喉鱗狀細(xì)胞癌生物標(biāo)志物的研究進(jìn)展*

沈海龍 朱君偉 韓燕勛 王大明 劉業(yè)海

喉癌是頭頸部第二大常見的惡性腫瘤，超過90%以上的喉癌病理類型屬于喉鱗狀細(xì)胞癌（laryngeal squamous cell carcinoma,LSCC）。在全球范圍內(nèi)，喉癌每年影響約65萬(wàn)人，并且奪走35萬(wàn)人的生命[1]。在美國(guó)喉癌的5年生存率在過去40年里從66%下降到63%，而在國(guó)內(nèi)喉癌的5年生存率約為77%[2]，因此喉癌的早期診斷、早期治療、疾病監(jiān)測(cè)和預(yù)后判斷對(duì)于提高喉癌患者的生存率具有重要的意義。腫瘤標(biāo)志物指特征性存在于惡性腫瘤細(xì)胞，或由惡性腫瘤細(xì)胞異常產(chǎn)生的物質(zhì)，或是宿主對(duì)腫瘤的刺激反應(yīng)而產(chǎn)生的物質(zhì)，能反映腫瘤發(fā)生、發(fā)展，監(jiān)測(cè)腫瘤對(duì)治療的反應(yīng)。有些編碼基因通過轉(zhuǎn)錄RNA及翻譯蛋白質(zhì)可以直接或間接地促進(jìn)喉癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移?；|(zhì)金屬蛋白酶和細(xì)胞因子是其中比較特殊的蛋白質(zhì)，本文進(jìn)行了重點(diǎn)闡述。非編碼RNA和外泌體是當(dāng)下喉癌生物標(biāo)志物的研究熱點(diǎn)，研究進(jìn)展也很迅速。希望通過本篇綜述，能為喉癌生物標(biāo)志物的相關(guān)基礎(chǔ)和臨床研究提供思路。

1 基因

有多個(gè)與喉癌發(fā)生及發(fā)展相關(guān)的編碼基因，通過轉(zhuǎn)錄RNA及翻譯蛋白質(zhì)直接或間接地促進(jìn)了喉癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。殷文娟等[3]通過免疫組化等方法檢測(cè)106例喉癌組織和13例癌旁組織，發(fā)現(xiàn)BRAP在喉癌組織中高表達(dá)，并且其表達(dá)量與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期密切相關(guān)。生存分析顯示，BRAP低表達(dá)組患者生存率明顯高于BRAP高表達(dá)組。有研究表明[4]，與早期喉癌患者相比，晚期喉癌患者BCL2L12表達(dá)水平明顯下降，因此BCL2L12可以作為晚期喉癌患者的預(yù)后標(biāo)志物。龔志濤等[5]通過免疫組化等實(shí)驗(yàn)技術(shù)得出PCDH20在喉癌組織中的表達(dá)水平與淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)，表達(dá)量較低的LSCC患者預(yù)后較差?；虍a(chǎn)物可能是通過影響各種信號(hào)通路，促進(jìn)或是抑制腫瘤進(jìn)展。Ni等[6]研究了Spondin-2基因在喉癌中的作用，Spondin-2沉默可導(dǎo)致LSCC細(xì)胞中AKT（protein kinase B,蛋白激酶B）和PI3K（phosphatidylinositol 3-kinase,磷脂酰肌醇3-激酶）失活，因此Spondin-2可能通過激活PI3K/AKT信號(hào)通路促進(jìn)了喉癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。Sheng等[7]學(xué)者采用qRT-PCR（quantitative real-time Polymerase Chain Reaction,熒光實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）等試驗(yàn)技術(shù)證實(shí)PLOD2過表達(dá)增加了Hep-2細(xì)胞的類癌癥干細(xì)胞的特點(diǎn)，激活了Wnt信號(hào)通路，使喉癌細(xì)胞在體內(nèi)外都產(chǎn)生了耐藥性?；騿?dòng)子或者基因甲基化對(duì)喉癌的發(fā)生發(fā)展同樣重要，甲基化水平可以作為L(zhǎng)SCC的診斷和預(yù)后標(biāo)志物。Fan[8]的研究表明LMX1B基因體甲基化的增加是其表達(dá)上調(diào)的重要機(jī)制。在基因體的CpG位點(diǎn)當(dāng)中，cg13600622和cg14204784甲基化水平可能是比LMX1B mRNA（messenger RNA,信使RNA）更好的預(yù)后標(biāo)志物。ESRRG啟動(dòng)子甲基化程度在喉癌組織中高于癌旁組織，并且高甲基化與不良預(yù)后相關(guān)。提示ESRRG啟動(dòng)子甲基化可以作為喉癌診斷和預(yù)后的標(biāo)志物[9]。一項(xiàng)吉林大學(xué)第二附屬醫(yī)院的研究[10]通過對(duì)50例喉癌及對(duì)照組的免疫組化檢測(cè)得出，CCTα（phosphatidylcholine cytidine transferase α,磷脂酰膽堿苷轉(zhuǎn)移酶α）可以作為L(zhǎng)SCC的新的診斷標(biāo)志物。CCTα在喉癌組織中表達(dá)明顯增加是因?yàn)榛虻募谆瘻p少。與喉癌相關(guān)的基因可能通過調(diào)節(jié)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）過程影響了喉癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。陳莉莉等[11]發(fā)現(xiàn)B7-H4廣泛表達(dá)于人喉癌細(xì)胞中，并與EMT（epithelial-mesenchymal transition,上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化）標(biāo)志物共表達(dá)，可能通過促進(jìn)EMT進(jìn)程導(dǎo)致喉癌的侵襲及轉(zhuǎn)移。Marioni等[12]發(fā)現(xiàn)Nm23-H1在復(fù)發(fā)的喉癌患者中表達(dá)量明顯下降。因此可以用來(lái)預(yù)測(cè)喉癌的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。與喉癌相關(guān)基因的最新研究情況見表1。

表1 喉癌相關(guān)基因的最新研究

2 基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase,MMPs）

MMPs是與腫瘤發(fā)生相關(guān)的蛋白酶家族中最重要的一類，它們可以引起腫瘤微環(huán)境的改變。Fang等[13]用高通量測(cè)序等技術(shù)研究，MMP1和MMP2在正常組織中含量極低，而在喉癌組織中高表達(dá)，它們可以作為L(zhǎng)SCC診斷的標(biāo)志物。MMP1是由腫瘤細(xì)胞和腫瘤間質(zhì)產(chǎn)生，可裂解細(xì)胞外基質(zhì)成分，在腫瘤侵襲中起重要作用[14]。而MMP2對(duì)于纖維性膠原碎片的降解至關(guān)重要，這種降解促進(jìn)了腫瘤的侵襲和進(jìn)展，因?yàn)镮V型膠原是基底膜的主要成分。MMP2的另一個(gè)重要作用是通過促進(jìn)EMT過程，為癌癥的增殖和進(jìn)展創(chuàng)造適宜的微環(huán)境。有文獻(xiàn)報(bào)道了miR-744-3p控制的一種新的調(diào)控途徑，它可以增強(qiáng)MMP-9在喉鱗癌中的表達(dá)，而MMP-9通過降解周圍細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原基質(zhì)促進(jìn)喉癌細(xì)胞遷移[15]。因此MMP1、MMP2、MMP9都與喉癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，可以作為喉癌的診斷和預(yù)后標(biāo)志物。

3 細(xì)胞因子

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）在腫瘤血管生成中發(fā)揮著重要作用，腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移離不開血管生長(zhǎng)。德國(guó)學(xué)者的一項(xiàng)研究指出，VEGF是在喉癌早期階段的有效預(yù)后標(biāo)志物[16]。CCL18是M2型腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，參與了多個(gè)惡性腫瘤的進(jìn)展過程。CCL18的表達(dá)量與喉癌的原發(fā)部位、腫瘤分級(jí)、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)等因素相關(guān)，低表達(dá)CCL18組的喉癌患者5年生存期更長(zhǎng)。因此CCL18可以作為喉癌的一個(gè)預(yù)后標(biāo)志物[17]。肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（hepatocyte growth factor,HGF）是間充質(zhì)細(xì)胞因子，作為有效的促分裂原和促運(yùn)動(dòng)劑在腫瘤進(jìn)展中起作用。王艷婷等[18]的研究指出，晚期和惡性程度高的LSCC患者血清HGF濃度顯著高于早期和惡性程度低的患者。高HGF組喉癌患者5年期生存率顯著低于低HGF組患者。HGF/c-Met信號(hào)傳導(dǎo)途徑可能是HGF調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生的重要途徑。而巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子（macrophage migration inhibitory factor,MIF）、糖原合成激酶-3(glycogen synthase kinase-3,GSK-3β)可能通過促進(jìn)EMT過程影響了喉癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，可以用來(lái)判斷喉癌的惡性程度及預(yù)后[19]。

4 非編碼RNA

對(duì)于人類基因組來(lái)說，大約98%的基因是非編碼的，非編碼RNA可以在基因調(diào)控的各個(gè)方面都發(fā)揮著功能作用，如表觀遺傳調(diào)控、染色體失活、基因組印記、核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、轉(zhuǎn)錄和mRNA剪接等?？梢宰鳛楹戆┥飿?biāo)志物的非編碼RNA主要是指微小RNA(microRNA,miRNA)和長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long no-coding RNA,lncRNA）。喉鱗狀細(xì)胞癌與非編碼RNA的相關(guān)研究是當(dāng)下喉癌生物標(biāo)志物的研究熱點(diǎn)。

miRNA是一種單鏈非編碼小分子RNA，長(zhǎng)度約為19～25個(gè)核苷酸，在腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。miRNA表達(dá)失調(diào)在各種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要的作用，可能成為理想的腫瘤治療靶點(diǎn)。Fang等[20]研究者通過對(duì)96例喉癌及癌旁組織的研究發(fā)現(xiàn)，LSCC中miR-29c-3p表達(dá)下調(diào)與腫瘤范圍、惡性程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等因素相關(guān)。并且miR-29c-3p低表達(dá)組的喉癌患者預(yù)后較差。miR-29c可抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，并在G1期阻滯腫瘤細(xì)胞增殖[21]。Gao等[22]學(xué)者發(fā)現(xiàn)，miR-145-5p過表達(dá)或FSCN1敲低可以抑制EMT過程并誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和凋亡，從而抑制LSCC的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移。Wang等[23]使用RTPCR等方法檢測(cè)了52例LSCC患者和49例聲帶息肉患者的血清標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)臨床分期較晚和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的LSCC患者血清miR-21水平較高。一項(xiàng)國(guó)外的微陣列分析和qRT-PCR分析顯示[24]，miR-221在喉癌患者血清樣本中上調(diào)，而手術(shù)后血清樣本miR-221處于正常水平。因此miR-21可以用于喉癌的診斷及病情監(jiān)測(cè)。一些文獻(xiàn)也闡述了miRNA調(diào)控基因或者信號(hào)通路的可能機(jī)制。Zhang等[25]使用miRNA芯片分析了LSCC組織中的miRNA表達(dá)，發(fā)現(xiàn)喉癌組織中miR-143-3p較正常組織明顯下調(diào)。miR-143-3p可能通過靶向k-Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。Zhao等[26]發(fā)現(xiàn)miR-196b在體外通過直接抑制SOCS2的表達(dá)，促進(jìn)LSCC細(xì)胞的增殖和侵襲，抑制細(xì)胞凋亡。此外，miR-196b是LSCC患者總體生存的獨(dú)立預(yù)后因素。Lucas等[27]的研究指出喉癌組與健康對(duì)照組相比，術(shù)前LSCC患者血清中miR-31、miR-141、miR-149a、miR-182、LET-7a、miR-4853p、miR-122、miR-33表達(dá)水平升高，而miR-145、miR-223、miR-133a表達(dá)水平明顯下降。其中miR-31、LET-7a和miR-33作為新的、無(wú)創(chuàng)的LC診斷的生物標(biāo)志物價(jià)值最高。miRNA與喉癌關(guān)系的最新研究情況，見表2。

表2 miRNA與喉癌關(guān)系的最新研究

lncRNA是指長(zhǎng)度超過200個(gè)核苷酸的一類特殊RNA，沒有編碼蛋白質(zhì)的功能，但是卻參與調(diào)控腫瘤發(fā)生和發(fā)展的多個(gè)進(jìn)程。Tang等[29]用qRT PCR等技術(shù)驗(yàn)證了lncRNA DGCR5可以通過下調(diào)miR-506增加Wnt信號(hào)通路活性。汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院的一項(xiàng)研究提示SNHG1在癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織，SNHG1敲除可通過抑制EMT來(lái)抑制HEp-2細(xì)胞的侵襲和遷移[30]。不具有編碼蛋白質(zhì)功能的lncRNA需要通過一些調(diào)節(jié)軸來(lái)實(shí)現(xiàn)其功能。Xu等[31]研究者認(rèn)為PCAT19基因的下調(diào)，可能通過調(diào)節(jié)miR 182/PDK4軸在體內(nèi)抑制了喉癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。Zhang等[32]研究者發(fā)現(xiàn)了新的調(diào)節(jié)軸CCAT1-miR218-ZFX（其中CCAT1為lncRNA）在喉癌的增殖和轉(zhuǎn)移過程中起到非常重要的作用。LncRNA可以通過影響靶基因的甲基化狀態(tài)，從而影響基因表達(dá)。Wu等[33]的研究證實(shí)H19通過抑制miR-148a-3p增加DNA甲基化，從而促進(jìn)了LSCC的進(jìn)展。在河南省人民醫(yī)院進(jìn)行的一項(xiàng)研究[34]，證明了lncRNA SOX2-OT的過表達(dá)在體外實(shí)驗(yàn)中促進(jìn)了LSCC細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲，抑制了細(xì)胞凋亡。SOX2-OT主要通過促進(jìn)抑癌基因PTEN啟動(dòng)子甲基化，從而下調(diào)其表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)這一功能的。以上這六種lncRNA都在喉癌組織中高表達(dá)，同樣也存在低表達(dá)的lncRNA。Xie等[35]研究者發(fā)現(xiàn)相比于癌旁組織，喉癌組織中LinRNA Dleu2含量明顯降低，通過轉(zhuǎn)染技術(shù)上調(diào)lncRNA Dleu2明顯抑制了喉癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。有研究者發(fā)現(xiàn)lncRNA RP11-169D4.1可以作為喉癌的抑癌基因和治療靶點(diǎn)，它是通過調(diào)控CDH1來(lái)抑制EMT的進(jìn)程，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[36]，與喉癌相關(guān)的lncRNA的最新研究情況，見表3。

表3 與喉癌相關(guān)的lncRNA的最新研究

5 外泌體

外泌體是當(dāng)前喉癌標(biāo)志物的研究熱點(diǎn)之一。外泌體是細(xì)胞外囊泡的最小子集，存在于細(xì)胞外空間和液體中，如血液、尿液和唾液。腫瘤來(lái)源的外泌體通過細(xì)胞間通訊和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)參與腫瘤發(fā)展的各個(gè)階段。臨床分期較晚和總生存期較短的頭頸部鱗狀細(xì)胞癌患者血漿外泌體水平升高，提示血漿外泌體可能用于監(jiān)測(cè)頭頸部腫瘤進(jìn)展[37]。賈園靜等[38]研究者通過對(duì)喉癌和下咽癌患者血清外泌體進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)喉癌組及下咽癌組的外泌體濃度與正常人相比顯著增加，是十分有潛力的腫瘤標(biāo)志物。

小結(jié)

LSCC中被研究的腫瘤標(biāo)志物種類越來(lái)越多，這些都將有助于喉癌的早期診斷、早期治療、判斷預(yù)后及疾病監(jiān)測(cè)。在基因?qū)用娴难芯繉⒂兄贚SCC患者的靶向治療。近年來(lái)喉癌標(biāo)志物的研究熱點(diǎn)是miRNA和lncRNA，研究者們發(fā)現(xiàn)，這些以前被忽視的RNA與喉癌的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移都存在著密切的聯(lián)系。盡管這幾年相關(guān)研究進(jìn)展迅速，但是并沒有發(fā)現(xiàn)喉鱗狀細(xì)胞癌高度特異的非編碼RNA。對(duì)臨床上喉癌的診斷和治療幫助不大，miRNA和lncRNA的檢測(cè)具有高度穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)，可以在血清，血漿，唾液等體液檢測(cè)中得到快速的結(jié)果，并可以在治療前后反復(fù)檢測(cè)。因此，期望著這方面的研究可以找出特異性的喉癌診斷和預(yù)后標(biāo)志物，從而為提高喉癌患者的生存率提供幫助。