向日葵HaACO1基因的表達(dá)分析及功能驗(yàn)證

孫瑞芬 張艷芳 牛素清 郭樹春 李素萍 于海峰 聶惠 牟英男

（1. 內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，呼和浩特 010031；2. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院，呼和浩特 010011）

生物和非生物脅迫是影響植物生長發(fā)育和作物產(chǎn)量的重要因素，抗性相關(guān)基因的克隆和功能鑒定對采用基因工程手段改良作物抗性非常重要。乙烯（ethylene）是一種植物激素，在植物生長發(fā)育、成熟衰老整個生命活動及鹽害、冷害、機(jī)械傷害、漬水等逆境脅迫和病原菌入侵中發(fā)揮著重要的作用［1］。ACC氧化酶（ACO）是乙烯合成途徑中最后一個酶，直接催化ACC合成乙烯，其活性對乙烯生物合成具有重要的調(diào)控作用，因此ACO基因的表達(dá)是乙烯形成和應(yīng)答的主要標(biāo)志。ACO由多基因家族編碼，目前，已在多種植物上克隆了ACC氧化酶基因，并對其在植物生長發(fā)育、成熟衰老等生育過程及激素、環(huán)境脅迫、提高作物抗逆性等方面進(jìn)行了研究。擬南芥AtACO基因家族的6個成員（AtACO1-AtACO6）均可響應(yīng)水分脅迫，其中AtACO1基因參與植物發(fā)育，特別是根系發(fā)育［2］。Yuan等［3］從梨的基因組中鑒定了11個ACO基因，其中8個ACO基因在梨的果實(shí)中表達(dá)，3個ACO基因可被乙烯誘導(dǎo)，表明乙烯是控制更年期果實(shí)成熟過程的主要因素。楊樹ACC氧化酶基因Ptre-ACO3和Ptre-ACO6可通過調(diào)節(jié)乙烯合成而調(diào)控楊樹秋葉的衰老［4］。Sornchai等［5］通過導(dǎo)入石斛蘭CpACO基因反義載體延長了石斛蘭花期壽命。孫申申等［6］從“云香”水仙中克隆的新型ACC氧化酶基因NtACOY2參與“云香”水仙花的發(fā)育，并且與其花衰老密切相關(guān)；在煙草中過表達(dá)NtACOY2，2株轉(zhuǎn)基因煙草分別比野生型煙草提前8d和7d開花。吳建陽等［7］的研究表明荔枝Lc-ACO1基因參與調(diào)控荔枝幼果脫落。薛麗君從苧麻中獲得的BnACO1基因參與ABA、干旱、NaCl 脅迫應(yīng)答［8］。擬南芥中過量表達(dá)棉花GhACO2基因，增強(qiáng)了擬南芥耐鹽、耐干旱能力［9］。有關(guān)向日葵ACC氧化酶基因相關(guān)方面的研究鮮有報道。本研究對前期從鹽誘導(dǎo)向日葵中克隆的ACC氧化酶基因HaACO1（GenBank No. KP966508）［10-11］進(jìn)行了表達(dá)分析及耐鹽功能驗(yàn)證，為利用該基因進(jìn)行作物抗逆性狀改良奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)在內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心進(jìn)行。將向日葵P50種子種植在實(shí)驗(yàn)室蛭石中，待發(fā)芽長成幼苗后，分別進(jìn)行以下處理。（1）按照郭樹春等［12］的方法接種黃萎病病菌（V21），取接種0 d（CK）、1 d、3 d、5 d和7 d植 株 的 葉 片。（2）按照孫瑞芬等［11］的方法，用120 mmol/L NaCl處理向日葵幼苗；用鑷子夾傷葉片遠(yuǎn)端邊緣并用大頭針戳3-5下進(jìn)行損傷處理；將向日葵幼苗置于4℃冰箱進(jìn)行低溫處理；用5 mmol/L水楊酸噴灑向日葵幼苗。分別取以上不同處理0 h（CK）、2 h、6 h、12 h和24 h植株的葉片。（3）取在1/2 MS營養(yǎng)液中培養(yǎng)4-5 d的向日葵P50幼苗的根、下胚軸和葉片。以上各處理材料于液氮中速凍后，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

將本課題組保存的野生型煙草SRI（Nicotiana tabacum）種子，用0.1% HgCl2消毒10 min，無菌水沖洗4-5次，接種到1/2MS固體培養(yǎng)基中，置于植物組織培養(yǎng)室中培養(yǎng)獲得無菌苗，備用。新鮮洋蔥購自市場。瞬時表達(dá)載體pCAM-35S-GFP、植物表達(dá)載體pPZP221、農(nóng)桿菌菌株EHA101由本課題組保存。黃萎病病菌（大麗輪枝菌Verticillium dahlia）菌株V21由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)趙君教授惠贈。利用Primer Premier 5/64軟件設(shè)計引物（表1），由南京金斯瑞生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 HaACO1在向日葵中的表達(dá)分析 利用TaKaRa公司的RNA提取試劑盒（MiniBEST Plant RNA Exteaction Ki）提取各處理樣品總RNA，通過微量紫外分光光度計（NanoDrop 2000）測其濃度并稀釋到200 ng/μL，以其為模板，利用TaKaRa公司 的PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒合成cDNA。根據(jù)HaACO1的ORF序列設(shè)計引物F1和R1（表1），以向日葵18S rRNA（No.HM638219）為內(nèi)參基因（引物為F2和R2），利用TaKaRa公 司 的SYBR?Premix EX TaqTMⅡ（Tli RNaseH plus）進(jìn)行實(shí)施熒光定量PCR反應(yīng)（qRTPCR），重復(fù)3次。通過2-ΔΔCT法計算HaACO1的相對表達(dá)量，分析其在向日葵根、下胚軸和葉中的表達(dá)量及其在生物和不同非生物脅迫條件下的表達(dá)模式。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.2.2 HaACO1亞細(xì)胞定位分析 使用ProtComp9.0軟件對HaACO1進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測。以克隆載體pT-HaACO1［11］為模板，用引物F3和R3（表1）擴(kuò)增不含終止密碼子的HaACO1編碼區(qū)片段，將其定向連接到瞬時表達(dá)載體中的綠色熒光蛋白（GFP）N端，構(gòu)建融合基因表達(dá)載體pCAM-35S-HaACO1-GFP。切取2 cm2×2 cm2新鮮洋蔥內(nèi)表皮于含4%甘露醇的MS高滲培養(yǎng)基上，25℃預(yù)培養(yǎng)4 h。分別制備含有融合基因的表達(dá)載體pCAM-35S-HaACO1-GFP和空載體pCAM-35S-GFP（CK）的微金彈，通過基因槍（Bio-Rad）轟擊洋蔥表皮并暗培養(yǎng)24 h以后，利用激光共聚焦顯微鏡觀察洋蔥表皮細(xì)胞中HaACO1-GFP融合蛋白的瞬時表達(dá)情況。

1.2.3 HaACO1的過表達(dá)分析

1.2.3.1 HaACO1對煙草的遺傳轉(zhuǎn)化 用引物F4和R4（表1）擴(kuò)增HaACO1基因編碼區(qū)片段，并定向插入到植物表達(dá)載體pPZP221的35S啟動子和NOS終止子之間，構(gòu)建重組表達(dá)載體，通過凍融法將其導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA101感受態(tài)細(xì)胞中獲得轉(zhuǎn)化菌株。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草葉片并用慶大霉素（50 mg/L）篩選抗性植株。在35S啟動子近3'端序列上設(shè)計正向引物p-F（表1）和HaACO1下游引物R4對抗性植株進(jìn)行PCR和RT-PCR擴(kuò)增，分別檢測其在DNA水平和RNA水平上的整合和轉(zhuǎn)錄情況。將RNA檢測陽性植株與野生型植株進(jìn)一步擴(kuò)繁株系。

1.2.3.2 轉(zhuǎn)HaACO1煙草抗逆性鑒定 隨機(jī)切取3個轉(zhuǎn)基因陽性株系和1個野生型（WT）株系相同部位的葉盤，分別接種于含有0和150 mmol/L NaCl的分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)10-15 d，觀察葉片顏色變化和分化情況并拍照。

將1個轉(zhuǎn)基因株系與野生型株系組培苗煉苗后轉(zhuǎn)移到液體1/2 MS中培養(yǎng)5 d后，分別經(jīng)4℃低溫、20% PEG6000和150 mmol/L NaCl處理0 h（CK）和24 h取其相同部位葉片，液氮速度后-80℃保存。以煙草EF-1α基因（No. AF120093）為內(nèi)參基因（引物為F5和R5），用引物F1和R1進(jìn)行不同脅迫條件下HaACO1的qRT-PCR分析。重復(fù)3次。

利用南京建成生物工程研究所的生理生化測定試劑盒，對NaCl處理前、后的轉(zhuǎn)基因株系和野生型株系葉片進(jìn)行葉綠素、可溶性蛋白質(zhì)和脯氨酸含量的測定及POD和SOD活性的測定（測定方法按照試劑盒說明書進(jìn)行）。以煙草EF-1α為內(nèi)參基因，利用TaKaRa公司的試劑盒進(jìn)行抗逆相關(guān)基因P5CS、POD、MnSOD、GuZnSOD的qRT-PCR分 析。3次重復(fù)。

2 結(jié)果

2.1 向日葵不同器官中HaACO1的表達(dá)分析

qRT-PCR結(jié)果表明，HaACO1在向日葵根、下胚軸和葉中均有表達(dá)，其中在葉和下胚軸中的表達(dá)量均極顯著高于根中的表達(dá)量（P＜0.01），且在葉中的表達(dá)量最高（圖1），說明HaACO1存在器官特異性表達(dá)差異。

圖1 HaACO1在向日葵不同器官的表達(dá)分析Fig.1 Expression of HaACO1 in different organs of sunflower

2.2 HaACO1對生物脅迫的應(yīng)答分析

由圖2看出，向日葵幼苗接種黃萎病病菌（V21菌株）1、3、5、7 d后分析向日葵葉片HaACO1基因表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)接種1 d后HaACO1表達(dá)量幾乎沒有變化，但第3天和第7天HaACO1表達(dá)量迅速升高，極顯著高于0 d（P＜0.01），其中第5天較第3天有所降低，到第7天又升高。由于黃萎病病菌侵入而導(dǎo)致的HaACO1表達(dá)量變化，表明該基因在生物脅迫防御調(diào)控中發(fā)揮作用。

圖2 HaACO1在黃萎病病原菌V21誘導(dǎo)下的表達(dá)分析Fig.2 HaACO1 expression under the induction of Verticillium wilt pathogen V21

2.3 HaACO1響應(yīng)非生物脅迫的表達(dá)分析

qRT-PCR分析表明，NaCl、機(jī)械損傷、低溫和水楊酸處理向日葵幼苗均可誘導(dǎo)向日葵葉片中HaACO1基因表達(dá)，但脅迫條件不同，其表達(dá)模式不同?？傊畵p傷處理后HaACO1的相對表達(dá)量變化最顯著，依次為水楊酸、低溫和NaCl誘導(dǎo)（圖3）。

圖3 非生物脅迫的不同時間點(diǎn)HaACO1相對表達(dá)分析Fig.3 HaACO1 expression at different time under different abiotic stresses

120 mmol/L NaCl處理向日葵幼苗2、12和24 h時，與0 h（CK）相比，HaACO1的相對表達(dá)量變化不明顯，但呈上調(diào)趨勢，而脅迫6 h時呈現(xiàn)顯著下調(diào)表達(dá)（P＜0.01）。

向日葵受機(jī)械損傷處理后，葉片中HaACO1的表達(dá)量變化較為明顯，總體趨勢為先升高后降低。與0 h相比，受損2 h后升高（P＜0.01），6 h達(dá)到高峰，之后降低，但均極顯著高于0 h（P＜0.01）。

4℃低溫誘導(dǎo)向日葵幼苗后，葉片中HaACO1的表達(dá)量也有變化，總體趨勢為先升高后降低再升高。與0 h相比，處理2 h后HaACO1的表達(dá)量升高且到6 h變化平緩，但均高于0 h（P＜0.01），12 h時降低（P＜0.05），24 h時又升高（P＜0.01），且達(dá)到峰值。

5 mmol/L水楊酸處理向日葵幼苗后，葉片中HaACO1的表達(dá)量表現(xiàn)出明顯的變化，總體趨勢為升高-降低-升高-降低。與0 h相比，處理2、6、12和24 h后，HaACO1的相對表達(dá)量均較0 h有所增加（P＜0.01），2 h時葉片中HaACO1相對表達(dá)量最高，24 h時最低。

由此表明，向日葵可通過調(diào)節(jié)HaACO1表達(dá)水平防御非生物脅迫造成的傷害。

2.4 亞細(xì)胞定位分析

HaACO1亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果表明，HaACO1蛋白主要位于細(xì)胞質(zhì)。構(gòu)建HaACO1基因融合表達(dá)載體pCAM-35S-HaACO1-GFP，通過基因槍轟擊轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì)胞，借助激光共聚焦顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)空載體的GFP熒光信號分布于洋蔥表皮細(xì)胞的細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核各個部位，而HaACO1-GFP融合蛋白的熒光信號主要集中于細(xì)胞質(zhì)（圖4），與ProtComp 9.0軟件預(yù)測結(jié)果一致。

圖4 融合蛋白HaACO1-GFP在洋蔥表皮細(xì)胞中定位Fig. 4 Localization of HaACO1-GFP fusions in onion epidermal cell

2.5 過表達(dá)分析

2.5.1 轉(zhuǎn)基因植株獲得及分子檢測 構(gòu)建HaACO1基因植物表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化野生型煙草，獲得了慶大霉素抗性煙草植株。隨機(jī)選擇11個獨(dú)立的抗性植株（編號1-11）分別進(jìn)行目的基因HaACO1的PCR和RT-PCR檢測。擴(kuò)增結(jié)果顯示，11個植株中有10個植株（2-11）獲得與陽性對照大小一致的條帶（圖5-A），表明HaACO1已整合到煙草基因組DNA中；RT-PCR檢測結(jié)果顯示，10個PCR陽性植株中，除5號外其余9個植株均獲得與陽性對照一致的目的條帶（圖5-B），表明該基因在RNA水平上獲得表達(dá)。擴(kuò)繁RT-PCR檢測陽性植株以備后續(xù)試驗(yàn)。

圖5 抗性植株的分子檢測Fig.5 Molecular test of resistant plants with PCR and RTPCR

2.5.2 轉(zhuǎn)HaACO1煙草抗逆性鑒定 圖6結(jié)果顯示，在不含NaCl的分化培養(yǎng)基上，3個轉(zhuǎn)基因株系（T-4、T-6、T-10）植株離體葉片顏色與野生型煙草均表現(xiàn)正常、分化能力基本一致，而在含有150 mmol/L NaCl培養(yǎng)基上的轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株葉片均表現(xiàn)為顏色變淺，分化能力受到抑制，但轉(zhuǎn)基因植株葉片受到抑制的程度較野生型煙草的輕，表明轉(zhuǎn)基因植株較野生型植株對鹽脅迫表現(xiàn)出一定的耐受性。

圖6 鹽脅迫對煙草葉片離體培養(yǎng)的影響Fig.6 Effect of salt stress on in vitro culture of tobacco leaves

對轉(zhuǎn)基因株系T-10進(jìn)行qRT-PCR分析表明，正常條件下，T-10與WT煙草葉片中HaACO1的相對表達(dá)量基本一致，而受到脅迫后，二者葉片中HaACO1的相對表達(dá)量均較CK有不同程度的增加，而且無論是低溫誘導(dǎo)還是PEG、NaCl誘導(dǎo)，轉(zhuǎn)基因株系T-10中HaACO1的相對表達(dá)量均顯著高于WT煙草（P ＜0.01）（圖7），表明逆境脅迫誘導(dǎo)了轉(zhuǎn)基因煙草中HaACO1的過量表達(dá)。

圖7 非生物脅迫條件下轉(zhuǎn)基因煙草中HaACO1的表達(dá)分析Fig. 7 HaACO1 expression analysis in transgenic plants under abiotic stresses

圖8顯示，處理前，轉(zhuǎn)基因株系T-10與WT株系葉片的葉綠素、可溶性蛋白、脯氨酸含量和POD、SOD活性均基本一致，而用NaCl處理24 h后，各生理生化指標(biāo)均有變化。其中T-10和WT葉片中的葉綠素含量均較處理前有所下降，但WT葉片中葉綠素含量下降幅度較T-10下降幅度大，且二者呈現(xiàn)極顯著差異（P＜0.01）；T-10和WT葉片中可溶性蛋白含量、脯氨酸含量、POD活性和SOD活性均較處理前有所增加，且T-10較WT增加顯著（P＜0.01）。由此表明，HaACO1基因在煙草中過表達(dá)，可以增加植株可溶性蛋白和脯氨酸的合成以及提高POD和SOD的活性，從而提高煙草對NaCl脅迫的耐受能力。

圖8 轉(zhuǎn)基因煙草中抗逆相關(guān)生理生化指標(biāo)分析Fig.8 Analyses of physiological parameters related to stress tolerance in transgenic tobacco

圖9顯示，處理前，轉(zhuǎn)基因煙草株系T-10和WT煙 草 中P5CS、POD、MnSOD和GuZnSOD相對表達(dá)量基本一致無顯著差異，而在NaCl處理24 h后，T-10和WT煙草中4個抗逆相關(guān)基因的相對表達(dá)量均較處理前有所增加，且T-10極顯著高于WT（P＜0.01）?？梢?，HaACO1過表達(dá)誘導(dǎo)了煙草中P5CS、POD、MnSOD、GuZnSOD基因的上調(diào)表達(dá)，提高了煙草體內(nèi)的滲透調(diào)節(jié)和清除活性氧的能力，從而提高了煙草對NaCl的耐受性。

圖9 轉(zhuǎn)基因煙草中脅迫相關(guān)基因的表達(dá)分析Fig. 9 Expression analysis of stress-responsive genes in transgenic tobacco

3 討論

植物在其生長、發(fā)育、成熟衰老的生命周期中，會受到各種生物和非生物脅迫的影響，乙烯作為氣態(tài)植物激素不僅影響植物生長發(fā)育的許多方面，而且對多種脅迫都會做出響應(yīng)［13］。研究表明，ACC氧化酶（ACO）由多基因家族編碼，是催化ACC合成乙烯的最后一個關(guān)鍵酶。ACO基因的特異表達(dá)，不論是在植物生長發(fā)育，還是響應(yīng)環(huán)境脅迫過程中，對乙烯的生物合成都具有重要的調(diào)節(jié)作用［13-14］。已有研究證實(shí)，同種植物的不同ACO成員在器官表達(dá)特異性、時空表達(dá)、轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平等不同基因表達(dá)層次都存在明顯差異［1］。Takahashi等［15］從萵苣中分離出3種ACO基因，即Ls-ACO1、Ls-ACO2和Ls-ACO3。研究表明，光照可誘導(dǎo)Ls-ACO1和Ls-ACO3積累，低pH（4.0）誘導(dǎo)Ls-ACO2表達(dá)，ACC或IAA只誘導(dǎo)Ls-ACO2積累。這些結(jié)果表明，生長素、乙烯和光可誘導(dǎo)ACO表達(dá)，Ls-ACO2在低pH誘導(dǎo)萵苣根毛形成過程中對乙烯生成起著關(guān)鍵作用。Liu等［16］從損傷誘導(dǎo)的向日葵品種Dahlgren 131中克隆了ACCO1及其同源基因ACCO2，并以O(shè)uvrard等［17］分離的向日葵sdi-10為基礎(chǔ)克隆了ACCO3，這3個基因?qū)儆谙蛉湛鸄CO家族的3個成員。通過損傷和銀離子處理向日葵幼苗，結(jié)果表明ACCO1和ACCO2和ACCO3存在器官差異表達(dá)，ACCO1主要在根中表達(dá)，ACCO2主要在下胚軸和葉中表達(dá)，ACCO3在根、下胚軸和葉中均有表達(dá)，但ACCO3在ACO總的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中只占少量。植物ACO各個成員的表達(dá)差異可能是由于上游調(diào)控序列的差異所致［18］。百脈根LcACO1在其根、果莢、葉、花中均有表達(dá)，且具有一定的組織特異性，其中根中表達(dá)量最高，與在果莢、葉、花中的表達(dá)量相比有顯著性差異［19］。潘剛［20］報道了分離得到的桑樹MaACO1基因在桑樹葉片形成、雌花發(fā)育中的作用以及參與機(jī)械損傷與低溫、干旱脅迫的應(yīng)答。李立芹等［21］研究表明，馬鈴薯StACO1在馬鈴薯根、莖、葉和花的各個組織中均有表達(dá)，并且其表達(dá)量在根中最高，在葉中的表達(dá)量最低，同時發(fā)現(xiàn)該基因在高鹽、滲透、低鉀和過氧化氫脅迫后表達(dá)量明顯增加，表明StACO1參與馬鈴薯非生物逆境脅迫反應(yīng)。此外，馬鈴薯StACO1還受到乙烯、生長素、茉莉酸、傷害和真菌誘導(dǎo)表達(dá)。Xiao等［22］從匍匐翦股穎中克隆的AsACO在莖中的表達(dá)量最高，對乙烯利、茉莉酸甲酯、水楊酸和低溫的反應(yīng)強(qiáng)烈上調(diào)，但對干旱和NaCl處理的反應(yīng)下調(diào)。Shi等［23］分析表明梨的PpACO1和PpACO2基因在梨的果實(shí)中有差異表達(dá)，且在果實(shí)發(fā)育的不同時期，2個PpACO的表達(dá)量不同。此外，PpACO1在果實(shí)中被水楊酸誘導(dǎo)下調(diào)；而PpACO2在果實(shí)中被水楊酸誘導(dǎo)顯著上調(diào)。這些結(jié)果表明，梨的PpACO可能參與調(diào)節(jié)果實(shí)成熟和響應(yīng)水楊酸脅迫。朱家紅等［24］研究表明，乙烯利、低溫和赤霉素均能誘導(dǎo)菠蘿AcACO1的表達(dá)。本研究進(jìn)行了HaACO1在向日葵不同器官中的表達(dá)分析，結(jié)果表明HaACO1在向日葵根、下胚軸和葉中均有表達(dá)，其中在葉中表達(dá)量最高，依次為下胚軸、根，與向日葵ACCO2的表達(dá)模式相似［16］。進(jìn)一步對向日葵幼苗進(jìn)行生物脅迫和不同非生物脅迫前后HaACO1的相對表達(dá)分析，表明黃萎病病原菌及NaCl、損傷、水楊酸和低溫處理均可誘導(dǎo)向日葵HaACO1表達(dá)，但脅迫條件不同，表達(dá)模式不同。ACO基因表達(dá)量增加，乙烯合成增多，啟動乙烯信號傳導(dǎo)途徑參與激發(fā)植物防御應(yīng)答［20］。

在ACO基因超表達(dá)研究中，張萍等［9］將棉花GhACO2基因?qū)霐M南芥中發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因擬南芥對鹽脅迫和干旱脅迫的耐受性較野生型擬南芥顯著性增強(qiáng)。孫明明等［25］通過花粉管注射法將花生AhACO1和AhACO2導(dǎo)入花生中，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因植株目的基因的表達(dá)量和乙烯釋放量明顯高于非轉(zhuǎn)基因植株，而且用鹽處理后轉(zhuǎn)基因植株葉片萎蔫程度相對較輕，推測AhACO基因的過量表達(dá)提高了轉(zhuǎn)基因花生的耐鹽性。李立芹等［21］將馬鈴薯StACO1基因轉(zhuǎn)入煙草中，在低鉀條件下進(jìn)行種子萌發(fā)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因煙草的發(fā)芽率明顯優(yōu)于對照，且根毛數(shù)量和長度較對照增加和增長，表明過量表達(dá)的煙草通過增加根毛數(shù)量與主根長度來適應(yīng)這種脅迫，促使植物吸收更多鉀離子。在低鉀水培條件下，H2O2含量與對照相比降低，表明過量表達(dá)StACO1基因的煙草表現(xiàn)出更強(qiáng)的耐低鉀能力。Ramadoss等［26］將ACO基因轉(zhuǎn)入擬南芥中，淹水條件下，野生型擬南芥存活時間不到20 d，而轉(zhuǎn)基因株系存活時間可達(dá)35 d，表明過表達(dá)ACO基因可提高擬南芥抗淹水能力。

非生物脅迫引起的植物生理生化指標(biāo)的改變是由植物體內(nèi)的保護(hù)系統(tǒng)和相關(guān)基因表達(dá)共同調(diào)控的［27］。大量研究表明，可溶性蛋白和脯氨酸含量及POD和SOD活性是反應(yīng)植物逆境脅迫生理生化參數(shù)改變的重要指標(biāo)。植物中的蛋白質(zhì)合成對非生物脅迫非常敏感。Ban等［28］研究表明，植物蛋白質(zhì)合成與抗逆性呈正相關(guān)，可溶性蛋白水平的增加有助于提高轉(zhuǎn)基因植物對環(huán)境因子（如銅）的耐受性。脅迫條件下，植物體內(nèi)脯氨酸含量的改變顯示了植物對脅迫的耐受能力，其含量越高，植物的抗脅迫能力越強(qiáng)。SOD、POD等抗氧化酶類作為活性氧的清除劑，可以防止環(huán)境脅迫下細(xì)胞受到傷害［29］。干旱、冷、熱、鹽脅迫下向日葵葉片和根中脯氨酸增加［30］。Shahbaz等［31］報道了鹽脅迫顯著提高了8個供試向日葵品種的游離脯氨酸含量。在低鉀脅迫下，轉(zhuǎn)馬鈴薯StACO1煙草的3個株系的脯氨酸、K+和ACC含量及POD酶活性都呈現(xiàn)增加的趨勢，且顯著高于對照，表明過表達(dá)StACO1，可增強(qiáng)煙草對鉀脅迫的耐受性［21］。鹽脅迫使光合作用受抑制，也影響光合成分和葉綠體超微結(jié)構(gòu)［32］，從而影響植物生長發(fā)育。已有報道顯示，某些外源基因超表達(dá)可提高轉(zhuǎn)基因植物在高鹽脅迫下的葉綠素含量［33］，可以激活一系列脅迫相關(guān)基因如P5CS、POD、Cu/ZnSOD、LEA、C2H2、脫水素及冷誘導(dǎo)等基因的表達(dá)來提高植株對鹽、干旱、氧化等非生物脅迫的耐受性［28］。Cu/ZnSOD在葉綠體中表達(dá)可增強(qiáng)馬鈴薯植株對環(huán)境脅迫的耐受性［34］。本研究結(jié)果表明在低溫、干旱和NaCl 脅迫下，轉(zhuǎn)基因煙草的HaACO1表達(dá)量高于野生型煙草，說明過度表達(dá)向日葵HaACO1提高了煙草對逆境脅迫的抗性。進(jìn)一步研究表明，NaCl 脅迫下，轉(zhuǎn)HaACO1煙草中可溶性蛋白含量高于野生型煙草，認(rèn)為HaACO1可能參與促進(jìn)蛋白質(zhì)合成或保護(hù)蛋白質(zhì)合成途徑；轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草葉綠素含量降低，但轉(zhuǎn)基因煙草葉綠素含量高于野生型煙草葉綠素含量，表明NaCl脅迫影響了光合成分葉綠素的合成，導(dǎo)致光合作用受阻，但HaACO1過表達(dá)減弱了鹽脅迫對轉(zhuǎn)基因煙草中葉綠素合成的影響，與煙草離體葉片的耐鹽性實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。同時，轉(zhuǎn)HaACO1煙草中脯氨酸含量和POD、SOD活性及與之相關(guān)的P5CS、POD、MnSOD、CuZnSOD基因相對表達(dá)量均高于野生型煙草，表明NaCl脅迫下，HaACO1過表達(dá)誘導(dǎo)了脅迫相關(guān)基因P5CS、POD、MnSOD、CuZnSOD的上調(diào)表達(dá)，增加了細(xì)胞內(nèi)脯氨酸積累，增強(qiáng)了POD和SOD活性，提高了轉(zhuǎn)基因煙草的耐鹽性。

4 結(jié)論

本研究表明HaACO1在向日葵根、下胚軸和葉不同器官中具有表達(dá)特異性；該基因參與生物和非生物脅迫應(yīng)答，且具有獨(dú)特的表達(dá)模式。瞬時表達(dá)證實(shí)其編碼蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)，與其行使的功能相一致。煙草中過表達(dá)HaACO1基因，提高了轉(zhuǎn)基因煙草對低溫、干旱和鹽的耐受性；NaCl脅迫后，經(jīng)過一系列信號傳遞，誘導(dǎo)一些與抗逆相關(guān)基因的上調(diào)表達(dá)，引起與之相關(guān)的生理生化參數(shù)的相應(yīng)變化，以增強(qiáng)煙草抵抗鹽害的能力。