)NtTPS2序列設(shè)計(jì)特異性引物NtTPS2-qF和NtTPS2-qR（表1），以煙草Actin為內(nèi)參，利用2×ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix進(jìn)行PCR反應(yīng)。試驗(yàn)設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)，2次技術(shù)重復(fù)。采用2-△△CT方法計(jì)算NtTPS2的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3 不同非生物脅迫處理下NtTPS2的表達(dá)分析 將K326種子用75%酒精消毒20-30 s，滅菌ddH2O清洗1遍，用15%過氧化氫溶液浸泡8-10 min，滅菌ddH2O清洗3遍后，播種于1/2 MS固體培養(yǎng)基中。在光照培養(yǎng)箱（16 h光照/8 h黑暗）中培養(yǎng)至兩葉一心，移至1/2 MS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)4周后，分別移入200 mmol/L NaCl、1.0% PEG、4℃、10 μmol/L ABA進(jìn)行處理。其中，NaCl處理分別在0、1、3、6、12和24 h取樣；4℃處理分別在0、3、6和12 h以及1、3和7 d取樣；PEG和ABA處理分別在為0、6、12、24、48和72 h取樣，每個(gè)處理3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。每個(gè)樣品取樣完成后液氮速凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 NtTPS2的亞細(xì)胞定位 根據(jù)NtTPS2的全長CDS序列（去掉終止密碼子）設(shè)計(jì)帶有Bsa I酶切位點(diǎn)的引物NtTPS2∷gfp-F和NtTPS2∷gfp-R（表1），以Blunt-NtTPS2為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增、回收。利用Bsa I對(duì)pBWA（V）HS-GLosgfp表達(dá)載體和NtTPS2回收片段進(jìn)行酶切，用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，單克隆經(jīng)PCR及測(cè)序驗(yàn)證，獲得NtTPS2融合GFP的重組質(zhì)粒pBWA（V）HS-TPS2-GLosgfp。將重組質(zhì)粒和對(duì)照空載質(zhì)粒pBWA（V）HS-Glosgfp分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101。陽性農(nóng)桿菌菌株經(jīng)活化和擴(kuò)大培養(yǎng)后，收集菌體重懸于煙草注射緩沖液（0.2 mmol/L乙酰丁香酮、10 mmol/L MES和10 mmol/L MgCl2）中，調(diào)整OD600值為0.7-1.0。重懸液于室溫靜置2-4 h后，用1 mL注射器在本氏煙（Nicotiana bentamiana）中部葉片背面注射。注射后的煙草置于28℃溫室中培養(yǎng)2 d后，在LEICA TCS SP8激光共聚焦顯微鏡下觀察侵染的葉片，確定熒光融合蛋白的定位。

表1 NtTPS2基因克隆、載體構(gòu)建及qPCR引物Table 1 Primers for NtTPS2 gene cloning，vector construction and qPCR

1.2.5 NtTPS2工程大腸桿菌構(gòu)建和發(fā)酵 將NtTPS2連接到pYJM26質(zhì)粒的BglII和XhoI雙酶切位點(diǎn)之間，得到重組質(zhì)粒NtTPS2-pYJM26。pYJM26質(zhì)粒，即pACY-mvaE-mvaS-GPPS2質(zhì)粒，攜帶來源于糞腸球菌（Enterococcus faecalis）的乙酰輔酶A?；D(zhuǎn)移酶基因/羥甲基戊二酰輔酶A還原酶基因（mvaE，GenBank No. AAG02438）、3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合酶基因（mvaS，GenBank No. AAG02439），以及來源于北美冷杉（Abies grandis）的牻牛兒基焦磷酸合成酶基因（GPPS2，GenBank No. AF513112.1）的pACYCDuet-1。參 考Yang等［21］的 方 法 構(gòu) 建pYJM26質(zhì)粒載體。以含有NtTPS2 CDS序列的Blunt-NtTPS2質(zhì)粒為模板，采用NtTPS2-pYJM26-F和NtTPS2-pYJM26-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增和基因片段回收。將所得NtTPS2片段與pYJM26質(zhì)粒分別用Bgl II和Xho I進(jìn)行雙酶切，將載體與外源片段進(jìn)行連接，得到重組質(zhì)粒NtTPS2-pYJM26。

將質(zhì)粒NtTPS2-pYJM26和質(zhì)粒pYJM14共同轉(zhuǎn)化E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，37℃過夜培養(yǎng)后，得到合成香葉醇的大腸桿菌工程菌。pYJM14質(zhì)粒，即pTrc-low質(zhì)粒，攜帶來源于釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的甲羥戊酸激酶基因（ERG12，GenBank No. NM_001182715.1）、甲羥戊酸-5-磷酸激酶基因（ERG8，GenBank NO. NM_001182727.1）、甲羥戊酸-5-二磷酸脫羧酶基因（ERG19，GenBank NO. X97557.1）、異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶基因（IDI1，GenBank NO. NM_001183931.1）的pTrcHis2B。參考Yang等［22］的方法構(gòu)建pYJM14質(zhì)粒載體。

挑取平板上的單克隆接種于LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)8 h后，將一級(jí)種子液按1∶50接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至OD600為0.6時(shí)添加終濃度為0.3 mmol/L的IPTG，30℃誘導(dǎo)表達(dá)繼續(xù)發(fā)酵48 h。

1.2.6 分析檢測(cè) 取發(fā)酵液2 mL，12 000 r/min離心1 min，取上清1 mL加入等體積乙酸乙酯于渦旋振蕩器上混勻5 min，然后靜置10 min，取上層有機(jī)相進(jìn)行過濾后，使用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS，島津TQ8050）檢測(cè)發(fā)酵產(chǎn)物中天然成分的含量。色譜柱為HP-INNOWAX毛細(xì)管柱（30 m × 0.25 mm× 0.25 μm），柱室溫度50℃起步以10℃/min的速度升溫至250℃，保溫5 min，氣化室和檢測(cè)室溫度均為250℃。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，由新復(fù)極差法分析均值差異的顯著性。

2 結(jié)果

2.1 NtTPS2的克隆及生物信息學(xué)分析

以煙草葉片總RNA反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，利用NtTPS2-F和NtTPS2-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得全長為1 854 bp片段，命名為NtTPS2（圖1）。NtTPS2編碼617個(gè)氨基酸，其中強(qiáng)酸性氨基酸81個(gè)，堿性氨基酸75個(gè)，pI為6.35，蛋白分子量為71.73 kD。利用InterProScan在線軟件對(duì)其氨基酸序列進(jìn)行分析，結(jié)果表明，NtTPS2具有2個(gè)萜烯合成酶基因家族的保守結(jié)構(gòu)域。其中第68-255位氨基酸為萜類合酶N末端區(qū)域；第282-606為萜類合酶金屬離子結(jié)合結(jié)構(gòu)域（圖2）。

圖1 NtTPS2的PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR amplification of NtTPS2

圖2 NtTPS2蛋白的保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)Fig.2 Prediction of the conserved domain of NtTPS2 protein

通過在線程序PSORT II Prediction對(duì)NtTPS2蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示NtTPS2在葉綠體、線粒體和質(zhì)體中定位的概率分別為57.14%、28.57%和14.29%，因此，該蛋白可能是位于葉綠體中。

利用GenBank數(shù)據(jù)庫蛋白比對(duì)程序BLASTP對(duì)NtTPS2進(jìn)行比對(duì)分析，選擇與NtTPS2相似度高的萜烯合酶基因，利用DNAMAN軟件進(jìn)行多序列比對(duì)分析，結(jié)果（圖3）表明，NtTPS2與已知的萜烯合酶基因蛋白序列具有較高的相似性，且含有萜類合酶催化活性位點(diǎn)“DDxxD”以及NSE/DTE功能域（N，D）D（L，I，V）X（S，T）XXXE。

圖3 NtTPS2與其他植物萜烯合酶基因的多序列比對(duì)Fig.3 Multiple sequence alignment of NtTPS2 and other plant terpene synthase genes

為分析NtTPS2與其他物種萜烯合酶基因間親緣關(guān)系，通過MEGA7等軟件對(duì)NtTPS2進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析。結(jié)果（圖4）表明，NtTPS2與矮牽牛、檸檬及柑橘等物種中的單萜合酶基因聚為同一簇，其中與矮牽牛的親緣關(guān)系最近，同源性為69.57%，與倍半萜和二萜合酶基因的遺傳距離較遠(yuǎn)，推測(cè)其可能為一個(gè)單萜合成酶。

圖4 NtTPS2與其他物種萜烯合酶系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析Fig.4 Phylogenetic tree analysis of NtTPS2 and terpene synthase of other species

2.2 NtTPS2亞細(xì)胞定位

基因的亞細(xì)胞定位對(duì)研究該基因編碼的蛋白及行使功能的場所至關(guān)重要。將含有NtTPS2融合GFP的植物表達(dá)載體和僅表達(dá)GFP的對(duì)照載體分別在本式煙葉片中瞬時(shí)表達(dá)，通過激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)NtTPS2編碼的蛋白產(chǎn)物定位在葉綠體中（圖5），這一結(jié)果與NtTPS2蛋白的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果一致。

圖5 NtTPS2的亞細(xì)胞定位Fig.5 Subcellular localization of NtTPS2

2.3 NtTPS2的組織表達(dá)分析

利用qRT-PCR技術(shù)分析NtTPS2在煙草盛花期各個(gè)組織中的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果表明，NtTPS2在煙草各個(gè)組織部位均有表達(dá)，在根部和雌蕊中的表達(dá)量顯著高于莖、葉、花瓣和雄蕊（圖6）。

圖6 NtTPS2的組織表達(dá)模式分析Fig.6 Tissue expression pattern analysis of NtTPS2

2.4 NtTPS2對(duì)逆境脅迫的響應(yīng)

萜類化合物在植物抗逆脅迫中發(fā)揮著重要的作用。為明確NtTPS2是否參與了煙草抗逆脅迫過程，對(duì)普通煙草K326進(jìn)行了不同逆境脅迫處理，通過qRT-PCR技術(shù)對(duì)NtTPS2的表達(dá)模式進(jìn)行分析（圖7），發(fā)現(xiàn)在200 mmol/L NaCl處理下，NtTPS2表達(dá)量在6 h內(nèi)迅速上調(diào)，隨后降低，但12 h時(shí)表達(dá)量仍顯著高于對(duì)照（0 h）；4℃低溫處理下，NtTPS2表達(dá)量在6和12 h被快速誘導(dǎo)，隨后急劇下降，7 d后已顯著低于對(duì)照（0 h）；10 μmol/L ABA處理下，NtTPS2表達(dá)量在6 h內(nèi)逐漸下調(diào)，隨后表達(dá)豐度上升，整個(gè)處理過程中表達(dá)量始終顯著低于對(duì)照；用1% PEG模擬干旱脅迫，NtTPS2表達(dá)量在48 h內(nèi)逐漸上調(diào)，48 h時(shí)出現(xiàn)峰值，隨后下調(diào)，到72 h時(shí)表達(dá)豐度與對(duì)照相比沒有顯著性差異。

圖7 不同逆境脅迫下NtTPS2的表達(dá)模式分析Fig.7 Expression analysis of NtTPS2 under different stresses

2.5 NtTPS2的生化功能鑒定

以大腸桿菌BL21（DE3）為宿主菌，通過代謝產(chǎn)物分析，鑒定NtTPS2的生化功能。工程菌株經(jīng)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)后，用等體積乙酸乙酯萃取、離心，取上層有機(jī)相過濾后用GC-MS檢測(cè)發(fā)酵產(chǎn)物。對(duì)GC-MS總離子色譜圖的分析結(jié)果表明，與對(duì)照菌株相比，表達(dá)了NtTPS2的工程菌株在5.5和5.8 min產(chǎn)生了2種新化合物，譜庫檢索表明可能是香葉醇和橙花醇。進(jìn)一步利用香葉醇、橙花醇的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比對(duì)，二者的保留時(shí)間和質(zhì)譜數(shù)據(jù)均一致，表明NtTPS2能夠以GPP為底物生成香葉醇和橙花醇（圖8）。

3 討論

植物單萜合酶催化底物GPP釋放焦磷酸基團(tuán)，并形成結(jié)構(gòu)不同的單萜類化合物。本研究從煙草中克隆獲得了一個(gè)萜烯合酶基因NtTPS2，其包含一個(gè)完整的ORF，長度為1 854 bp，編碼617個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。序列分析表明，NtTPS2與其他植物的萜類合酶蛋白具有較高的保守性，都含有保守的DDxxD和NSE/DTE結(jié)構(gòu)域，該區(qū)域能與金屬離子結(jié)合，催化萜類化合物的生物合成，屬于典型的I類萜烯合酶［23］。對(duì)NtTPS2亞細(xì)胞定位的預(yù)測(cè)和試驗(yàn)均表明，NtTPS2定位于葉綠體中，與大部分單萜合酶的亞細(xì)胞定位相一致。進(jìn)化分析結(jié)果顯示NtTPS2與單萜合酶聚為一類，推測(cè)其可能參與煙草中單萜類化合物的生物合成。通過以大腸桿菌為底盤的微生物代謝工程對(duì)NtTPS2生化功能的鑒定，進(jìn)一步證實(shí)了NtTPS2是一個(gè)單萜合酶，能夠以GPP為底物合成單萜類化合物香葉醇及其異構(gòu)體橙花醇，是一個(gè)香葉醇合成酶（geraniol synthase，GES）。目前編碼GES的基因已在多個(gè)物種中被分離和鑒定，如長春花、羅勒、紫蘇、藿香和甜舌草等。但是不同GES基因的表達(dá)模式和酶活性卻不盡相同，暗示GES基因在不同物種間的生物學(xué)功能存在特異性。

已有的研究表明，萜類化合物在植物抵御逆境脅迫、吸引昆蟲授粉和趨避害蟲等過程中發(fā)揮著重要作用。如大豆TPS家族基因可能參與花與根的生長發(fā)育［24］；過表達(dá)水稻TPS1基因能提高水稻對(duì)干旱、高鹽及低溫等逆境的脅迫［25］；冬小麥TPS基因參與其低溫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程等［26］。對(duì)NtTPS2表達(dá)模式的分析發(fā)現(xiàn)，NtTPS2的表達(dá)具有一定的組織特異性，在根部和雌蕊中的表達(dá)量相對(duì)較高，且強(qiáng)烈響應(yīng)低溫、干旱和高鹽等逆境脅迫和ABA信號(hào)，暗示著其可能負(fù)責(zé)煙草根部和雌蕊中香葉醇和橙花醇類揮發(fā)性單萜物質(zhì)的生物合成，在煙草抵御非生物逆境脅迫和授粉生殖等生理過程中發(fā)揮著重要作用。

近年來，人們對(duì)萜類代謝途徑及其調(diào)控機(jī)理研究的不斷深入，使得代謝工程成為研究萜類合酶基因及萜類化合物生物合成的有效手段［27］。王詩語等［28］以大腸桿菌為底盤細(xì)胞，利用合成生物學(xué)手段導(dǎo)入外源雜合蒎烯合成途徑，構(gòu)建了合成蒎烯的微生物工程菌株；袁雪峰等［29］研究表明，通過構(gòu)建蝦青素合成相關(guān)基因工程菌的發(fā)酵試驗(yàn)，明確了蝦青素的生物合成路徑，并進(jìn)一步提高了蝦青素的產(chǎn)量和純度；李瑜等［30］利用發(fā)酵罐高密度培養(yǎng)番茄紅素生物合成工程菌，并通過優(yōu)化培養(yǎng)條件及工藝，獲得產(chǎn)量大幅提高的番茄紅素。本研究通過在大腸桿菌中優(yōu)化萜類物質(zhì)生物合成途徑，并表達(dá)煙草單萜合成酶基因NtTPS2，利用基因工程手段構(gòu)建了以葡萄糖為原料合成香葉醇和橙花醇的工程菌株代謝途徑，為進(jìn)一步研究煙草單萜類化合物的生物合成提供理論依據(jù)和基礎(chǔ)元件。

4 結(jié)論

煙草NtTPS2是一個(gè)單萜合成酶基因，包含1 854 bp的ORF，編碼617個(gè)氨基酸。該蛋白具有萜烯合酶典型的保守結(jié)構(gòu)域及催化活性功能域。NtTPS2定位于葉綠體中，具有組織表達(dá)特異性，受非生物脅迫和植物激素ABA信號(hào)誘導(dǎo)。NtTPS2能夠以GPP為底物催化合成香葉醇和橙花醇。