不同淀粉類型飼糧對(duì)育肥豬營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率、血清生化指標(biāo)、結(jié)腸黏膜免疫和微生物的影響

余 苗 李貞明 崔藝燕 容 庭 劉志昌 田志梅 馬新燕 李家洲* 馬現(xiàn)永*

(1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所，農(nóng)業(yè)部華南動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，畜禽育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省畜禽育種與營(yíng)養(yǎng)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省畜禽肉品質(zhì)量安全控制與評(píng)定工程技術(shù)研究中心，廣州 510640；2.嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗(yàn)室茂名分中心，茂名 525000)

淀粉作為谷物類飼料碳水化合物的主要成分，是畜禽維持其正常生長(zhǎng)所需能量的重要來源[1]。諸多研究發(fā)現(xiàn)，由于淀粉來源、組成和結(jié)構(gòu)等的不同，其在動(dòng)物宿主消化道內(nèi)的消化速率和消化吸收部位均存在明顯差異，并影響能量的供應(yīng)效率、養(yǎng)分吸收和利用、腸道微生物的組成和代謝活性，進(jìn)而導(dǎo)致動(dòng)物體內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)生理效應(yīng)存在差異[2-4]。在自然界中，淀粉主要由線性分支狀的支鏈淀粉和線性螺旋狀的直鏈淀粉2種類型的分子組成，其中支鏈淀粉屬于快速消化淀粉，可被宿主小腸中的α-淀粉酶快速降解并被機(jī)體吸收；而直鏈淀粉屬于慢速消化淀粉，不易被宿主小腸中的α-淀粉酶降解或降解很慢，但可到達(dá)后腸作為微生物發(fā)酵的底物而被發(fā)酵產(chǎn)生大量的短鏈脂肪酸，對(duì)宿主的生長(zhǎng)發(fā)育和腸道健康具有重要的影響[5-6]。因此，不同淀粉類型飼糧由于其所含有的直鏈淀粉與支鏈淀粉的比值不同，對(duì)宿主動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)生理效應(yīng)以及黏膜免疫穩(wěn)態(tài)也不盡相同。結(jié)腸是機(jī)體內(nèi)腸道微生物發(fā)酵比較活躍的部位，其上皮免疫功能的穩(wěn)定對(duì)宿主的腸道健康具有重要的作用，但不同淀粉類型飼糧對(duì)結(jié)腸黏膜免疫穩(wěn)態(tài)的影響還相對(duì)缺乏。在斷奶仔豬上的研究發(fā)現(xiàn)，飼喂含有不同淀粉類型的飼糧顯著改變了采食后不同時(shí)間點(diǎn)血清中葡萄糖和脂代謝相關(guān)物質(zhì)的濃度[7]。在育肥豬上的研究發(fā)現(xiàn)，飼喂含有不同直鏈淀粉與支鏈淀粉比例的飼糧對(duì)其生長(zhǎng)性能無顯著影響，但隨著飼糧直鏈淀粉/支鏈淀粉值的提高，降低了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的表觀消化率，改變了后腸食糜中微生物的組成及其對(duì)碳水化合物的代謝[8]，同時(shí)還顯著下調(diào)了結(jié)腸黏膜中白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-6、IL-12、IL-1β和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的表達(dá)[9]，有益于維系育肥豬的腸道健康。另有研究發(fā)現(xiàn)，與含有高支鏈的蠟質(zhì)玉米淀粉飼糧相比，飼喂含有高直鏈的豌豆淀粉飼糧可顯著提高育肥豬的生長(zhǎng)性能和肉品質(zhì)[10]，并促進(jìn)機(jī)體對(duì)氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)吸收[11]。本試驗(yàn)前期研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，給育肥豬飼喂含有不同淀粉類型飼糧顯著影響了其生長(zhǎng)性能、肉品質(zhì)以及后腸微生物的組成和代謝活性，與低直鏈的木薯淀粉飼糧相比，飼喂含有高直鏈的豌豆淀粉飼糧可增加其平均日增重達(dá)14.12%，降低料重比達(dá)9.88%，同時(shí)提高屠宰性能和肉品質(zhì)[12]；此外，還增加了盲腸食糜中有益微生物的數(shù)量和短鏈脂肪酸類物質(zhì)的濃度，降低了潛在致病菌的數(shù)量和代謝相關(guān)產(chǎn)物的濃度，進(jìn)而有利于維持宿主的腸道健康[13]。

目前，盡管國內(nèi)外已有不少關(guān)于不同淀粉類型飼糧在豬上應(yīng)用的研究報(bào)道，但主要停留在對(duì)豬生長(zhǎng)性能、肉品質(zhì)、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率以及腸道微生物組成和代謝等的影響方面，其對(duì)后腸黏膜免疫穩(wěn)態(tài)的影響還相對(duì)缺乏。因此，本試驗(yàn)擬通過研究不同淀粉類型飼糧對(duì)育肥豬營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率、血清生化和免疫相關(guān)指標(biāo)、結(jié)腸黏膜免疫狀態(tài)以及食糜中主要微生物數(shù)量的影響，從腸道黏膜免疫角度來揭示攝食含有高直鏈的豌豆淀粉飼糧是如何維護(hù)腸道健康，進(jìn)而提高育肥豬的生長(zhǎng)性能的，相關(guān)研究結(jié)果將為在育肥豬生產(chǎn)中科學(xué)且合理地利用淀粉原料提供理論依據(jù)和試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和試驗(yàn)飼糧

本試驗(yàn)是探究不同淀粉類型飼糧對(duì)育肥豬生長(zhǎng)、機(jī)體代謝、免疫狀態(tài)以及腸道微生物結(jié)構(gòu)影響中的一部分內(nèi)容，其動(dòng)物試驗(yàn)設(shè)計(jì)同前期已發(fā)表的文章[12-14]。試驗(yàn)采用單因素完全隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選取130日齡、健康且初始體重[(77.00±0.52) kg]相近的“杜×長(zhǎng)×大”三元雜交閹公豬72頭，按照體重隨機(jī)分為3組，每組8個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)3頭豬。3組分別飼喂以木薯淀粉(tapioca starch，TS)、玉米淀粉(corn starch，CS)和豌豆淀粉(pea starch，PS)為唯一淀粉源配制的飼糧。試驗(yàn)飼糧參照NRC(2012)育肥豬營(yíng)養(yǎng)需要進(jìn)行配制，通過調(diào)整配方，使得3組飼糧的代謝能以及粗蛋白質(zhì)、總淀粉和4種主要必需氨基酸(賴氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸和色氨酸)含量基本一致，直鏈淀粉與支鏈淀粉的比例分別為0.11、0.25和0.44，飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。

1.2 飼養(yǎng)管理以及樣品采集和處理

動(dòng)物飼養(yǎng)試驗(yàn)在廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所試驗(yàn)基地進(jìn)行，試驗(yàn)期間育肥豬自由采食和飲水，所有豬的飼養(yǎng)管理?xiàng)l件保持一致，每天不定期打掃圈舍，保持舍內(nèi)清潔、通風(fēng)和干燥，環(huán)境適宜。試驗(yàn)預(yù)試期4 d，正試期42 d。

試驗(yàn)結(jié)束前3天早上開始收集飼糧和剛排出未被污染的新鮮糞便樣品。飼糧樣品參照GB/T 14699.1—2005《飼料采樣》的要求，以組為單位，采用四分法分別采集不同組的飼糧樣品1 kg左右，經(jīng)研磨過篩混勻后，置于密封袋保存在-20 ℃冰箱中待測(cè)；糞便樣品以重復(fù)為單位，其具體采集和處理方法同余苗等[15]的操作步驟。

飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束當(dāng)天，每組選取1頭體重接近平均體重的豬(8頭/組，共24頭)運(yùn)至廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所屠宰車間，電擊暈后，采集前腔靜脈血10 mL，經(jīng)低溫靜止30 min后，于4 ℃ 3 000 r/min條件下離心10 min后得到血清，分裝后置于-20 ℃冰箱中保存，用于血清生化和免疫指標(biāo)的測(cè)定。采血結(jié)束后，將試驗(yàn)豬立即進(jìn)行放血處死，迅速分離出結(jié)腸，收集所有結(jié)腸食糜經(jīng)混勻后，取10 g左右樣品置于-80 ℃超低溫冰箱中保存，用于后續(xù)主要微生物數(shù)量的分析。取結(jié)腸中段組織，經(jīng)生理鹽水清洗干凈并用濾紙吸干后，用載玻片刮取黏膜于滅菌后的凍存管中，放入液氮罐中保存測(cè)定。

表1 飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(飼喂基礎(chǔ))

1.3 指標(biāo)測(cè)定及方法

1.3.1 營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率

采用內(nèi)源指示劑鹽酸不溶灰分標(biāo)記法測(cè)定營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率，其中飼糧和糞便樣品中鹽酸不溶灰分含量參照GB/T 23742—2009《飼料中鹽酸不溶灰分的測(cè)定》[16]中的方法進(jìn)行測(cè)定，飼糧和糞便樣品中干物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)、有機(jī)物、粗灰分和粗脂肪含量參照《飼料分析與檢驗(yàn)》[17]中的方法進(jìn)行測(cè)定。營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率具體計(jì)算公式如下：

某營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率(%)=100-100×
(糞便中該營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量×飼糧中鹽酸不溶
灰分含量)/(飼糧中該營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量×
糞便中鹽酸不溶灰分含量)。

1.3.2 血清生化指標(biāo)

采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清中總蛋白、白蛋白、球蛋白、尿素氮、葡萄糖、甘油三酯、總膽固醇、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白濃度，測(cè)定所使用的試劑盒購買于中生北控生物科技股份有限公司。

1.3.3 結(jié)腸黏膜Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)信號(hào)通路、細(xì)胞因子和屏障功能相關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)量

結(jié)腸黏膜RNA采用Trizol試劑(TaKaRa，大連)提取，具體提取步驟參照Yu等[18]的方法。采用核酸蛋白檢測(cè)儀(Nanodrop 2000，Thermo Fisher Scientific)測(cè)定RNA的濃度和純度，260 nm吸光度/280 nm吸光度(OD260 nm/OD280 nm)應(yīng)介于1.9～2.1。隨后采用1%甲醛變性凝膠電泳對(duì)RNA完整性進(jìn)行檢測(cè)，選取RNA質(zhì)量較高的樣品，使用PrimerScriptTMRT Reagent Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa，大連)進(jìn)行cDNA合成，具體操作步驟參照說明書，獲得cDNA置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｒ詂DNA為模板，選取15個(gè)與腸道黏膜TLR信號(hào)通路、細(xì)胞因子和屏障功能相關(guān)的基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，相關(guān)特異性引物序列見表2[19-27]。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(CFX96 Real-time PCR System，Bio-Rad Laboratories，美國)進(jìn)行檢測(cè)，PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件均參照前期已發(fā)表的相關(guān)文獻(xiàn)[28-29]。定量結(jié)果以β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)作為內(nèi)參基因，每個(gè)樣品重復(fù)3次，采用2-△△Ct法分析相關(guān)基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量[30]。

1.3.4 結(jié)腸黏膜和血清細(xì)胞因子和免疫球蛋白濃度

采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法測(cè)定結(jié)腸黏膜和血清細(xì)胞因子和免疫球蛋白濃度，試劑盒購買于北京方程生物科技有限公司，具體操作步驟按照說明書進(jìn)行操作。結(jié)腸黏膜樣品在測(cè)定之前解凍，加2倍體積的磷酸鹽緩沖液(PBS)，用電勻漿機(jī)進(jìn)行勻漿，然后在4 ℃條件下5 000 r/min離心10 min，收集上清液，用于測(cè)定相關(guān)細(xì)胞因子和免疫球蛋白濃度。

表2 引物序列

續(xù)表2基因 Genes引物序列Primer sequences (5′—3′)參考文獻(xiàn) References白細(xì)胞介素-8 IL-8F:ACTGGCTGTTGCCTTCTTR:CAGTTCTCTTCAAAAATATCTG[23]白細(xì)胞介素-10 IL-10F:GTCCGACTCAACGAAGAAGGR:GCCAGGAAGATCAGGCAATA[19]干擾素-γ IFN-γF:TCCAGCGCAAAGCCATCAGTGR:ATGCTCTCTGGCCTTGGAACATAGT[24]腫瘤壞死因子-α TNF-αF:CCACGCTCTTCTGCCTACTGCR:GCTGTCCCTCGGCTTTGAC[25]黏蛋白1 MUC1F:GGTACCCGGCTGGGGCATTGR:GGTAGGCATCCCGGGTCGGA[19]黏蛋白2 MUC2F:CTGCTCCGGGTCCTGTGGGAR:CCCGCTGGCTGGTGCGATAC[19]閉鎖蛋白 OccludinF:ATGCTTTCTCAGCCAGCGTAR:AAGGTTCCATAGCCTCGGTC[25]閉鎖小帶蛋白-1 ZO-1F:GAGGATGGTCACACCGTGGTR:GGAGGATGCTGTTGTCTCGG[26]封閉蛋白-1 Claudin-1F:ATTTCAGGTCTGGCTATCTTAGTTGCR:AGGGCCTTGGTGTTGGGTAA[26]封閉蛋白-2 Claudin-2F:GCATCATTTCCTCCCTGTTR:TCTTGGCTTTGGGTGGTT[27]

1.3.5 結(jié)腸食糜微生物DNA提取和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

稱取0.25 g結(jié)腸食糜，采用MOBIO PowerFecal DNA試劑盒(Qiagen，德國)提取各樣品總DNA，具體操作步驟參照試劑盒說明書。提取的DNA采用核酸蛋白檢測(cè)儀(Nanodrop 2000，Thermo Fisher Scientific)檢測(cè)其濃度和質(zhì)量，檢驗(yàn)樣品合格的標(biāo)準(zhǔn)為：OD260 nm/OD280 nm為1.80～2.00，260 nm吸光度/230 nm吸光度為2.00左右。

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(CFX96 Real-time PCR System，Bio-Rad Laboratories，美國)對(duì)結(jié)腸食糜中主要的微生物，包括總菌、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、乳酸桿菌(Lactobacillus)、雙歧桿菌(Bifidobacterium)、梭菌Ⅳ(Clostridiumcluster Ⅳ)、梭菌ⅩⅣ(Clostridiumcluster ⅩⅣ)、瘤胃球菌屬(Ruminococcus)和普雷沃氏菌屬(Prevotella)的16S rRNA基因拷貝數(shù)進(jìn)行定量分析，所用引物序列、PCR反應(yīng)體系以及擴(kuò)增程序均參照余苗等[31]和Yu等[32]的方法，結(jié)果表示為每克結(jié)腸食糜中16S rRNA基因拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 20.0軟件對(duì)所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，并結(jié)合Tukey法進(jìn)行多重比較。試驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)均表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 不同淀粉類型飼糧對(duì)育肥豬營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的影響

由表3可知，與木薯淀粉組相比，豌豆淀粉組育肥豬粗蛋白質(zhì)表觀消化率顯著提高(P<0.05)，而玉米淀粉組粗蛋白質(zhì)表觀消化率與木薯淀粉組和豌豆淀粉組相比差異均不顯著(P>0.05)。各組干物質(zhì)、有機(jī)物、粗灰分和粗脂肪表觀消化率均無顯著差異(P>0.05)。

表3 不同淀粉類型飼糧對(duì)育肥豬營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的影響

2.2 不同淀粉類型飼糧對(duì)育肥豬血清生化指標(biāo)的影響

由表4可知，與木薯淀粉組相比，豌豆淀粉組育肥豬血清中尿素氮、葡萄糖、總膽固醇和甘油三酯濃度顯著降低(P<0.05)，而玉米淀粉組的上述指標(biāo)與木薯淀粉組和豌豆淀粉組相比差異均不顯著(P>0.05)。此外，各組育肥豬血清中總蛋白、白蛋白、球蛋白、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白濃度均無顯著差異(P>0.05)。

表4 不同淀粉類型飼糧對(duì)育肥豬血清生化指標(biāo)的影響

2.3 不同淀粉類型飼糧對(duì)育肥豬血清和結(jié)腸黏膜細(xì)胞因子和免疫球蛋白濃度的影響

由表5可知，與木薯淀粉組相比，豌豆淀粉組育肥豬血清中細(xì)胞因子IL-8和干擾素-γ(IFN-γ)濃度顯著降低(P<0.05)，而血清中IL-10和免疫球蛋白A(IgA)濃度顯著提高(P<0.05)，而玉米淀粉組上述指標(biāo)無顯著差異(P>0.05)。此外，各組育肥豬血清中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和免疫球蛋白G(IgG)濃度差異均不顯著(P>0.05)。

由表6可知，與木薯淀粉組相比，豌豆淀粉組育肥豬結(jié)腸黏膜中IL-10、分泌型免疫球蛋白A(sIgA)和IgG濃度顯著提高(P<0.05)，而玉米淀粉組的上述指標(biāo)與木薯淀粉組和豌豆淀粉組相比差異均不顯著(P>0.05)。此外，各組育肥豬結(jié)腸黏膜中IL-8、IFN-γ和TNF-α濃度均無顯著差異(P>0.05)。

2.4 不同淀粉類型飼糧對(duì)育肥豬結(jié)腸食糜主要微生物數(shù)量的影響

由圖1可知，不同淀粉類型飼糧對(duì)育肥豬結(jié)腸食糜中微生物總菌和2個(gè)主要菌門(厚壁菌門和擬桿菌門)數(shù)量無顯著影響(P>0.05)。與木薯淀粉組相比，豌豆淀粉組育肥豬結(jié)腸食糜中乳酸桿菌、普雷沃氏菌屬和雙歧桿菌數(shù)量顯著增加(P<0.05)，結(jié)腸食糜中大腸桿菌數(shù)量顯著降低(P<0.05)，而玉米淀粉組上述微生物數(shù)量與木薯淀粉組和豌豆淀粉組相比差異均不顯著(P>0.05)。此外，不同組間育肥豬結(jié)腸食糜中瘤胃球菌屬、梭菌Ⅳ和梭菌ⅩⅣ數(shù)量差異均不顯著(P>0.05)。

表5 不同淀粉類型飼糧對(duì)育肥豬血清細(xì)胞因子和免疫球蛋白濃度的影響

表6 不同淀粉類型飼糧對(duì)育肥豬結(jié)腸黏膜細(xì)胞因子和免疫球蛋白濃度的影響

*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)。下圖同。

2.5 不同淀粉類型飼糧對(duì)育肥豬結(jié)腸黏膜TLR信號(hào)通路及細(xì)胞因子mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

由圖2可知，與木薯淀粉組相比，豌豆淀粉組育肥豬結(jié)腸黏膜中TLR2、TLR4、髓樣分化因子88(MyD88)、核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)和IFN-γ的mRNA相對(duì)表達(dá)量極顯著下調(diào)(P<0.01)，而結(jié)腸黏膜中IL-10的mRNA相對(duì)表達(dá)量極顯著上調(diào)(P<0.01)；玉米淀粉組結(jié)腸黏膜中TLR2、TLR4和IFN-γ的相對(duì)mRNA表達(dá)量顯著下調(diào)(P<0.05)，結(jié)腸黏膜中MyD88和NF-κB的mRNA相對(duì)表達(dá)量極顯著下調(diào)(P<0.01)，而結(jié)腸黏膜中IL-10的mRNA相對(duì)表達(dá)量極顯著上調(diào)(P<0.01)。此外，各組育肥豬結(jié)腸黏膜中TLR5、IL-8和TNF-α的mRNA相對(duì)表達(dá)量均無顯著差異(P>0.05)。

圖2 不同淀粉類型飼糧對(duì)育肥豬結(jié)腸黏膜TLR信號(hào)通路及細(xì)胞因子mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

2.6 不同淀粉類型飼糧對(duì)育肥豬結(jié)腸黏膜屏障功能相關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

由圖3可知，與木薯淀粉組相比，豌豆淀粉組育肥豬結(jié)腸黏膜中閉鎖小帶蛋白-1(ZO-1)和封閉蛋白-2(claudin-2)的mRNA相對(duì)表達(dá)量極顯著上調(diào)(P<0.01)，玉米淀粉組結(jié)腸黏膜中ZO-1和claudin-2的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.05)，但玉米淀粉組和豌豆淀粉組組上述指標(biāo)無顯著差異(P>0.05)。此外，各組育肥豬結(jié)腸黏膜中閉鎖蛋白(occludin)、封閉蛋白-1(claudin-1)、黏蛋白1(MUC1)和黏蛋白2(MUC2)的mRNA相對(duì)表達(dá)量均無顯著差異(P>0.05)。

圖3 不同淀粉類型飼糧對(duì)育肥豬結(jié)腸黏膜屏障功能相關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

3 討 論

3.1 不同淀粉類型飼糧對(duì)育肥豬營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的影響

淀粉是動(dòng)物維持其正常生長(zhǎng)所需能量的主要來源，不同淀粉類型飼糧由于其來源、組成和結(jié)構(gòu)等的不同，動(dòng)物對(duì)其利用效率和營(yíng)養(yǎng)生理效應(yīng)也存在明顯差異。蒲俊寧等[8]在育肥豬上的研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中總能、粗灰分、粗脂肪和粗蛋白質(zhì)的表觀消化率隨著飼糧中直鏈淀粉與支鏈淀粉比例的提高而降低。李豐隆[33]研究不同來源淀粉對(duì)75～100 kg階段育肥豬的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率發(fā)現(xiàn)，飼喂含有高直鏈的玉米淀粉飼糧組的鈣和總磷的表觀消化率顯著高于低直鏈的糯米淀粉組，而干物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)和能量的表觀消化率無顯著差異。何錦[34]在研究不同來源淀粉對(duì)育肥豬小腸不同腸段營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化率的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，與含有低直鏈淀粉/支鏈淀粉值(0.02)的糯米淀粉組相比，給育肥豬飼喂含有高直鏈淀粉/支鏈淀粉值(0.40)的玉米淀粉飼糧顯著提高了空腸和回腸部位干物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)、鈣和磷的消化率。本試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，含有高直鏈淀粉/支鏈淀粉值(0.44)的豌豆淀粉組的全腸道粗蛋白質(zhì)表觀消化率顯著高于含有低直鏈淀粉/支鏈淀粉值(0.11)的木薯淀粉組。動(dòng)物對(duì)飼糧中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收和利用的效率越高，對(duì)其生長(zhǎng)越有利。因此，這一研究結(jié)果正好解釋筆者前期的研究發(fā)現(xiàn)，即飼喂豌豆淀粉組的生長(zhǎng)性能顯著高于木薯淀粉組[12]。前人研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)飼糧中直鏈淀粉/支鏈淀粉值較低時(shí)，可導(dǎo)致淀粉的能量代謝過程和蛋白質(zhì)的吸收合成過程的同步性不對(duì)應(yīng)，從而使得氨基酸轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)的通路受阻，進(jìn)而負(fù)反饋調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的消化過程，最終降低蛋白質(zhì)的消化率[35]。另有研究發(fā)現(xiàn)，豌豆淀粉飼糧具有促進(jìn)豬小腸的發(fā)育和腸細(xì)胞增殖的作用[36]。因此，本試驗(yàn)中攝食豌豆淀粉飼糧提高了育肥豬對(duì)粗蛋白質(zhì)的表觀消化率，其原因一方面可能是豌豆淀粉飼糧中的直鏈淀粉與支鏈淀粉的比例適中，使得淀粉的能量代謝速率和蛋白質(zhì)吸收速率處于同步性，進(jìn)而提高了蛋白質(zhì)的消化率；另一方面，豌豆淀粉可能通過促進(jìn)了育肥豬腸道發(fā)育和腸細(xì)胞的增殖，進(jìn)而促進(jìn)了機(jī)體對(duì)蛋白質(zhì)的消化吸收，但其具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

3.2 不同淀粉類型飼糧對(duì)育肥豬血液生化指標(biāo)的影響

一般而言，血清中的生化指標(biāo)可間接反映動(dòng)物機(jī)體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收代謝水平和生長(zhǎng)性能等狀況，其也是衡量宿主健康狀態(tài)的重要指標(biāo)[37]。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，豌豆淀粉組育肥豬血清中尿素氮的濃度顯著低于木薯淀粉組。血清尿素氮是機(jī)體氨基酸代謝的終產(chǎn)物之一，其濃度在一定程度上反映了飼糧中蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)水平以及動(dòng)物對(duì)蛋白質(zhì)的代謝利用狀況，通常用來評(píng)估動(dòng)物的生長(zhǎng)以及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化的趨勢(shì)，該指標(biāo)降低則表明飼糧蛋白質(zhì)的利用率提高，宿主機(jī)體內(nèi)氮沉積和蛋白質(zhì)合成率增加[38]。同時(shí)，在肝臟中合成尿素是一個(gè)消耗能量的過程，合成1 mol的尿素需要消耗3 mol的ATP[38]。因此，本試驗(yàn)中血清尿素氮濃度的降低可能表明育肥豬攝食含有高直鏈的豌豆淀粉后，機(jī)體對(duì)蛋白質(zhì)和氨基酸的利用率得以提高，機(jī)體對(duì)能量的消耗得以降低，最終促進(jìn)其生長(zhǎng)。

血糖是機(jī)體細(xì)胞首要的供能物質(zhì)，而淀粉是動(dòng)物機(jī)體葡萄糖的主要來源物質(zhì)，其來源、顆粒大小、直鏈淀粉與支鏈淀粉比例不同均可影響血液中葡萄糖的含量。本試驗(yàn)中，飼喂豌豆淀粉飼糧的育肥豬血清中葡萄糖的濃度顯著低于木薯淀粉組，這與戴求仲[39]和張珍珍[7]的研究結(jié)果一致，即攝食含高直鏈淀粉的飼糧組動(dòng)物血清中葡萄糖濃度最低。木薯淀粉中的支鏈淀粉含量最高，豌豆淀粉中含有較高的直鏈淀粉，而支鏈淀粉在動(dòng)物機(jī)體內(nèi)易被消化酶迅速降解生成葡萄糖，而直鏈淀粉難被消化酶降解。此外，低直鏈淀粉/支鏈淀粉值飼糧可上調(diào)小腸黏膜中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體的表達(dá)水平，進(jìn)而提高對(duì)葡萄糖的吸收速率，最終導(dǎo)致血糖濃度升高[11]。因此，本試驗(yàn)中造成這一結(jié)果的主要原因可能是這3種淀粉組成上存在明顯差異，進(jìn)而影響了其消化和葡萄糖的吸收速率，最終影響了血清中葡萄糖的濃度。

葡萄糖在宿主體內(nèi)的代謝途徑之一是作為脂肪酸合成的前提物質(zhì)，參與機(jī)體內(nèi)的脂代謝，因此，血糖濃度的改變也會(huì)引起血液中脂代謝相關(guān)指標(biāo)發(fā)生相應(yīng)的變化[7]。本研究中，與木薯淀粉相比，育肥豬攝食含有高直鏈的豌豆淀粉飼糧顯著降低了血清中甘油三酯和總膽固醇的濃度，這與前人諸多在豬上的研究結(jié)果[40-42]一致。血清中甘油三酯和膽固醇的濃度取決于其腸道吸收的速率，含有高直鏈淀粉的飼糧可導(dǎo)致釋放葡萄糖的速率降低，進(jìn)而降低脂類的代謝，但其具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

3.3 不同淀粉類型飼糧對(duì)育肥豬結(jié)腸食糜主要微生物數(shù)量的影響

定殖于動(dòng)物胃腸道內(nèi)的微生物，具有多種生物學(xué)活性，可通過廣泛參與宿主對(duì)各類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的代謝從而對(duì)機(jī)體的免疫穩(wěn)態(tài)產(chǎn)生重要的影響[43]，其種類、數(shù)量和代謝活性主要受宿主所攝食的飼糧結(jié)構(gòu)和組成的影響。本試驗(yàn)通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢查結(jié)腸食糜中主要微生物的數(shù)量發(fā)現(xiàn)，育肥豬攝食含有高直鏈的豌豆淀粉飼糧顯著抑制了潛在致病菌大腸桿菌的增殖，促進(jìn)了有益菌乳酸桿菌、雙歧桿菌和普雷沃氏菌屬的增殖，這與筆者前期在盲腸中的研究結(jié)果[13]一致，也與Bird等[6]和Fouhse等[44]在斷奶仔豬上以及蒲俊寧等[8]在育肥豬上的研究結(jié)果一致，即攝食含有高直鏈淀粉的飼糧可顯著增加后腸食糜中乳酸桿菌和雙歧桿菌的數(shù)量。乳酸桿菌和雙歧桿菌屬細(xì)菌屬于對(duì)機(jī)體健康有益的腸道菌群，一方面可通過平衡抗炎與促炎因子間的比值來對(duì)宿主腸道具有益生作用；另一方面也可通過產(chǎn)生一些抗菌因子(如細(xì)菌素和乳酸)，通過競(jìng)爭(zhēng)性抑制潛在致病菌的感染和定殖，進(jìn)而維系宿主腸道和整個(gè)機(jī)體的健康[45]。普雷沃氏菌屬于腸道中主要的淀粉降解菌，可分解淀粉生成大量的短鏈脂肪酸，進(jìn)而調(diào)節(jié)腸道黏膜免疫系統(tǒng)的發(fā)育[46]。大腸桿菌屬于潛在致病菌，是導(dǎo)致動(dòng)物宿主發(fā)生細(xì)菌性痢疾或結(jié)腸炎癥的主要細(xì)菌[47]。健康的腸道內(nèi)環(huán)境可維系宿主腸道健康，進(jìn)而改善其生長(zhǎng)性能。因此，本試驗(yàn)中有益菌數(shù)量的增加以及潛在致病菌數(shù)量的減少，表明攝食高直鏈的豌豆淀粉飼糧可維系宿主腸道微生物菌群的穩(wěn)態(tài)，并對(duì)腸道健康具有益生作用。這一研究結(jié)果進(jìn)一步從腸道微生態(tài)層面解釋筆者前期的研究發(fā)現(xiàn)，即飼喂豌豆淀粉顯著提高了育肥豬的生長(zhǎng)性能[12]。

飼糧是影響腸道微生物組成的主要因素，飼糧中各組分的含量或類型的改變均可快速改變腸道微生物的種類和數(shù)量。如前言所屬，豌豆淀粉中含有較高的直鏈淀粉，在前腸不易消化，可到達(dá)后腸作為微生物發(fā)酵的底物。因此，本試驗(yàn)中不同淀粉類型飼糧改變了結(jié)腸微生物的數(shù)量可能是由于其不同淀粉類型結(jié)構(gòu)導(dǎo)致的。

3.4 不同淀粉類型飼糧對(duì)育肥豬免疫功能的影響

作為宿主第一道防線的腸道黏膜免疫系統(tǒng)，具有獨(dú)特的先天和適應(yīng)性防御機(jī)制，可有效防止病原菌的入侵和腸道抗原感染，進(jìn)而維系宿主腸道健康。腸道模式識(shí)別受體TLR可通過識(shí)別腸道細(xì)菌產(chǎn)生的病原體相關(guān)分子信號(hào)來調(diào)節(jié)腸道上皮的免疫應(yīng)答。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，攝食含有高直鏈的豌豆淀粉飼糧下調(diào)了育肥豬結(jié)腸黏膜中TLR2、TLR4、MyD88、NF-κB和IFN-γ的mRNA相對(duì)表達(dá)量，而上調(diào)了抗炎因子IL-10的mRNA相對(duì)表達(dá)量和蛋白濃度，同時(shí)上調(diào)了屏障功能相關(guān)基因ZO-1和claudin-2的mRNA相對(duì)表達(dá)量。Ren等[9]在育肥豬上的研究也發(fā)現(xiàn)，攝食高直鏈淀粉/支鏈淀粉值的飼糧顯著下調(diào)了結(jié)腸黏膜炎性細(xì)胞因子的表達(dá)水平，進(jìn)而維系其腸道健康。TLR2可通過識(shí)別腸道細(xì)菌產(chǎn)生的磷壁酸，進(jìn)而激活腸道黏膜免疫反應(yīng)[48]。TLR4是另一種重要的腸道上皮模式識(shí)別受體，可通過MyD88依賴性信號(hào)通路激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的表達(dá)，進(jìn)而刺激炎性細(xì)胞因子、趨化因子和活化T細(xì)胞的產(chǎn)生[49]。IFN-γ屬于促炎細(xì)胞因子，參與機(jī)體炎癥反應(yīng)以抵御病原微生物，其過度表達(dá)可導(dǎo)致腸上皮細(xì)胞屏障功能紊亂，抑制動(dòng)物的生長(zhǎng)并降低生產(chǎn)效益。IL-10屬于限制免疫反應(yīng)中組織過度損傷的關(guān)鍵抗炎因子，可阻止免疫反應(yīng)的過度激活并發(fā)揮抗炎作用[50]。封閉蛋白(claudin)和ZO-1是組成腸黏膜機(jī)械屏障完整性并決定腸道通透性的主要蛋白分子，能夠封閉腸道上皮細(xì)胞之間蛋白的間隙，進(jìn)而有效阻止腸道中細(xì)菌和毒素的旁細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)[51]。有研究表明，腸道微生物組成及其代謝產(chǎn)物的改變可影響腸道健康，如雙歧桿菌屬的細(xì)菌可上調(diào)仔豬腸道IL-10的表達(dá)[52]，乳酸桿菌屬細(xì)菌可改善仔豬腸上皮屏障功能，減少產(chǎn)腸毒素型大腸桿菌的定殖，促進(jìn)腸道健康[53]；大腸桿菌可通過TLR4信號(hào)通路引發(fā)腸道炎癥[54]；丁酸可通過抑制核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的活性，進(jìn)而發(fā)揮抗炎癥和維系腸道屏障功能完整性的作用[55]；微生物含氮代謝產(chǎn)物，如生物胺、酚和吲哚類等物質(zhì)對(duì)腸道上皮具有產(chǎn)生促炎癥的效應(yīng)[56]。本試驗(yàn)前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，豌豆淀粉飼糧降低了結(jié)腸食糜中大腸桿菌數(shù)量以及生物胺、酚和吲哚類物質(zhì)的濃度，提高了乳酸桿菌和雙歧桿菌屬細(xì)菌的數(shù)量以及乳酸、乙酸和丁酸等短鏈脂肪酸的濃度[14]。因此，本試驗(yàn)中豌豆淀粉飼糧通過減弱TLR4-MyD88-NF-κB信號(hào)通路的激活，進(jìn)而下調(diào)促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，上調(diào)抗炎因子和屏障功能相關(guān)基因的表達(dá)，其原因可能是豌豆淀粉飼糧增加了結(jié)腸食糜中雙歧桿菌和乳酸桿菌屬細(xì)菌的數(shù)量以及短鏈脂肪酸類物質(zhì)的濃度，從而減少潛在致病菌大腸桿菌的數(shù)量和含氮代謝產(chǎn)物的濃度，進(jìn)而維系了結(jié)腸黏膜的免疫穩(wěn)態(tài)，但其具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

免疫球蛋白對(duì)病毒和細(xì)菌等微生物具有抗體活性，可通過抑制其增殖，進(jìn)而減少其黏附在腸黏膜上[57]。本研究還發(fā)現(xiàn)，攝食豌豆淀粉飼糧提高了育肥豬結(jié)腸黏膜中sIgA和IgG的蛋白濃度。腸黏膜sIgA和IgG對(duì)維持黏膜免疫和微生物區(qū)系的穩(wěn)態(tài)具有重要的調(diào)控作用，sIgA可結(jié)合細(xì)菌的表面多糖，包被在細(xì)菌表面，引起細(xì)菌凝集，形成局部免疫屏障，進(jìn)而減少微生物對(duì)黏膜的損傷[58]。IgG在免疫應(yīng)答反應(yīng)中可活化補(bǔ)體，清除病原體[57]。因此，本試驗(yàn)中結(jié)腸黏膜中sIgA和IgG濃度的提高，表明攝食含有高直鏈的豌豆淀粉飼糧可增強(qiáng)腸道免疫系統(tǒng)的防御功能。此外，本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，豌豆淀粉飼糧提高了血清中抗炎細(xì)胞因子IL-10和IgA的濃度，降低了血清中促炎因子IL-8和IFN-γ的濃度。血清中免疫球蛋白和細(xì)胞因子的濃度可反映動(dòng)物機(jī)體系統(tǒng)免疫能力的高低。因此，本試驗(yàn)中血清中相關(guān)免疫指標(biāo)的改變表明攝食含有高直鏈的豌豆淀粉飼糧具有提高育肥豬系統(tǒng)免疫力的作用，進(jìn)而促進(jìn)其生長(zhǎng)。

4 結(jié) 論

綜上所述，本研究結(jié)果表明，與含有低直鏈的木薯淀粉相比，給育肥豬飼喂含有高直鏈的豌豆淀粉飼糧可顯著提高育肥豬對(duì)飼糧粗蛋白質(zhì)的表觀消化率，降低血清中尿素氮、葡萄糖及脂代謝相關(guān)物質(zhì)的濃度；同時(shí)具有促進(jìn)結(jié)腸有益菌增殖，降低潛在致病菌生長(zhǎng)，進(jìn)而維系其結(jié)腸黏膜和系統(tǒng)免疫的穩(wěn)態(tài)。以上結(jié)果表明攝食含有高直鏈的淀粉對(duì)整個(gè)機(jī)體的健康具有益生作用。