微生態(tài)制劑對種母雞生產(chǎn)性能、降血脂和抗氧化作用的研究

魏 帥 劉 慧 陳猜猜 張紅星 謝遠紅 金君華 熊利霞

(北京農(nóng)學院食品科學與工程學院，微生態(tài)制劑關(guān)鍵技術(shù)開發(fā)北京市工程實驗室，食品質(zhì)量與安全北京實驗室，北京 102206)

2020年農(nóng)業(yè)農(nóng)村部指出在飼糧中禁用除中草藥外其他促生長類藥物添加劑，開發(fā)綠色、安全、無公害的抗生素替代產(chǎn)品是畜禽養(yǎng)殖發(fā)展的必然趨勢[1]，微生態(tài)制劑因其天然的安全性具有明顯優(yōu)勢[2-3]。京紅1號種母雞品種是我國自主創(chuàng)新的新品種，具有生產(chǎn)性能優(yōu)越、繁殖力高和適應性強的特性，但是養(yǎng)殖過程種母雞會受到應激刺激、抵抗力下降、腸道功能紊亂、藥物殘留等影響，導致養(yǎng)殖成本不斷攀升、疫病防控形式嚴峻和食品質(zhì)量安全得不到保障，如何能夠提高種禽生產(chǎn)性能和養(yǎng)殖效益已成為當下研究的熱點。脂肪肝綜合征(fatty liver syndrome,FLS)又稱脂肝病，多數(shù)母雞產(chǎn)蛋后或產(chǎn)蛋率達不到高峰時才被發(fā)現(xiàn)患有FLS，主要是由于雞體內(nèi)脂肪代謝出現(xiàn)紊亂，大量脂類物質(zhì)沉積在肝臟，導致肝臟出現(xiàn)脂肪變性的一種營養(yǎng)代謝性疾病[4]。邢冠潤等[5]發(fā)現(xiàn)在飼糧中添加1×107CFU/g凝結(jié)芽孢桿菌微生態(tài)制劑可顯著提高產(chǎn)蛋后期蛋雞生產(chǎn)性能和免疫能力，改善蛋品質(zhì)和蛋雞腸道健康；于雷等[6]發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌微生態(tài)制劑能夠顯著提高京紅1號蛋雞產(chǎn)蛋率和平均蛋重，降低料蛋比。孫玲[7]研究在種母雞飼糧中添加微生態(tài)制劑發(fā)現(xiàn)能顯著降低血清甘油三酯(triglycerides,TG)、總膽固醇(total cholesterol,TC)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量，顯著增加血清高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL)含量、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性和總抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)，表明微生態(tài)制劑能有效提高種母雞的脂質(zhì)抗氧化能力。芽孢桿菌作為新型飼料添加劑，具有安全、高效、耐高溫、耐酸堿和抗逆性強等特點[8]。劉聰?shù)萚9]發(fā)現(xiàn)京紅1號種母雞感染沙門氏菌后，在基礎(chǔ)飼糧中添加2.5×1010CFU/kg的凝結(jié)芽孢桿菌可以明顯增強機體抗氧化能力，降低脂質(zhì)過氧化物MDA含量，緩解氧化應激；王騰等[10]在雪峰烏骨雞飼糧中添加枯草芽孢桿菌，血清中的T-AOC和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)活性顯著提高。目前有關(guān)副干酪乳桿菌KL1、枯草芽孢桿菌Liu-c1對京紅1號種母雞提高生產(chǎn)性能、FLS的預防及其抗脂質(zhì)過氧化能力的研究尚未見國內(nèi)外報道。因此，本文以京紅1號父母代種母雞為試驗對象，旨在研究基礎(chǔ)飼糧中添加副干酪乳桿菌KL1、枯草芽孢桿菌Liu-c1和副干酪乳桿菌KL1∶枯草芽孢桿菌Liu-c1=1∶1復合微生態(tài)制劑對種母雞生產(chǎn)性能和抗脂質(zhì)過氧化能力的影響，并觀察油紅O染色的肝臟組織切片和測定肝臟粗脂肪含量，為微生態(tài)制劑在種母雞生產(chǎn)應用提供科學的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗菌株

副干酪乳桿菌KL1(CGMCC No.11533)為本課題組高產(chǎn)膽鹽水解酶和胞外多糖的專利菌株；枯草芽孢桿菌Liu-c1(CGMCC No.20840)為本課題組高產(chǎn)中性蛋白酶和淀粉酶的專利菌株，上述菌株均在本課題組實驗室凍藏保存。

1.1.2 微生態(tài)制劑

將副干酪乳桿菌KL1和枯草芽孢桿菌Liu-c1的甘油保藏管分別經(jīng)活化、擴大培養(yǎng)、高密度發(fā)酵、離心濃縮和真空冷凍干燥后得到活菌數(shù)為8×1010CFU/g的副干酪乳桿菌KL1和枯草芽孢桿菌Liu-c1微生態(tài)制劑，將2種微生態(tài)制劑分別用麥芽糊精稀釋，得到活菌數(shù)為8×108CFU/g的微生態(tài)制劑預混料，保存于-20 ℃冰箱備用。

1.2 試驗設(shè)計與基礎(chǔ)飼糧

試驗預試期1周后，選取同一飼養(yǎng)條件下健康且體重接近的54周齡京紅1號父母代種母雞384只，隨機分成空白組、KL1組、Liu-c1組和復合組，每組96只(每組6個重復，每重復16只)進行為期8周的正式試驗，空白組飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗組(KL1組、Liu-c1組和復合組)分別在飼喂基礎(chǔ)飼糧中添加1 g/kg的副干酪乳桿菌KL1、枯草芽孢桿菌Liu-c1和副干酪乳桿菌KL1∶枯草芽孢桿菌Liu-c1=1∶1的試驗飼糧，使各試驗組每日攝入活菌數(shù)量為8×107CFU/只?；A(chǔ)飼糧由北京市某禽業(yè)有限公司提供，其組成及營養(yǎng)水平如表1所示。

飼養(yǎng)條件依據(jù)該禽業(yè)有限公司飼養(yǎng)管理規(guī)定操作：3層A字型階梯式籠養(yǎng)(47 cm×47 cm)，每籠4羽，光照強度10～15 lx，時長恒定15.5 h，溫度18～25 ℃，相對濕度40%～70%。每日投料3次，雞只自由采食、飲水，雞舍內(nèi)采用濕簾降溫，風機通風，定期清理糞便，環(huán)境、用具皆消毒。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎(chǔ))

續(xù)表1項目 Items含量 Content營養(yǎng)水平 Nutrient levels2)粗蛋白質(zhì) CP16.50代謝能 ME/(MJ/kg)11.10鈣 Ca3.50有效磷 AP0.36賴氨酸 Lys0.82蛋氨酸 Met0.40

1.3 樣品采集與指標測定

1.3.1 樣品采集

產(chǎn)蛋性能：每天統(tǒng)計并記錄各組產(chǎn)蛋總重量、產(chǎn)蛋總數(shù)、合格種蛋數(shù)量(非破、軟、砂殼蛋、畸形蛋、鋼皮蛋，并且蛋重在53～72 g)和日耗料量，計算第8周平均蛋重、平均日采食量、產(chǎn)蛋率、種蛋合格率和料蛋比。

血液采集：第8周末，從每個重復中選取1只種母雞進行血液采集(采樣前需空腹12 h)，用無菌注射器從翅下靜脈采血5 mL左右，于室溫下凝血2 h得到血液樣品。

肝臟組織：第8周末，從每個重復中血液采集后的種母雞進行解剖，迅速剪取約1.5 cm3的肝臟組織塊，經(jīng)生理鹽水清洗后，立即浸于中性福爾馬林固定液中固定備用。

1.3.2 測定方法及指標

1.3.2.1 生產(chǎn)性能的測定

平均蛋重(g)=統(tǒng)計期內(nèi)產(chǎn)蛋總重/
統(tǒng)計期內(nèi)產(chǎn)蛋個數(shù)；平均日采食量(g)=統(tǒng)計期內(nèi)消耗飼糧總重/
統(tǒng)計期內(nèi)總雞只數(shù)；產(chǎn)蛋率(%)=(統(tǒng)計期內(nèi)產(chǎn)蛋總數(shù)/
統(tǒng)計天數(shù)總雞只數(shù))×100；種蛋合格率(%)=(統(tǒng)計期內(nèi)合格種蛋數(shù)量/
統(tǒng)計期內(nèi)產(chǎn)蛋總數(shù))×100；料蛋比=統(tǒng)計期消耗飼糧總量/
統(tǒng)計期內(nèi)產(chǎn)蛋總重。

1.3.2.2 肝臟組織顯微鏡觀察

肝臟油紅O脂肪染色后，于CX21型生物顯微鏡(biological microscope)(日本奧林巴斯)下觀察肝臟脂肪滴變化。

1.3.2.3 肝臟組織粗脂肪含量測定

剩余肝臟組織用錫箔紙包好，于液氮罐中速凍，-45 ℃保存?zhèn)溆?，使用SoxtecTM-8000型索氏浸提系統(tǒng)(Soxhlet extraction system)(丹麥FOSS)依據(jù)《食品脂肪的測定》(GB/T 5009.6—2016)索氏抽提法[11]檢測粗脂肪含量。

1.3.2.4 肝臟、血清抗氧化和脂代謝指標的測定

取肝臟2 g，剪碎并研磨后與18 mL的4 ℃生理鹽水混勻并于均質(zhì)袋中使用SCIENTZ-11型均質(zhì)機拍打均質(zhì)15 min得到肝臟勻漿液；將肝臟勻漿液和1.3.1血液樣品在4 ℃、4 000 r/min條件下離心10 min，分別取上清液于離心管中，4 ℃冰箱保存?zhèn)錂z。使用7080E型全自動生化分析儀(automatic chemistry analyzer，ACA，日本HITACHI)嚴格按照試劑盒的操作步驟測定肝臟和血清中TC、TG、HDL、LDL、MDA含量及SOD、GSH-Px活性和T-AOC，試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 微生態(tài)制劑對種母雞生產(chǎn)性能的影響

由表2可知，各組間平均蛋重均無顯著差異(P>0.05)；與空白組相比，KL1組、Liu-c1組和復合組產(chǎn)蛋率分別極顯著增加5.77%、5.37%和8.84%(P<0.01)；KL1組、Liu-c1組和復合組種蛋合格率分別極顯著提高12.65%、9.15%和14.43%(P<0.01)；各組間平均日采食量無顯著差異(P>0.05)，試驗組平均日采食量均小于空白組，而KL1組料蛋比顯著降低2.27%(P<0.05)，Liu-c1組和復合組極顯著降低4.09%和5.45%(P<0.01)。微生態(tài)制劑對于種母雞產(chǎn)蛋率、種蛋合格率和料蛋比的優(yōu)化中，復合組效果最佳。

表2 微生態(tài)制劑對種母雞產(chǎn)蛋性能的影響

2.2 微生態(tài)制劑對種母雞肝臟組織切片和粗脂肪含量的影響

肝臟油紅O染色觀察結(jié)果如圖1所示，空白組可見大量紅染脂肪滴，KL1組、Liu-c1組和復合組紅染脂肪滴減少。肝臟粗脂肪含量如圖2所示，KL1組、Liu-c1組和復合組的粗脂肪含量較空白組皆顯著降低(P<0.05)，表明3種微生態(tài)制劑皆具有較強的抑制產(chǎn)蛋后期種母雞脂肪肝、減少脂肪堆積的能力。

圖1 肝臟油紅O染色切片

2.3 微生態(tài)制劑對種母雞肝臟和血清抗氧化指標的影響

由表3可知，與空白組相比，KL1組血清、肝臟MDA含量分別極顯著減少39.13%和52.58%(P<0.01)，Liu-c1組則分別顯著減少16.52%和37.32%(P<0.05)，復合組則分別極顯著減少34.78%和48.97%(P<0.01)；KL1組血清、肝臟SOD活性分別極顯著增加42.42%和57.65%(P<0.01)，Liu-c1組則分別顯著增加25.60%和23.16%(P<0.05)，復合組則分別顯著增加31.53%和26.28%(P<0.05)；KL1組血清、肝臟GSH-Px活性分別極顯著增加33.51%和94.61%(P<0.01)，Liu-c1組則分別增加14.16%(P>0.05)和39.13%(P<0.05)，復合組則分別增加18.28%(P>0.05)和42.72%(P<0.05)；KL1組血清、肝臟T-AOC分別極顯著增加47.22%和57.42%(P<0.01)，Liu-c1組則分別顯著增加25.00%和12.26%(P<0.05)，復合組則分別顯著增加27.78%和26.45%(P<0.05)。這2種微生態(tài)制劑單獨和復合時能不同程度地增加種母雞的抗氧化能力，其中KL1組效果最佳，復合組其次。

2.4 微生態(tài)制劑對種母雞血清和肝臟脂代謝指標的影響

由表4可知，與空白組相比，KL1組血清和肝臟TC含量分別極顯著減少42.73%和40.16%(P<0.01)，Liu-c1組則分別顯著減少23.55%和25.20%(P<0.05)，復合組則分別極顯著減少26.74%和33.86%(P<0.01)；KL1組血清和肝臟TG含量分別極顯著減少30.14%和70.70%(P<0.01)，Liu-c1組則分別極顯著減少22.27%和45.05%(P<0.01)，復合組則分別極顯著減少27.59%和47.25%(P<0.01)；KL1組血清和肝臟LDL-C含量分別極顯著減少41.26%和35.00%(P<0.01)，Liu-c1組則分別顯著減少32.87%和19.00%(P<0.05)，復合組則分別顯著減少34.97%和22.00%(P<0.05)；KL1組血清和肝臟HDL-C含量分別極顯著增加44.62%和123.08%(P<0.01)，Liu-c1組則分別顯著增加29.23%(P<0.05)和極顯著增加84.62%(P<0.01)，復合組則分別顯著增加36.92%和115.38%(P<0.01)。這表明副干酪乳桿菌KL1和枯草芽孢桿菌Liu-c1單獨和復合使用皆有較好地降血脂功能，以KL1組效果最好，復合組次之。副干酪乳桿菌KL1能調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)合成和分泌之間的平衡，顯著改善肝臟脂肪堆積，有效抑制種母雞脂肪肝的形成。

3 討 論

3.1 微生態(tài)制劑對種母雞的生產(chǎn)性能的影響

產(chǎn)蛋量和蛋合格率是反映種母雞產(chǎn)蛋性能的重要指標。由于種母雞周齡的增加，產(chǎn)蛋性能不可避免地逐漸下降，降低生產(chǎn)經(jīng)濟效益。戴維等[12]在蛋雞飼糧中添加3%復合微生態(tài)制劑可提高飼料利用率、抗氧化性能。Y?rük等[13]在飼糧中添加微生態(tài)制劑顯著提高種母雞產(chǎn)蛋后期的產(chǎn)蛋量，降低種母雞料蛋比。褚素喬等[14]在飼糧中添加1%枯草芽孢桿菌，羅曼褐蛋雞產(chǎn)蛋率和平均蛋重分別提高1.32%和4.14%，料蛋比降低4.65%，與Abdelqader等[15]和蔣一秀等[16]試驗結(jié)果基本一致。本試驗中，復合微生態(tài)制劑對于種母雞生產(chǎn)性能效果最佳。這是因為復合微生態(tài)制劑一方面通過自身合成的中性蛋白酶和淀粉酶，在功能上與種母雞內(nèi)源消化酶具有互補性[17]，進入腸道后會消耗游離氧，進行腸道繁殖，從而調(diào)節(jié)腸道內(nèi)微生物的菌群平衡，促進腸道內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收；另一方面復合組產(chǎn)生的膽鹽水解酶和胞外多糖具有抗脂質(zhì)過氧化的作用，提高種母雞免疫和抗病能力。正是由于2種單一的微生態(tài)制劑益生機理相互疊加，復合微生態(tài)制劑提高種母雞的生產(chǎn)性能，降低料蛋比具有明顯優(yōu)勢。

數(shù)據(jù)柱標注相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

表3 微生態(tài)制劑對種母雞肝臟和血清抗氧化指標的影響

表4 微生態(tài)制劑對種母雞血清和肝臟脂代謝指標的影響

3.2 微生態(tài)制劑對種母雞的抗氧化能力的影響

活細胞抗氧化系統(tǒng)的第1道防線負責抑制自由基的生成和脂質(zhì)過氧化，過量的自由基可損傷蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子物質(zhì)，并產(chǎn)生大量的MDA，從而誘發(fā)許多疾病的發(fā)生[18]，而經(jīng)常攝入抗氧化物質(zhì)能夠提高種母雞抗氧化防御能力，保持體內(nèi)氧化還原平衡[19]。MDA是脂質(zhì)過氧化反應終產(chǎn)物，能指示機體氧化損傷及老化[20]。SOD和GSH-Px是體內(nèi)重要的抗氧化劑，T-AOC是衡量機體對自由基總體清除能力的指標[21-22]。聶彥芬等[23]研究證明副干酪乳桿菌KL1能顯著提高農(nóng)大3號矮小雞血清中的SOD活性和T-AOC，增強機體抗氧化能力；彭豫東等[24]發(fā)現(xiàn)在石門土雞飼糧中添加枯草芽孢桿菌，與對照組相比，300 mg/kg BS組石門土雞的血清SOD活性顯著提高，GSH-Px活性極顯著提高；張鑫等[25]發(fā)現(xiàn)添加微生態(tài)制劑試驗組的血液中SOD和GSH-Px活性與對照組相比顯著提高，MDA含量顯著降低。本試驗通過在飼糧中添加不同的微生態(tài)制劑研究京紅1號種母雞的血清和肝臟的抗氧化能力，結(jié)果顯示與對照組相比，KL1組、Liu-c1組和復合組種母雞血清和肝臟中的T-AOC皆不同程度提高，其中KL1組效果最佳。戴維等[12]研究表明，在飼糧種添加3% EM菌使羅曼粉蛋雞血清SOD、GSH-Px活性和T-AOC分別提高0.20%、1.80%、65.99%，MDA含量降低14.88%，而本試驗添加副干酪乳桿菌KL1的種母雞血清SOD、 GSH-Px活性和 T-AOC分別提高42.70%、33.50%、47.22%，MDA含量降低39.10%，與李嘉懿等[9]和聶彥芬等[23]研究結(jié)果基本一致。這是因為副干酪乳桿菌KL1能夠高產(chǎn)(1 271 mg/L)胞外多糖(exopoly saccharides,EP)[26]，EP能夠清除機體二苯基苦基苯肼(DPPH)自由基和羥自由基或減少活性氧的產(chǎn)生，同時副干酪乳桿菌KL1可以直接或間接作用免疫細胞分泌各種細胞因子與免疫球蛋白，極顯著提高SOD、GSH-Px活性和T-AOC，加速清除MDA等脂質(zhì)過氧化物，保護細胞膜的結(jié)構(gòu)及功能不受過氧化物的干擾，從而減少種母雞氧化應激損傷，維持機體的健康狀態(tài)[27-29]

3.3 微生態(tài)制劑對種母雞的肝臟脂代謝及降血脂能力的影響

種母雞在產(chǎn)蛋期間體內(nèi)需要合成大量的脂類來形成蛋黃[30]，特別容易誘發(fā)種母雞的脂質(zhì)代謝紊亂，從而誘發(fā)種母雞FLS?；加蠪LS的病雞在脂肪的堆積過程中，導致肝臟樣變性，產(chǎn)蛋量急劇下降，且在產(chǎn)蛋后期更為嚴重[31]。姜延騫[32]在人工干預使其患有FLS的模型雞試驗中，其產(chǎn)蛋率由87%下降至45%，產(chǎn)蛋水平下降接近50%。本試驗通過在飼糧中添加不同的微生態(tài)制劑研究京紅1號種母雞的降血脂能力和肝臟脂代謝，與對照組相比，KL1組和復合組對降低種母雞血清和肝臟TC、TG含量以及提高HDL含量皆有極顯著的作用。韋云路等[33]研究表明，植物乳桿菌LPL-1使高脂大鼠血清TC和TG含量分別降低10.1%和11.5%，而本試驗種母雞血清TC和TG含量分別降低42.7%和30.1%。目前促進體內(nèi)膽固醇分解最直接途徑是增加糞便膽汁酸的排泄[34]，膽汁酸在人體內(nèi)主要以?；悄懰岷透拾蹦懰?種結(jié)合態(tài)形式存在。副干酪乳桿菌KL1產(chǎn)生的膽鹽水解酶(bile salt hydrolase,BSH)一方面水解結(jié)合型膽鹽，產(chǎn)成游離型膽鹽和氨基酸[35]，前者與膽固醇生成共沉淀復合物，隨糞便排出體外，而降低血清膽固醇的含量；另一方面由于減少了游離態(tài)膽鹽在肝腸循環(huán)次數(shù)，增加膽鹽的生物合成，加速膽固醇的代謝，從而降低血清膽固醇的含量[36]。此外，油紅O染色肝臟組織切片觀察及粗脂肪含量測定證明副干酪乳桿菌KL1微生態(tài)制劑能夠減少種母雞脂肪堆積，降低LDL含量，具有保護肝臟和抑制脂肪肝形成的功效。

4 結(jié) 論

① 飼糧中添加微生態(tài)制劑可提高種母雞的生產(chǎn)性能，降低種母雞血清和肝臟中的TG含量、肝臟粗脂肪含量，提高血清和肝臟SOD、GSH-Px活性和T-AOC，降低MDA含量。

② 副干酪乳桿菌KL1微生態(tài)制劑對于提高種母雞抗氧化能力、降低血脂和膽固醇含量、保護肝臟效果最好；復合微生態(tài)制劑提高產(chǎn)蛋性能，抗氧化和降血脂能力具有明顯優(yōu)勢，為復合微生態(tài)制劑在種母雞生產(chǎn)應用提供科學的理論與實踐依據(jù)。