糖蜜添加量對雜交構樹青貯發(fā)酵品質(zhì)和微生物多樣性的影響

姜富貴 成海建 魏晨 張召坤 蘇文政 時光 宋恩亮

（山東省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所 山東省畜禽疫病防治與繁育重點實驗室，濟南 250100）

飼料是畜牧業(yè)發(fā)展的基礎。隨著我國居民生活水平提高，消費者對肉蛋奶的需求日益增長，導致飼料工業(yè)面臨原料短缺的局面，尤其是蛋白質(zhì)資源的國外進口依存度高達80%，嚴重制約我國畜牧業(yè)的發(fā)展［1］。構樹（Broussonetia papyrifera）又稱褚樹或構皮樹，?？茦嫎鋵俚碾p子葉植物。雜交構樹（hybrid Broussonetia papyrifera L. Vent）是中國科學院采用雜交育種技術培育出的新樹種，具有生長速度快、生物產(chǎn)量大、抗逆性強和飼用價值高等特點［2］。此外，雜交構樹粗蛋白的含量高且在瘤胃中的降解率較高［3］，以雜交構樹作為飼料資源有利于緩解我國蛋白飼料短缺的局面。青貯是當前雜交構樹飼料保存的主要手段，不僅生產(chǎn)成本低而且能夠改善雜交構樹的適口性。但是，由于雜交構樹的水溶性碳水化合物含量低且緩沖能高，單獨青貯的發(fā)酵品質(zhì)較差，需要添加劑提升其發(fā)酵品質(zhì)［4］。

糖蜜是制糖過程中的一種副產(chǎn)物，不僅含有糖類、蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)，而且含有低聚糖、磷脂、酚類等生物活性物質(zhì)［5］。在畜牧生產(chǎn)上，糖蜜不僅能夠作為一種能量飼料來提高動物的生產(chǎn)性能和飼料轉化效率［6-7］，而且能夠作為青貯發(fā)酵促進劑來快速降低pH，同時抑制丁酸產(chǎn)生和蛋白水解，進而改善青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)［5］。黃秋連等［8］研究發(fā)現(xiàn)，添加糖蜜可提升羊草青貯的粗蛋白含量并降低氨態(tài)氮含量。付錦濤等［9］研究發(fā)現(xiàn)，添加糖蜜可降低全株構樹與稻草混合青貯的pH，同時降低中性洗滌纖維（NDF）和酸性洗滌纖維（ADF）含量。穆麟等［10］研究發(fā)現(xiàn)，添加糖蜜可降低籽粒莧與稻秸混合青貯的干物質(zhì)損失，提高乳酸含量和有氧穩(wěn)定性。然而，當前研究主要是探討單一糖蜜添加量對某種飼草營養(yǎng)成分含量和發(fā)酵品質(zhì)的影響，針對不同糖蜜添加量對雜交構樹青貯發(fā)酵品質(zhì)和微生物多樣性影響的研究較少。因此，本研究以雜交構樹為原料，探究不同糖蜜添加量對雜交構樹青貯營養(yǎng)成分、發(fā)酵品質(zhì)和微生物多樣性的影響，為雜交構樹的飼料化應用提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

構樹原料于2020年6月18日取自山東省華悅中科生態(tài)科技有限公司種植基地（116°16' E，36°45'N），在株高1.2 m時采用自動收割機進行刈割，留茬高度約為30 cm，其營養(yǎng)成分見表1。糖蜜主要成分為木糖，含糖量約為55%，購自山東耀佳化工有限公司。

表1 雜交構樹原料的營養(yǎng)成分（干物質(zhì)基礎）Table 1 Nutritional composition of hybrid B. papyrifera L.Vent（dry matter basis）

1.2 方法

1.2.1 試驗設計 試驗采用單因子完全隨機設計，共設置4個處理組，以鮮重為基礎，試驗組糖蜜添加量分別為5 g/kg（M5組）、10 g/kg（M10組）和20 g/kg（M20組），對照組（CK組）添加與試驗組等體積的蒸餾水。各組混合均勻后，取約1 kg樣品裝入聚乙烯厭氧袋（22 cm×40 cm）中，每組4個重復，抽真空密封，于室溫（25-30℃）避光貯藏60 d后開袋取樣，后續(xù)測定相關指標。

1.2.2 測定指標和方法

1.2.2.1 常規(guī)營養(yǎng)成分測定 稱取500 g青貯樣品并平鋪在不銹鋼托盤上，于65℃鼓風干燥箱中烘至恒重，用于常規(guī)營養(yǎng)成分測定。干物質(zhì)（DM）、粗蛋白（CP）、粗灰分（Ash）和粗脂肪（EE）含量測定參照AOAC（2005）［11］的方法，其中采用重量法測定DM含量，采用凱氏定氮法測定CP含量，采用灰化法測定Ash含量，采用索氏浸提法測定EE含量。NDF、ADF和酸性洗滌木質(zhì)素（ADL）含量測定參照Van Soest等［12］的方法，利用Ringbio纖維分析儀（R-2000，英國）測定。水溶性碳水化合物（WSC）含量采用蒽酮-硫酸比色法［13］測定。

1.2.2.2 發(fā)酵指標測定 稱取青貯樣品20 g，加入180 mL蒸餾水，利用榨汁機進行榨汁并用4層紗布過濾獲取浸提液，立即使用pH計（HANNA HI 9125，意大利）測定pH值，剩余濾液-20℃保存用于測定乳酸、揮發(fā)性脂肪酸（VFA）和氨態(tài)氮（NH3-N）含量。乳酸和VFA含量使用高效液相色譜法測定［14］。NH3-N含量采用苯酚-次氯酸鈉比色法測定［15］。

1.2.2.3 微生物多樣性

（1）測序流程 稱取青貯樣品10 g于三角瓶中，加入90 mL蒸餾水，制備浸提液，于離心機10 000 r/min離心15 min，取沉淀；采用E.Z.N.A.?soil試 劑 盒（Omega Bio-tek，Norcross，USA）抽提DNA，利用NanoDrop2000檢測DNA濃度和純度，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量；采用338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'） 和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）引物對V3-V4可變區(qū)進行PCR擴增；利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（Axygen Biosciences，Union City，CA，USA）進行純化，利用QuantiFluorTM-ST（Promega，USA）進行檢測定量，純化后擴增片段構建PE2×300的文庫，在Illumina公司的Miseq PE300平臺進行測序。

（2）信息分析 利用Trimmomatic軟件對低質(zhì)量序列進行過濾，進一步利用FLASH軟件進行拼接，同時利用UCHIME軟件去除序嵌合體，然后使用UPARSE軟件按照97%的一致性對序列進行OUT聚類。獲取OTU后，使用 QIIME 軟件篩選出每個OTU 的代表序列，利用RDP classifier軟件與Silva數(shù)據(jù)庫（SSU138）比對并進行物種分類注釋，保留置信區(qū)間大于0.7的結果。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 營養(yǎng)成分和發(fā)酵品質(zhì)數(shù)據(jù)使用SAS 9.1軟件中GLM過程進行方差分析和Duncan氏多重比較檢驗，結果以最小二乘均值表示；營養(yǎng)成分和發(fā)酵品質(zhì)指標隨糖蜜添加量的直線、二次和三次曲線反應利用CONTRAST語句實現(xiàn)。微生物多樣性數(shù)據(jù)采用Majorbio生物云在線平臺進行OTU分析、Alpha多樣性分析、β多樣性分析、群落組成分析和物種差異分析，其中Alpha多樣性組間差異分析采用Student's t檢驗，β多樣性組間差異采用ANOSIM分析，物種差異分析采用Kruskal-Wallis秩和檢驗。P ＜ 0.05為差異顯著，0.05 ≤ P ＜ 0.10為存在趨勢。

2 結果

2.1 糖蜜添加量對雜交構樹青貯營養(yǎng)成分含量的影響

由表2可知，隨糖蜜添加量的增加，雜交構樹青貯的DM、CP和WSC含量顯著線性增加（P ＜ 0.05），NDF、ADF和Ash含量顯著線性降低（P ＜ 0.05）。糖蜜添加量對EE和ADL含量的影響較小，差異不顯著（P = 0.733）。M5組、M10組和M20組的DM含量較CK組顯著增加（P ＜ 0.05），而Ash含量顯著降低（P = 0.009）。M20組的CP和WSC含量較CK組顯著增加（P ＜ 0.05），而NDF和ADF含量顯著降低（P ＜ 0.001）。

表2 糖蜜添加量對雜交構樹青貯營養(yǎng)成分含量的影響（干物質(zhì)基礎）Table 2 Effects of addition amount of molasses on nutrient contents of hybrid B. papyrifera L. Vent silage（dry matter basis）

2.2 糖蜜添加量對雜交構樹青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響

由表3可知，隨糖蜜添加量的增加，雜交構樹青貯的pH值、丙酸、丁酸含量和NH3-N/TN顯著線性降低（P ＜ 0.05），乳酸含量顯著線性增加（P =0.002）。糖蜜添加量對乙酸含量的影響較小，差異不顯著（P = 0.131）。M10組和M20組的乳酸含量較CK組顯著增加（P = 0.024），而丙酸含量顯著降低（P = 0.043）。M5組、M10組和M20組的pH值、丁酸含量和NH3-N/TN較CK組顯著降低（P ＜ 0.01）。

表3 糖蜜添加量對雜交構樹青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響（干物質(zhì)基礎）Table 3 Effects of addition amount of molasses on the fermentation quality of hybrid B. papyrifera L. Vent silage（dry matter basis）

2.3 糖蜜添加量對雜交構樹青貯微生物多樣性的影響

2.3.1 Alpha多樣性分析 通過對雜交構樹4個鮮樣和16個青貯樣品進行測序分析，共獲得723 460條高質(zhì)量序列并聚類成310個OTUs，各處理的覆蓋深度（Coverage指數(shù)）均大于0.99?；贠UT水平的Alpha多樣性分析結果如圖1所示，M20組青貯的Ace和Chao指數(shù)較鮮樣顯著增加（P ＜ 0.05），而Shannon和Simpson指數(shù)無顯著差異。隨糖蜜添加量的增加，Ace、Chao和Simpson指數(shù)顯著線性增加（P＜ 0.05），而Shannon指數(shù)顯著線性降低（P = 0.010）。

圖1 雜交構樹鮮樣和青貯的Alpha多樣性分析Fig. 1 Alpha diversity analysis of hybrid B. papyrifera L. Vent fresh material and silage

2.3.2 β多樣性分析 基于Bray-Curtis距離的PCoA分析結果如圖2所示，雜交構樹鮮樣與青貯樣品的微生物群落組成存在顯著差異（P = 0.004）；CK組與M5組的微生物群落組成存在顯著差異（P =0.034）；M10組與M20組的微生物群落組成存在顯著差異（P = 0.031）；M10組和M20組的微生物群落組成與CK組和M5組存在顯著差異（P = 0.001）。

圖2 雜交構樹鮮樣和青貯的PCoA分析Fig. 2 Principal co-ordinates analysis of hybrid B. papyrifera L. Vent fresh material and silage

2.3.3 微生物群落組成分析 如圖3-A所示，在門水平上，雜交構樹鮮樣和青貯的優(yōu)勢菌門均為厚壁菌門（Firmicutes），相對豐度分別為94.41%和94.11%，其次為變形菌門（Proteobacteria）相對豐度分別為5.39%和5.83%。M5、M10和M20組厚壁菌門的相對豐度較CK組均升高，分別為98.71%、99.02%和99.08%。

如圖3-B所示，在屬水平上，雜交構樹鮮樣中優(yōu)勢菌屬為魏斯氏菌屬（Weissella）和腸桿菌屬（Enterobacter），相對豐度分別為87.82%和4.20%。CK組優(yōu)勢菌屬為魏斯氏菌屬、乳桿菌屬（Lactobacillus）、Clostridium_sensu_stricto_12和 腸 桿菌屬，相對豐度分別為49.41%、31.07%、8.05%和4.61%。M5組的優(yōu)勢菌屬為魏斯氏菌屬，相對豐度為62.96%，其次為乳桿菌屬，相對豐度為32.88%。M10組和M20組的優(yōu)勢菌屬均為乳桿菌屬，相對豐度分別為82.13%和91.81%，其次為魏斯氏菌屬，相對豐度分別為16.25%和6.95%。

圖3 雜交構樹鮮樣和青貯在門水平（A）和屬水平（B）的微生物群落組成Fig. 3 Microbial community structure of hybrid B. papy-rifera L. Vent fresh material and silage at phylum（A）and genus（B）level

2.3.4 微生物菌群的差異性分析 各處理組在屬水平上的菌群差異性分析結果如圖4所示，M5組乳桿菌屬的比例較CK組無顯著變化（P ＞ 0.05），但魏斯氏菌屬的比例顯著增加（P = 0.003）。M10組和M20組乳桿菌屬的比例較CK組和M5組均顯著增加（P = 0.005），而魏斯氏菌屬的比例顯著降低（P =0.003）。M5組、M10組和M20組Clostridium_sensu_stricto_12、腸桿菌屬和片球菌屬的比例較CK組均顯著降低（P ＜ 0.05）。

圖4 各組雜交構樹青貯在屬水平菌群的差異性分析Fig. 4 Difference analysis of flora of hybrid B. papyrifera L. Vent silage groups at genus level

3 討論

3.1 糖蜜添加量對雜交構樹青貯營養(yǎng)成分含量的影響

雜交構樹青貯后的DM和WSC含量較青貯前顯著降低，與王亞芳等［16］和周昕等［17］的研究結果一致，主要與青貯前期植物細胞的呼吸作用對DM的消耗以及青貯后期乳酸菌利用WSC發(fā)酵產(chǎn)生乳酸有關［18］。本試驗中，雜交構樹原料的營養(yǎng)成分與黃媛等［4］和司丙文等［19］的研究結果存在差異，其原因是雜交構樹的營養(yǎng)成分受刈割高度、留茬高度、生長期和田間管理等多因素的影響［20］。曹力凡等［21］發(fā)現(xiàn)，隨刈割高度的增加，雜交構樹原料的NDF、ADF和ADL含量顯著增加，而CP含量顯著降低；隨留茬高度的增加，NDF、ADF和ADL含量顯著降低，而CP含量顯著增加。本試驗中，與CK組相比，M20組的DM和CP含量顯著增加，而NDF和ADF含量顯著降低，與黃秋連等［8］、穆麟等［10］和周昕等［17］的研究結果一致，M20組高DM和CP含量可能是因為添加糖蜜促進乳酸菌的增殖，pH快速降低抑制了有害微生物生長，進而減少了營養(yǎng)物質(zhì)的損失［18］；CK組 高NDF和ADF含 量 可 能 是 其Clostridium_sensu_stricto_12和腸桿菌屬消耗了青貯中蛋白質(zhì)和糖等營養(yǎng)物質(zhì)，降低青貯DM含量的同時增加了NDF和ADF在DM中的比例，而M20組低NDF和ADF含量可能與乳酸菌產(chǎn)生的有機酸和纖維素酶對纖維素和半纖維素的降解有關［22］。NDF和ADF含量是評定粗飼料綜合營養(yǎng)價值的重要指標，二者含量越低則粗飼料的品質(zhì)越高［16］，因此添加糖蜜可提升雜交構樹青貯的營養(yǎng)價值。

3.2 糖蜜添加量對雜交構樹青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響

青貯的pH、乳酸含量和NH3-N/TN是評定青貯發(fā)酵品質(zhì)的關鍵指標。一般來說，優(yōu)質(zhì)青貯的pH應小于4.2，乳酸含量大于4%，NH3-N/TN小于10%［23］。參照此標準，CK組的3項指標均未達到優(yōu)質(zhì)青貯飼料的要求，表明雜交構樹較難青貯，單獨青貯的發(fā)酵品質(zhì)較差。司丙文等［19］認為，雜交構樹不易青貯與其附生乳酸菌數(shù)量少、WSC含量低和緩沖能高有關。通常情況下，生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)青貯飼料的原料WSC含量（DM基礎）應大于6%［24］，本試驗用雜交構樹原料的WSC含量僅為1.27%，而添加20 g/kg糖蜜（M20組）的pH、乳酸含量和NH3-N/TN均達到優(yōu)質(zhì)青貯飼料的要求，因此低WSC含量可能是限制雜交構樹發(fā)酵的首要因素。本試驗中，隨糖蜜添加量的增加，pH線性降低，乳酸含量線性增加，與付錦濤等［9］和司丙文等［19］的研究結果一致，主要是因為糖蜜中的WSC為乳酸菌的快速增殖提供了充足的發(fā)酵底物，增加乳酸含量的同時降低了pH［8］。本試驗中，雜交構樹青貯中乙酸含量受糖蜜添加量的影響較小，與付錦濤等［9］的研究結果一致，但顯著高于王亞芳［16］和施巧婷［25］報道的全株玉米青貯中的乙酸含量，究其原因，可能與其WSC含量不足有關，而糖蜜添加組可能與其附生布氏乳桿菌的作用有關。在WSC含量不足時，乳酸菌以乳酸為能量來源發(fā)酵產(chǎn)生乙酸［26］，而布氏乳桿菌屬于異型發(fā)酵乳酸菌，發(fā)酵產(chǎn)生乳酸的同時產(chǎn)生等量的乙酸［27］。青貯中丁酸和氨態(tài)氮含量嚴重降低飼料的營養(yǎng)價值和適口性，NH3-N/TN反映了青貯中蛋白質(zhì)和氨基酸的降解程度，其值越高則蛋白氮的降解越多［16］。CK組高丁酸含量和高NH3-N/TN主要與其高Clostridium_sensu_stricto_12豐度有關，Clostridium_sensu_stricto_12不僅能夠通過氨基酸脫氨基作用生成氨態(tài)氮，而且可以利用糖產(chǎn)生丁酸［28］。隨糖蜜添加量的增加，丁酸含量和NH3-N/TN顯著線性降低，可能是因為低pH抑制了梭菌等有害菌的增殖［29］。綜上所述，添加糖蜜可提升雜交構樹青貯的發(fā)酵品質(zhì)。

3.3 糖蜜添加量對雜交構樹青貯微生物多樣性的影響

當前有關青貯前后菌群豐度和多樣性變化的研究結果存在分歧，與青貯前相比，大豆青貯［30］和辣木葉青貯［31］的菌群豐度和多樣性顯著增加，而全株玉米青貯［32-33］顯著降低，除與原料種類有關，還可能與發(fā)酵時間有關。Ren等［34］發(fā)現(xiàn)，甘蔗青貯菌群的豐度和多樣性在發(fā)酵60 d顯著增加，而在發(fā)酵90 d顯著降低；Jiang等［22］發(fā)現(xiàn)，全株玉米青貯菌群的豐度和多樣性在發(fā)酵45 d顯著增加，在發(fā)酵90 d顯著降低。由于在青貯發(fā)酵過程中乳酸菌逐漸占主導地位，微生物菌落多樣性降低通常作為青貯發(fā)酵成功的標志［32］，本試驗中，隨糖蜜添加量的增加，菌群的多樣性線性降低，表明添加糖蜜加速了青貯發(fā)酵進程。在門水平上，青貯原料的微生物群落結構受原料種類的影響較小，辣木葉［31］和全株玉米［22］均以厚壁菌門和變形菌門為主，與本研究結果一致。但在屬水平上，不同青貯原料的微生物群落結構存在較大差異，如全株玉米以明串珠菌屬（Leuconostoc）和克雷白氏桿菌屬（Klebsiella）為主，全株大豆以腸桿菌屬和泛菌屬（Pantoea）為主［30］，辣木葉以微小桿菌屬（Exiguobacterium）和不動桿菌屬（Acinetobacter）為主［31］。本試驗中，CK組和M5組的優(yōu)勢菌屬為魏斯氏菌屬，M10和M20組的優(yōu)勢菌屬由魏斯氏菌屬轉變?yōu)槿闂U菌屬，其原因可能是魏斯氏菌屬主要在青貯發(fā)酵前期發(fā)揮作用，在發(fā)酵后期數(shù)量會發(fā)生下降［35］，糖蜜作為發(fā)酵促進劑加快發(fā)酵進程的同時降低了魏斯氏菌屬的數(shù)量。本試驗中，添加糖蜜可顯著降低Clostridium_sensu_stricto_12和腸桿菌屬的比例，Clostridium_sensu_stricto_12與CK組高NH3-N/TN和高丁酸含量直接相關［28］；腸桿菌屬為無芽孢兼性厭氧菌，可發(fā)酵糖和乳酸產(chǎn)生乙酸，增加干物質(zhì)損失，降低飼料營養(yǎng)價值［30］。因此，糖蜜可影響雜交構樹青貯的微生物群落結構，降低有害微生物的數(shù)量。

4 結論

雜交構樹青貯中添加糖蜜對其營養(yǎng)價值和發(fā)酵品質(zhì)均有不同程度的提升作用，并可增加乳桿菌屬的比例，同時降低Clostridium_sensu_stricto_12和腸桿菌屬等有害微生物的數(shù)量。本試驗條件下，添加20 g/kg糖蜜，雜交構樹青貯的營養(yǎng)價值和發(fā)酵品質(zhì)最優(yōu)。