低鋅飼糧中添加載鋅蒙脫石對肉雞組織微量元素含量、肝臟酶活性及空腸鋅轉(zhuǎn)運蛋白基因表達的影響

秦士貞 王海波 武真邑 龔莉媛 裴文剛 車育彥 楊敏敏 史兆國

(甘肅農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，蘭州 730070)

鋅源直接影響組織中鋅、銅、鐵、錳等微量元素的吸收和機體正常代謝功能。鋅在腸道轉(zhuǎn)運過程中通過金屬硫蛋白(MT)、鋅轉(zhuǎn)運蛋白(ZnT)、轉(zhuǎn)鐵蛋白家族中的二價陽離子轉(zhuǎn)運蛋白1(DMT1)和調(diào)控鋅轉(zhuǎn)運蛋白的金屬效應元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子-1(MTF-1)共同參與腸道對鋅等二價離子的轉(zhuǎn)運，共同作用下調(diào)節(jié)機體內(nèi)鋅的動態(tài)平衡[1]。Bao等[2]在研究肉雞飼糧中微量元素的交互作用時發(fā)現(xiàn)，在鋅、鐵、錳和銅4種元素中，鋅是第一限制性元素，鋅缺乏時會阻礙鐵、錳和銅的吸收；且鋅參與機體酶和功能蛋白的組成密切相關(guān)，并介導腸道離子轉(zhuǎn)運，促進絨毛發(fā)育[3-4]。但鋅的吸收利用容易受飼料原料(螯合物、蛋白質(zhì)、微量元素)、動物品種、鋅存在形式的影響。飼料鋅源常采用的無機鋅易吸潮結(jié)塊破壞飼糧中的維生素及其他活性營養(yǎng)物質(zhì)[5]。在正常條件下，攝入鋅的94%會被排出體外，只有6%會在體內(nèi)積累[6]，利用率低。

蒙脫石、沸石等具有表面積大、吸附能力強、陽離子交換和黏附能力高的特征，通過金屬元素的富集和離子對其改性后，能提高金屬元素的利用率[7]，使其在動物腸道內(nèi)合理釋放，減少微量元素對環(huán)境的污染，并結(jié)合毒素、細菌和病毒，減少腸道損傷，保護腸道健康[8-9]。秦士貞等[10]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加載鋅蒙脫石(Zn-MMT)能顯著提高小腸絨毛高度和絨毛高度/隱窩深度，降低小腸隱窩深度。目前關(guān)于Zn-MMT對肉雞組織金屬元素含量、含鋅酶活性的研究報道較少，可以通過組織中鋅的含量及肝臟含鋅堿性磷酸酶活性來評價機體鋅的營養(yǎng)狀況[11]。因此，本試驗擬在玉米-豆粕型基礎(chǔ)飼糧(低鋅飼糧)中添加Zn-MMT，研究其對肉仔雞組織礦物元素含量、肝臟含鋅酶活性及腸道鋅轉(zhuǎn)運蛋白基因表達影響的研究，為Zn-MMT的合理利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用Zn-MMT(赤峰某生化工有限公司提供)，經(jīng)蘭州中檢科測試技術(shù)有限公司檢測，其中鋅含量為10 408.80 mg/kg 。

1.2 試驗設(shè)計

采用單因子完全隨機試驗設(shè)計，選擇1日齡健康科寶公雛240只，按體重一致原則隨機分成5組，每組6個重復，每個重復8只雞。對照組飼喂基礎(chǔ)飼糧(低鋅飼糧)，4個試驗組分別在低鋅飼糧中添加20、40、60和80 mg/kg Zn-MMT (均以鋅含量計算)替代預混料的載體，試驗期為42 d。

1.3 試驗動物及管理

試驗于2019年10月26日—2019年12月7日在甘肅農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院實訓中心進行，試驗肉雞采用3層籠養(yǎng)，飼養(yǎng)管理和常規(guī)免疫按照《科寶肉仔雞飼養(yǎng)管理手冊》進行，采用24 h恒定光照，雞只自由采食、飲水。

1.4 基礎(chǔ)飼糧

基礎(chǔ)飼糧參照T/CFIAS 002—2018《蛋雞、肉雞配合飼料》和NRC(1994)配制，為玉米-豆粕型粉料，其組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎(chǔ))

續(xù)表1項目 Items1～21日齡 1 to 21 days of age22～42日齡 22 to 42 days of age營養(yǎng)水平 Nutrient levels4)代謝能 ME/(MJ/kg)12.4813.05粗蛋白質(zhì) CP20.0118.60鈣 Ca1.261.02有效磷 AP0.500.41賴氨酸 Lys1.251.12蛋氨酸 Met0.510.50蛋氨酸+半胱氨酸 Met+Cys0.880.86鋅 Zn/(mg/kg)5)27.6227.08

1.5 指標測定與方法

分別于肉雞21和42日齡，每重復隨機選取1只接近平均體重的肉雞進行屠宰，測定組織微量元素含量、肝臟抗氧化能力及含鋅酶活性及42日齡空腸鋅轉(zhuǎn)運蛋白的表達。

1.5.1 微量元素含量的測定

快速采集胸肌、腿肌、肝臟、胰腺、脛骨、全血，并-20 ℃冰箱保存至分析。參考NY/T 3318—2018標準，準確稱取組織3～5 g放入30 mL的坩堝中，緩慢加熱炭化至無煙后，將其轉(zhuǎn)入550 ℃高溫爐中灰化，直至樣品變成灰白色，加2 mL的超純水和10 mL 50%的硝酸溶液溶解蒸干，隨后采用5 mL 50%的硝酸溶液加熱溶解殘渣，經(jīng)超純水將其轉(zhuǎn)移至50 mL的容量瓶冷卻定容，經(jīng)定量濾紙過濾，采用Agilent Technologies 200 series AA火焰原子吸收儀測定組織中的鐵、錳、鋅、銅含量。

1.5.2 肝臟抗氧化能力及含鋅酶活性或含量的測定

采集肝臟組織，經(jīng)液氮速凍后，在-80 ℃冰箱中保存直至分析，并送甘肅碩聯(lián)生物技術(shù)有限公司，采用上海酶聯(lián)生物科技有限公司提供的試劑盒測定肝臟的丙二醛(MDA)含量、總抗氧化能力(T-AOC)，銅鋅超氧化物歧化酶(CuZn-SOD)、乳酸脫氫酶(LDH)含量，堿性磷酸酶(ALP)、蘋果酸脫氫酶(MDH)活性。

1.5.3 肉雞42日齡空腸鋅轉(zhuǎn)運蛋白基因表達的測定

表2 目的基因及內(nèi)參基因引物

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2013處理后，采用SPSS 26.0進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，用Duncan氏法進行多重比較，試驗結(jié)果以“平均值±標準差(SD)”表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 低鋅飼糧添加Zn-MMT對肉雞組織微量元素含量的影響

2.1.1 低鋅飼糧添加Zn-MMT對肉雞組織鐵元素含量的影響

由表3可知，低鋅飼糧添加Zn-MMT可顯著影響21日齡脛骨和42日齡胰腺及全血中鐵的含量(P<0.05)，但對21日齡胸肌、腿肌、肝臟、胰腺、全血及42日齡的胸肌、腿肌、肝臟、脛骨中鐵含量均無顯著影響(P>0.05)。相比CK組，低鋅飼糧添加Zn-MMT顯著降低21日齡脛骨中鐵的含量(P<0.05)，同時添加60和80 mg/kg的Zn-MMT顯著降低42日齡胰腺中鐵的含量(P<0.05)，添加40 mg/kg的Zn-MMT顯著提高42日齡全血中鐵的含量(P<0.05)。但對21日齡胸肌、腿肌、肝臟、胰腺、全血及42日齡的胸肌、腿肌、肝臟、脛骨中鐵含量均無顯著影響(P>0.05)。

2.1.2 低鋅飼糧添加Zn-MMT對肉雞組織錳元素含量的影響

由表4可知，低鋅飼糧添加Zn-MMT對21日齡胸肌、腿肌、肝臟、脛骨和全血及42日齡肝臟及全血中錳的含量無顯著影響(P>0.05)，但顯著影響21日齡胰腺和42日齡胸肌、腿肌、脛骨及胰腺中錳的含量(P<0.05)。相比CK組，低鋅飼糧添加40、60和80 mg/kg的Zn-MMT顯著提高21日齡胰腺中錳的含量(P<0.05)，但顯著降低42日齡脛骨和胰腺中錳的含量(P<0.05)。且添加40 mg/kg的Zn-MMT顯著提高42日齡胸肌和腿肌中錳的含量(P<0.05)。

2.1.3 低鋅飼糧添加Zn-MMT對肉雞組織銅元素含量的影響

由表5可知，低鋅飼糧添加Zn-MMT對21日齡腿肌、肝臟、脛骨、胰腺和全血及42日齡腿肌、肝臟、脛骨和全血中銅的含量無顯著影響(P>0.05)，但顯著影響21和42日齡胸肌及42日齡胰腺中銅的含量(P<0.05)。相比CK組，低鋅飼糧添加20 mg/kg的Zn-MMT顯著提高21日齡胸肌中銅的含量(P<0.05)；添加40和60 mg/kg的Zn-MMT能顯著提高42日齡胸肌中銅的含量(P<0.05)，但是添加80 mg/kg的Zn-MMT顯著降低胰腺中銅的含量(P<0.05)。

表3 低鋅飼糧添加Zn-MMT對肉雞組織鐵元素含量的影響

表4 低鋅飼糧添加Zn-MMT對肉雞組織錳元素含量的影響

表5 低鋅飼糧添加Zn-MMT對肉雞組織銅元素含量的影響

2.1.4 低鋅飼糧添加Zn-MMT對肉雞組織鋅元素含量的影響

由表6可知，低鋅飼糧添加Zn-MMT對21日齡胸肌、腿肌及42日齡腿肌中鋅的含量無顯著影響(P>0.05)，但顯著影響21和42日齡肝臟、脛骨、胰腺、全血及42日齡胸肌重鋅的含量(P<0.05)。相比CK組，低鋅飼糧添加Zn-MMT對21日齡胸肌中鋅元素無顯著影響(P>0.05)，且顯著提高42日齡脛骨及21日齡全血中鋅元素的含量(P<0.05)，但添加60和80 mg/kg的Zn-MMT顯著降低42日齡胸肌中鋅元素的含量(P<0.05)，顯著提高21和42日齡胰腺中鋅的含量及21日齡肝臟中鋅含量(P<0.05)。低鋅飼糧添加Zn-MMT對21和42日齡的腿肌中鋅含量無顯著影響(P>0.05)。低鋅飼糧添加40、60和80 mg/kg的Zn-MMT顯著增加42日齡肝臟及21日齡脛骨中鋅的含量(P<0.05)，同時添加40和80 mg/kg的Zn-MMT顯著增加42日齡全血中鋅元素的含量(P<0.05)。

表6 低鋅飼糧添加Zn-MMT對肉雞組織鋅元素含量的影響

2.2 低鋅飼糧添加Zn-MMT對肉雞肝臟含鋅酶活性或含量和抗氧化能力的影響

由表7可知，低鋅飼糧添加Zn-MMT對21及42日齡肉雞肝臟ALP、MDH活性，LDH、 CuZn-SOD含量，MDA含量及T-AOC均無顯著影響(P>0.05)。

表7 低鋅飼糧添加Zn-MMT對肉雞肝臟含鋅酶活性或含量和抗氧化能力的影響

2.3 低鋅飼糧添加Zn-MMT對肉雞空腸鋅轉(zhuǎn)運蛋白基因表達的影響

由表8可知，低鋅飼糧添加載鋅蒙脫石顯著影響肉雞空腸DMT1、MT、MT3、鋅轉(zhuǎn)運載體-2(ZnT-2)、鋅轉(zhuǎn)運載體-5(ZnT-5)的基因相對表達量(P<0.05)，但對金屬效應元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子-1(MTF-1)基因相對表達量無顯著的影響(P>0.05)。相比CK組，添加Zn-MMT顯著提高空腸ZnT-5基因相對表達量(P<0.05)，但對MTF-1基因相對表達量無顯著影響(P>0.05)。且添加20和40 mg/kg的Zn-MMT顯著提高空腸DMT1基因相對表達量(P<0.05)。添加40、60和80 mg/kg的Zn-MMT顯著提高空腸MT3基因相對表達量(P<0.05)，且同時添加60和80 mg/kg的Zn-MMT顯著提高空腸MT、ZnT-2基因相對表達量(P<0.05)。

3 討 論

3.1 低鋅飼糧添加Zn-MMT對肉雞組織微量元素含量的影響

鋅作為肉雞生長發(fā)育過程中必需微量元素，參與調(diào)節(jié)機體酶和功能蛋白密活性，并對組織中鋅、銅、鐵、錳等微量元素的吸收和機體正常代謝功能密切相關(guān)，在飼糧鋅缺乏時會阻礙鐵、錳和銅在機體的利用[2,15-16]。其中，骨鋅含量是家禽鋅利用最敏感參數(shù)[11]；胰腺是對飼糧鋅含量最敏感的組織[17]，為評價肉仔雞鋅需要量的重要指標。同時，肝臟作為主要的礦物質(zhì)儲存和鋅周轉(zhuǎn)代謝速率最快的器官[6]，與胰腺、脛骨、血液共同反映機體鋅營養(yǎng)水平。秦士貞等[10]在本試驗前期的研究中發(fā)現(xiàn)，低鋅飼糧中添加Zn-MMT對全期肉雞生長性能、胸肌率、腿肌率均無顯著影響。對于前期腸道系統(tǒng)尚未發(fā)育完整、消化酶分泌不足的幼雛，由于Zn-MMT特殊的結(jié)構(gòu)和理化特性，在腸道中吸附有害物質(zhì)的同時吸附其他營養(yǎng)，對前期生長性能產(chǎn)生不利影響，當添加量超過60 mg/kg時，降低肉雞1～21日齡的平均日增重。然而，Zn-MMT又能使鋅在動物腸道內(nèi)合理釋放，提高鋅的生物學效率[7-8]，促進腸絨毛發(fā)育，維持肉雞腸道結(jié)構(gòu)完整性，促進肉雞腸道發(fā)育[10]。Li等[6]的研究發(fā)現(xiàn)，載鋅硅酸鹽具有良好的生物利用，并能增強鋅轉(zhuǎn)運相關(guān)蛋白在蛋雞空腸的表達，促進鋅的轉(zhuǎn)運吸收。Ao等[18]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加鋅可以增加脛骨和血液中鋅含量，同時含鋅坡縷石可提高肉仔雞脛骨和血液中鋅含量[19]。同時，閆素梅等[20]研究結(jié)果表明，飼糧鋅水平在47.61～87.61 mg/kg時，肉仔雞肝臟與脛骨的鋅含量相對

穩(wěn)定。本試驗研究結(jié)果顯示，低鋅飼糧添加Zn-MMT顯著提高21日齡血液中鋅的含量，且添加60和80 mg/kg Zn-MMT顯著提高肝臟、胰腺中鋅含量，其含量達到40 mg/kg能顯著提高脛骨中鋅含量。這與楊雪[16]研究發(fā)現(xiàn)載鋅硅酸鹽黏土對肉雞肝臟、脛骨、胰腺鋅沉積的結(jié)果相似。各種礦物元素在機體內(nèi)作用關(guān)系錯綜復雜，相互影響，表現(xiàn)為協(xié)同與拮抗作用。由于鋅與銅化學性質(zhì)相似，銅、鋅之間適當?shù)呐浔染哂袇f(xié)同作用，反之發(fā)生頡頏作用[21]。劉雨龍等[22]研究發(fā)現(xiàn)，雞組織和器官中銅的含量隨著飼糧鋅添加量的提高呈下降趨勢。本試驗結(jié)果表明，低鋅飼糧添加80 mg/kg的Zn-MMT顯著降低肉雞前期胸肌和脛骨及后期胰腺中銅、鐵、錳的含量，且添加20 mg/kg的Zn-MMT顯著提高前期胸肌中的銅含量，添加40 mg/kg的Zn-MMT顯著提高后期胸肌與全血中的銅含量，及后期胸肌、腿肌中錳的含量，這與楊偉麗[23]發(fā)現(xiàn)的20和40 mg/kg的載鋅硅酸鹽黏土可促進雞肉中的銅沉積結(jié)果相似。這可能和鋅、鐵、銅、錳等二價金屬元素會競爭結(jié)合配體和共同的代謝渠道有關(guān)[24]及組織對鋅的敏感性、代謝強度及鋅離子的釋放有關(guān)。

表8 低鋅飼糧添加Zn-MMT對肉雞空腸鋅轉(zhuǎn)運蛋白基因表達量的影響

3.2 低鋅飼糧添加Zn-MMT對肉雞肝臟含鋅酶活性或含量及抗氧化功能的影響

正常生理環(huán)境下，機體主要靠內(nèi)源性酶系和非酶系的維生素、微量元素及外源性礦物質(zhì)、中草藥等抗氧化劑共同維持體內(nèi)自由基的動態(tài)平衡。適量補鋅可影響動物體內(nèi)CuZn-SOD、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH)活性和MT表達，保護動物體免受自由基損傷，增強機體抗氧化能力[25]。飼糧鋅攝入量直接影響動物組織器官中鋅酶的活性，從而影響機體相關(guān)代謝活動，其最具有代表性的為抗氧化酶防御系統(tǒng)中CuZn-SOD和糖代謝中的ALP活性變化，在一定范圍內(nèi)ALP和LDH活性與飼糧中鋅含量呈正相關(guān)[13,26]。同時，沸石能夠在一定程度上提高ALP活性[27]，且載鋅沸石提高肝臟ALP、LDH、MDH活性，但缺鋅可引起肝臟CuZn-SOD活性下降,適量補鋅可恢復[28]。同時，黃艷玲等[29]、蔣宗勇等[30]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧鋅水平對肝臟CuZn-SOD活性無顯著影響，但載鋅沸石可提高肉雞肝臟[13]、空腸[31]中CuZn-SOD活性，降低胸肌、腿肌中的MDA含量，提高T-AOC[16]。在本試驗中，飼糧中添加Zn-MMT對21及42日齡肉雞肝臟ALP、MDH活性，LDH、CuZn-SOD含量，MDA含量及T-AOC均無顯著影響。這與馬芳[32]研究發(fā)現(xiàn)的不同鋅水平對肉雞42日齡ALP、LDH活性無顯著影響的結(jié)果相似。但李林楓[26]在蛋雞中的研究結(jié)果出現(xiàn)差異。這可能是因為基礎(chǔ)飼糧中的鋅水平已經(jīng)能夠滿足肉雞機體ALP、LDH、MDH、CuZn-SOD發(fā)揮正常功能。同時，劉澤輝[33]報道發(fā)現(xiàn)，飼糧鋅水平對肉雞肝臟MDH活性無顯著影響；且Zn-MMT吸附氧自由基，并其進入胃腸道后可以延緩鋅離子在肉雞腸黏膜中的作用時間，充分發(fā)揮鋅的生物學功能，保持機體正常代謝中產(chǎn)生的自由基處于動態(tài)平衡，維持機體免受氧化應激[13]。

3.3 低鋅飼糧添加Zn-MMT對肉雞空腸鋅轉(zhuǎn)運蛋白基因表達的影響

鋅廣泛分布于動物體內(nèi)，家禽主要經(jīng)小腸進行吸收，部分經(jīng)腺胃吸收[22]，共同參與體內(nèi)300多種酶或蛋白的構(gòu)成和活性功能、養(yǎng)分和遺傳物質(zhì)代謝，介導腸道離子轉(zhuǎn)運，維持其穩(wěn)態(tài)[3-4,10]。這種平衡狀態(tài)主要由鋅轉(zhuǎn)運體(ZnT/SLC30A家族)、鋅鐵調(diào)控蛋白(ZIP/SLC39A家族)、MT和MTF-1這4類鋅指蛋白協(xié)調(diào)調(diào)控[34]，參與鋅的攝取、排泄、儲存和運輸全過程[6]。鋅通過MTF-1調(diào)控MT和ZnT維持機體鋅動態(tài)平衡，但不同ZnT的表達對飼糧鋅的敏感程度存在差異。在大鼠的試驗中發(fā)現(xiàn)，ZnT2對飼糧鋅反應最敏感[35]。在大鼠[36]、斷奶仔豬[37]及肉雞[38]的研究中發(fā)現(xiàn)MT的表達隨著鋅添加量的增加而增加，同時載鋅沸石可以提高蛋雞[35]和肉雞[12]鋅轉(zhuǎn)運體蛋白的表達。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，Zn-MMT未能顯著提高肉雞空腸MTF1基因相對表達量，這與Li等[6]在蛋雞中添加載鋅沸石的研究結(jié)果相同。但添加Zn-MMT顯著提高肉雞空腸ZnT5基因相對表達量，且20和40 mg/kg的Zn-MMT顯著提高肉雞空腸DMT1基因相對表達量。同時，60和80 mg/kg的Zn-MMT顯著提高肉雞空腸ZnT2、MT、MT3基因相對表達量。Zn-MMT的緩釋功能使其在腸道中緩慢釋放出鋅離子，增加鋅轉(zhuǎn)運蛋白表達，提高鋅離子的利用率，且Zn-MMT具有硅酸鹽礦物和鋅各自的生物學功能，能夠提高機體免疫力，改善胃腸道狀況[10,39]，為營養(yǎng)物質(zhì)的吸收創(chuàng)造良好的環(huán)境，從而促進鋅的吸收。

4 結(jié) 論

低鋅飼糧添加40 mg/kg的Zn-MMT，能顯著提高42日齡肉雞空腸DMT1、MT3、ZnT-5轉(zhuǎn)運體蛋白基因的表達，并提高肝臟、脛骨中鋅的含量和全血中的鐵、銅、鋅及腿肌中錳和胸肌錳、銅的含量，且鋅在肝臟、脛骨、胰腺、全血中的含量隨著Zn-MMT添加量的增加而增加，從而影響鐵、錳、銅在組織中的含量。