銅代謝穩(wěn)態(tài)失調(diào)與神經(jīng)退行性疾病的相關(guān)性研究進(jìn)展

李建平， 王 剛

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，上海200025）

銅（Cu）是人體內(nèi)不可或缺的金屬元素之一，參與多種生理過(guò)程，包括氧代謝、膠原蛋白合成、皮膚色素沉著、鐵穩(wěn)態(tài)以及抗氧化防御等。特別是在神經(jīng)系統(tǒng)中，銅參與髓鞘形成，調(diào)節(jié)突觸活動(dòng)以及興奮性神經(jīng)元死亡和信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)。因此，維持體內(nèi)銅代謝穩(wěn)態(tài)十分必要。現(xiàn)有研究表明，銅代謝穩(wěn)態(tài)的失調(diào)在肝豆?fàn)詈俗冃訹又稱威爾遜病（Wilson disease,WD）]、帕金森?。≒arkinson disease,PD）、阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD）等神經(jīng)退行性疾病中扮演了重要角色，參與了神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病。因此，調(diào)控這一過(guò)程有望為臨床提供新的治療策略。本文綜述了銅代謝穩(wěn)態(tài)失調(diào)與神經(jīng)退行性疾病相關(guān)性的研究進(jìn)展。

銅穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)

人體內(nèi)的銅主要來(lái)源于飲食攝入，如豆類、海鮮、堅(jiān)果和綠葉蔬菜等富含銅的食物，并在器官組織中廣泛分布，其中以肝、腦、心、腎中的濃度較高[1]。

一、細(xì)胞中的銅穩(wěn)態(tài)

肝臟是人體內(nèi)銅濃度最高的器官，負(fù)責(zé)體內(nèi)主要的銅代謝調(diào)節(jié)。在肝細(xì)胞中，銅離子與超氧化物歧化酶銅伴侶蛋白（copper chaperones for superoxide dismutase 1，CCS）特異性結(jié)合，參與氧化、合成、分泌等多種生理過(guò)程。CCS可將銅傳遞至超氧化物歧化酶1（superoxide dismutase 1，SOD1），發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用。細(xì)胞色素C氧化酶17（cytochrome C oxidase 17，COX17）將銅運(yùn)載至攜銅 蛋白SCO1和SCO2，與COX一起參與到線粒體呼吸鏈中[2]。由CCS ATOX1將銅傳遞至ATP7A和ATP7B 2種ATP酶是胞內(nèi)銅穩(wěn)態(tài)的核心通路。ATP7A定位于細(xì)胞膜，可以動(dòng)員肝細(xì)胞中儲(chǔ)存銅釋放入血液中，維持外周循環(huán)中有效銅濃度。ATP7B蛋白主要定位在反面高爾基體網(wǎng)（trans Golgi network，TGN）上，負(fù)責(zé)銅藍(lán)蛋白（ceruloplasmin,CP）合成和向膽汁中分泌過(guò)量的銅[3]。銅在細(xì)胞內(nèi)沉積可能增加銅介導(dǎo)的氧化損傷風(fēng)險(xiǎn)，而金屬硫蛋白（metallothionein，MT）和谷胱甘肽（glutathione，GSH）則是參與細(xì)胞內(nèi)絡(luò)合和儲(chǔ)存過(guò)量銅的主要分子[4]（見圖1A）。

二、體內(nèi)主要銅代謝路徑

從人體整體水平看，銅代謝主要由肝臟、腦、血液等構(gòu)成穩(wěn)態(tài)平衡。膳食銅通過(guò)銅轉(zhuǎn)運(yùn)體1（copper transporter 1,CTR1）在小腸被腸上皮細(xì)胞吸收后經(jīng)ATP7A釋放到門靜脈循環(huán)中。大部分新吸收的銅再經(jīng)CTR1介導(dǎo)進(jìn)入肝細(xì)胞。肝細(xì)胞內(nèi)過(guò)量的銅被ATP7B以囊泡形式分泌到膽汁中，經(jīng)消化道排出體外。當(dāng)外周銅濃度下降，ATP7A可以將銅從肝臟儲(chǔ)存中調(diào)動(dòng)到血液中，維持外周循環(huán)有效的銅濃度。腦銅濃度僅次于肝臟，銅經(jīng)CTR1與ATP7A轉(zhuǎn)運(yùn)透過(guò)血腦屏障分布至不同腦區(qū)是另一條重要代謝路徑。孕婦相關(guān)的銅代謝除了傳統(tǒng)路徑外，乳汁中的銅由ATP7B轉(zhuǎn)運(yùn)通過(guò)乳腺分泌，胎兒生長(zhǎng)發(fā)育所需的銅則由ATP7A轉(zhuǎn)運(yùn)通過(guò)胎盤輸送至胎兒循環(huán)中[6]（見圖1B）。

圖1 銅穩(wěn)態(tài)及代謝示意圖[5-6]

WD中銅穩(wěn)態(tài)失調(diào)

WD是一種常染色體隱性遺傳的銅代謝障礙疾病，1993年，ATP7B基因突變致病學(xué)說(shuō)提出，進(jìn)一步豐富了WD發(fā)病機(jī)制。

一、ATP7B結(jié)構(gòu)與功能

ATP7B是WD發(fā)病機(jī)制中銅代謝障礙的核心突變基因，定位于13q14.3，包含20個(gè)內(nèi)含子和21個(gè)外顯子，負(fù)責(zé)編碼P型銅轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶。ATP7B膜蛋白具有8次跨膜結(jié)構(gòu)，其核心結(jié)構(gòu)包括：N端的銅離子結(jié)合域共6個(gè)亞基甲基化CpG結(jié)合域（methyl-CpG-binding domain，MBD）、8次跨膜結(jié)構(gòu) 域 （trans-membrane domain，TMD）、ATP核 苷 酸 結(jié) 合 域（nucleotide binding domain，NBD），以及1個(gè)C端[7]。當(dāng)前對(duì)ATP7B蛋白功能研究主要集中在6個(gè)MBD亞基，也是ATP7B蛋白主要的活性部位。每個(gè)MBD都可以結(jié)合1個(gè)銅離子，其中最靠近膜的MBD5、MBD6是決定銅轉(zhuǎn)運(yùn)效率的主要功能亞基，而MBD1～4主要在銅的催化活性調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用[7-8]。

ATP7B在肝細(xì)胞中高表達(dá)，主要定位于TGN，將胞質(zhì)中由ATOX1蛋白攜帶的銅離子運(yùn)載至此，用于CP的生物合成；當(dāng)胞質(zhì)內(nèi)銅離子濃度增加時(shí)，ATP7B從TGN上解離下來(lái)，向肝細(xì)胞間隙的膽小管移動(dòng)，通過(guò)膽汁分泌將多余的銅排出體外[3]。

二、ATP7B突變與功能改變、臨床表型的關(guān)系

根據(jù)人類基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)顯示，截至2020年，已報(bào)道有超過(guò)800個(gè)ATP7B基因突變，使得WD呈現(xiàn)臨床表型多樣性與個(gè)體異質(zhì)性。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析ATP7B基因錯(cuò)義突變最為普遍，在歐美人群中，外顯子14中錯(cuò)義突變H1069Q最為常見，亞洲人群更常見的突變型則是外顯子8中的R778L[9]。

ATP7B基因突變可能影響下游轉(zhuǎn)錄、翻譯、修飾等諸多功能障礙，總的來(lái)看，常見的ATP7B突變所致蛋白功能影響有以下兩類：ATP7B蛋白錯(cuò)誤定位與ATP7B蛋白催化活性喪失。ATP7B突變主要集中在N端信號(hào)肽的6個(gè)MBD，往往阻礙蛋白的跨膜定位功能，以N41S突變?yōu)槔齕10]，作為N端信號(hào)肽區(qū)發(fā)現(xiàn)的唯一致病基因型，其可阻斷ATP7B蛋白膜上定位過(guò)程。同時(shí)也有研究發(fā)現(xiàn)，有部分突變型，如L168P、BS1423N、BH1069Q等[10]，銅轉(zhuǎn)運(yùn)能力并未受損，僅因?yàn)樽陨淼鞍讟?gòu)象的轉(zhuǎn)變導(dǎo)致無(wú)法正常發(fā)揮催化活性，進(jìn)而影響了后續(xù)銅轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程。

ATP7B基因突變導(dǎo)致編碼蛋白結(jié)構(gòu)變化，結(jié)構(gòu)決定功能，不同的蛋白功能也預(yù)示著臨床表型多樣性。因此，建立ATB7B基因突變型與臨床表型的關(guān)聯(lián)一直是該領(lǐng)域內(nèi)研究的熱點(diǎn)與挑戰(zhàn)。目前已經(jīng)有了一些發(fā)現(xiàn)，L492S、E541K、L549P、A604P、R616W等突變型可能預(yù)示著發(fā)病年齡更早[11]；另與H1069Q雜合子突變相比，H1069Q純合型突變往往發(fā)病較晚，神經(jīng)系統(tǒng)表現(xiàn)更加顯著[9]；同時(shí)還有針對(duì)中國(guó)人群的研究發(fā)現(xiàn)，R778L突變型除了發(fā)病年齡更早，還伴有低血清銅和CP水平，相對(duì)的R919G、T935M突變型則提示高血漿CP水平[12]。此外還有研究指出，截短突變與患者較早出現(xiàn)癥狀并發(fā)急性肝衰竭有很大相關(guān)性[13]。這些發(fā)現(xiàn)為臨床依據(jù)患者突變基因型分析具體發(fā)病機(jī)制，展開早期針對(duì)性治療提供了可能。然而目前基因型-表型相關(guān)性研究結(jié)果尚不十分確定[10,14-16]，一方面這種關(guān)聯(lián)性分析需要建立在嚴(yán)謹(jǐn)證據(jù)——大樣本人群數(shù)據(jù)研究基礎(chǔ)上，另一方面，WD患者臨床表型異質(zhì)性大，往往發(fā)現(xiàn)較晚，多種癥狀重疊且嚴(yán)重程度不一，還有環(huán)境飲食等多因素的復(fù)雜影響。

三、銅毒性介導(dǎo)的相關(guān)發(fā)病機(jī)制

WD中銅代謝障礙致病機(jī)制主要通過(guò)銅離子的氧化還原活性導(dǎo)致全身銅毒性積累。銅誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激常以線粒體為敏感靶標(biāo)，可以使心磷脂斷裂，破壞線粒體膜的完整性與功能。在WD患者肝臟中發(fā)現(xiàn)了由于呼吸鏈相關(guān)酶低活性所致的嚴(yán)重線粒體功能障礙，在體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)銅誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激可促使線粒體通透性轉(zhuǎn)變，因此線粒體損傷被認(rèn)為是WD發(fā)病的初始事件[5,17]。

肝臟作為調(diào)節(jié)全身銅穩(wěn)態(tài)的中樞器官，銅毒性積累導(dǎo)致的肝損傷最早、也是最常出現(xiàn)。WD患者的肝銅濃度通常增加約5倍，病程早期即可檢測(cè)到肝細(xì)胞線粒體完整性和功能損傷，肝臟能量代謝受損和膽固醇生物合成相關(guān)基因的下調(diào)，進(jìn)而導(dǎo)致肝臟脂肪變性[18]。慢性肝細(xì)胞損傷和死亡最終導(dǎo)致肝炎與肝纖維化。

WD患者大腦中的銅濃度可以增加10～15倍，對(duì)11例WD患者死后大腦研究證實(shí)了腦銅沉積與腦組織損傷嚴(yán)重程度之間的關(guān)聯(lián)性[19-20]。銅毒性首先被星形膠質(zhì)細(xì)胞緩沖，腦組織銅水平升高和腦部微環(huán)境的改變會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元和其他膠質(zhì)細(xì)胞相繼受損。不同腦區(qū)病變嚴(yán)重程度不一，表現(xiàn)出的神經(jīng)系統(tǒng)癥狀也迥異。殼核是WD患者腦部病理變化最顯著區(qū)域，其病變主要與肌張力障礙和PD綜合征相關(guān)。皮質(zhì)-紋狀體通路的功能障礙可能導(dǎo)致精神癥狀和認(rèn)知缺陷，主要影響執(zhí)行功能。齒狀核-紅核-丘腦通路受損與意向性震顫相關(guān)[21-22]。

除了肝臟與腦部主要的銅毒性表現(xiàn)，銅在角膜、紅細(xì)胞、骨骼肌和心肌細(xì)胞、大關(guān)節(jié)滑膜和腎實(shí)質(zhì)中也有沉積，導(dǎo)致WD的其他器官系統(tǒng)臨床表現(xiàn)，例如角膜色素環(huán)（Kayser-Fleischer ring，K-F環(huán)）、溶血性貧血、橫紋肌溶解以及腎小管損傷。

PD中銅穩(wěn)態(tài)失調(diào)

PD是中老年人多見的神經(jīng)退行性疾病，主要病理表現(xiàn)為中腦黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元進(jìn)行性變性丟失，殘存多巴胺神經(jīng)元內(nèi)富含α-突觸核蛋白路易體形成。

一、PD銅濃度差異

PD中銅濃度變化與PD發(fā)病相關(guān)性存在爭(zhēng)論，有學(xué)說(shuō)認(rèn)為過(guò)量銅毒性參與了PD病理進(jìn)展，也有研究表明銅缺乏與PD發(fā)病相關(guān)。對(duì)PD患者血液、腦脊液及腦實(shí)質(zhì)中銅含量的薈萃分析發(fā)現(xiàn)，PD血液中銅濃度沒(méi)有一致性的差異[23]，值得一提的是各項(xiàng)研究之間的異質(zhì)性仍需充分考慮。對(duì)PD腦脊液中銅濃度分析結(jié)果也頗具爭(zhēng)議，早期研究者對(duì)24例PD患者和34例對(duì)照者的分析顯示，PD患者腦脊液銅濃度增加[24]。緊接著就受到大量研究結(jié)果的挑戰(zhàn)，后來(lái)者又薈萃分析了215例PD患者和119例對(duì)照者，發(fā)現(xiàn)PD患者腦脊液銅水平?jīng)]有差異[23]。對(duì)腦實(shí)質(zhì)中銅含量分析結(jié)果較為確切，冰凍切片發(fā)現(xiàn)在PD病變嚴(yán)重的腦區(qū)，包括黑質(zhì)、尾狀核，銅含量相對(duì)下降了34%～51%，用更敏感的電子顯微鏡成像分析，進(jìn)一步確認(rèn)神經(jīng)元內(nèi)銅顯著減少55%～65%[25]。

二、銅和α-突觸核蛋白相互作用

體外實(shí)驗(yàn)表明銅和α-突觸核蛋白有直接相互作用：Cu2+、Cu+都可以在2個(gè)結(jié)構(gòu)域直接與α-突觸核蛋白特異性結(jié)合[26]。理論上，Cu2+還原為Cu+可以提高中樞神經(jīng)系統(tǒng)微環(huán)境中過(guò)氧化氫（H2O2）等活性氧 （reactive oxygen species，ROS）水平，導(dǎo)致神經(jīng)元損傷。此外，模型分析顯示α-突觸核蛋白在與銅相互結(jié)合后減少了多肽鏈中負(fù)電荷之間的靜電排斥，肽鏈的部分錯(cuò)誤折疊構(gòu)象更穩(wěn)定，α-突觸核蛋白聚集的傾向性增加[27]。銅還可以通過(guò)其他銅親和蛋白對(duì)α-突觸核蛋白發(fā)揮間接調(diào)控作用。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)ATOX1、Ctr1都可以抑制α-突觸核蛋白折疊聚集，減輕PD病理改變[28-29]。

還有研究發(fā)現(xiàn)銅一方面可以與多巴胺協(xié)同作用，增強(qiáng)α-突觸核蛋白的聚集傾向，一方面又可以直接參與多巴胺的氧化反應(yīng)，進(jìn)而誘導(dǎo)多巴胺神經(jīng)的氧化損傷，加劇PD病理變化[30-31]。

三、CP、銅蛋白與氧化應(yīng)激

CP既參與銅代謝穩(wěn)態(tài)，又在鐵代謝平衡中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。CP可以抑制Fe2+介導(dǎo)的ROS產(chǎn)生，還可以結(jié)合銅離子，減輕氧化應(yīng)激所致的組織損傷和功能障礙，具有抗氧化活性和神經(jīng)保護(hù)作用[32]。PD腦部的CP濃度和活性降低，特別是在AT突變基因型患者中發(fā)現(xiàn)腦脊液中CP活性下降并存黑質(zhì)區(qū)的鐵沉積，進(jìn)一步揭示了CP參與PD相關(guān)病理進(jìn)展的機(jī)制[33]。另一項(xiàng)利用PD小鼠模型的研究發(fā)現(xiàn)，外源性CP輸注可以減輕PD的神經(jīng)病理表現(xiàn)[34]。因此，對(duì)CP的腦內(nèi)外調(diào)節(jié)可能是延緩PD病理進(jìn)展的策略之一，引起研究者的興趣與關(guān)注。

SOD1是重要的銅蛋白，作為抵抗ROS的第一道防線，廣泛參與PD大腦微環(huán)境中的氧化應(yīng)激反應(yīng)，有學(xué)者建議可將SOD1作為PD治療的潛在新靶點(diǎn)[35-36]。

AD中銅穩(wěn)態(tài)失調(diào)

AD是一種由遺傳和環(huán)境等多因素引起的神經(jīng)退行性疾病，主要病理特征包括β-淀粉樣蛋白（amyloid-β，Aβ）斑塊沉積、Tau蛋白異常磷酸化形成神經(jīng)原纖維纏結(jié)（nerve fiber tangles，NFT）。

一、AD銅濃度差異

與PD相似，早期研究關(guān)于AD中銅缺乏還是銅過(guò)載存在很大爭(zhēng)議，直到2012年，相互矛盾的研究結(jié)果引發(fā)了關(guān)于AD中銅濃度的廣泛討論。結(jié)合1984年至2017年間研究的薈萃分析顯示[37-40]，無(wú)論是結(jié)合銅還是游離銅，AD患者中的濃度都高于健康對(duì)照人群。盡管AD的發(fā)病機(jī)制仍在討論中，但已經(jīng)能夠證實(shí)銅和鐵的異常代謝參與了AD中Aβ沉積與Tau蛋白異常折疊的病理進(jìn)展。

二、銅和AD關(guān)鍵蛋白相互作用

體外研究表明，低濃度的銅離子即可誘導(dǎo)Aβ聚集，銅離子與Aβ肽鏈N端酪氨酸殘基高親和力結(jié)合，并通過(guò)氧化修飾來(lái)誘導(dǎo)Aβ低聚化，不僅能促進(jìn)Aβ斑塊沉積，還可以通過(guò)Cu2+還原為Cu+產(chǎn)生氧化神經(jīng)毒性[41]。在小鼠AD模型的海馬齒狀回斑塊沉積區(qū)就檢測(cè)到高濃度的銅離子。

與Aβ類似，淀粉樣前體蛋白（amyloid precusor protein，APP）也可將Cu2+結(jié)合到肽鏈N端氧化還原為Cu+[41]，有趣的是研究發(fā)現(xiàn)，腦部銅含量越低，內(nèi)吞APP的比例越高，因此Aβ的沉積被認(rèn)為可能是減少銅不必要損失的一種防御機(jī)制[42]。Tau蛋白異常磷酸化形成NFT過(guò)程也被證明有銅的參與，而銅與Tau激酶和磷酸酶作用的具體機(jī)制則需進(jìn)一步研究闡明[43]。

其他神經(jīng)退行性疾病中銅穩(wěn)態(tài)失調(diào)

神經(jīng)退行性疾病中銅穩(wěn)態(tài)失調(diào)還包括以下3種。①門克斯病 （Menkes disease）：是 一 種X連鎖隱性遺傳 病，由ATP7A基因突變導(dǎo)致銅吸收障礙所致。通常發(fā)病于2～3個(gè)月大的男嬰，其特征是神經(jīng)發(fā)育遲緩和癲癇發(fā)作。如果沒(méi)有早期診斷和腸外銅替代治療，通常發(fā)病數(shù)年后即可死亡。其中極輕型門克斯病又稱枕角綜合征（occipital horn syndrome），是由ATP7A的另一等位基因突變引起的銅代謝異常疾病，其神經(jīng)系統(tǒng)癥狀相對(duì)較輕，主要表現(xiàn)為輕度肌無(wú)力、直立性低血壓和慢性腹瀉，往往更晚被診斷。②MEDNIK綜合征（mental retardation-enteropathy-deafness-neuropathy-ichthyosiskeratoderma syndrome，MEDNIK syndrome）：是一種常染色體隱性遺傳病，因?yàn)楸憩F(xiàn)為智力低下、腸病、耳聾、神經(jīng)疾病、魚鱗病和角化病六大癥狀而綜合得名，是由AP1S1基因突變引起，導(dǎo)致銅ATP酶運(yùn)輸異常，血清銅、CP減少和肝銅沉積，類似于WD表現(xiàn)。③遺傳性CP缺乏癥（aceruloplasminemia）是由于CP基因突變所致的常染色體隱性遺傳病,也是銅代謝異常相關(guān)神經(jīng)退行性疾病一種，表現(xiàn)為神經(jīng)系統(tǒng)癥狀、糖尿病和與全身鐵累積相關(guān)的小細(xì)胞性貧血，通常伴有血清銅濃度降低。

小 結(jié)

神經(jīng)退行性疾病發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，而銅穩(wěn)態(tài)失調(diào)在這些疾病中表現(xiàn)和作用也不盡相同，特別是銅穩(wěn)態(tài)失調(diào)與神經(jīng)退行性疾病之間的因果關(guān)系仍存在較大爭(zhēng)議，目前比較確切的共性作用是銅的氧化還原活性可以誘導(dǎo)廣泛的氧化應(yīng)激反應(yīng)，可能導(dǎo)致脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、DNA和RNA分子損傷。線粒體作為氧化應(yīng)激的敏感靶標(biāo)，其功能障礙往往被認(rèn)為是病理表現(xiàn)的初始事件。值得注意的是，CP作為媒介，一方面是銅代謝重要組成部分，另一方面又在鐵穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，同時(shí)還具有抗氧化活性和神經(jīng)保護(hù)作用，可能是神經(jīng)退行性疾病發(fā)病機(jī)制中重要一環(huán)。因此，銅穩(wěn)態(tài)研究有助于更進(jìn)一步闡明神經(jīng)退行性疾病之間共同的機(jī)制，為臨床提供新的治療策略。