赤霉素浸種對(duì)柴胡種子發(fā)芽及內(nèi)源激素變化的影響

袁夢(mèng)佳， 楊太新， 孫延超

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/省部共建華北作物改良與調(diào)控國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/河北省作物生長(zhǎng)調(diào)控實(shí)驗(yàn)室， 河北 保定 07001)

柴胡為傘形科植物柴胡(BupleurumchinenseDC.)或狹葉柴胡(BupleurumscorzonerifoliumWilld.)的干燥根，按性狀不同，分別習(xí)稱“北柴胡”和“南柴胡”，具有疏散退熱、疏肝解郁、升舉陽(yáng)氣之功效，用于感冒發(fā)熱、寒熱往來(lái)、胸脅脹痛、月經(jīng)不調(diào)、子宮脫垂、脫肛等癥[1]。

近年來(lái)，隨著柴胡藥材需求量的增加，人工栽培面積不斷擴(kuò)大，但柴胡種子存在發(fā)芽率低、發(fā)芽時(shí)間長(zhǎng)等問(wèn)題，導(dǎo)致柴胡生產(chǎn)中播種量較大且難以保證苗全苗勻，嚴(yán)重影響了柴胡產(chǎn)量的提高和質(zhì)量的穩(wěn)定。種子萌發(fā)是一個(gè)由多種激素共同調(diào)節(jié)的復(fù)雜過(guò)程[2]。脫落酸(ABA)具有誘導(dǎo)種子休眠，抑制種子萌發(fā)，抑制赤霉素(GA3)生物合成及其信號(hào)傳導(dǎo)等作用，ABA含量的下降又是種子萌發(fā)和生長(zhǎng)的先決條件[3-5]；GA3在種胚發(fā)育過(guò)程中的作用是促進(jìn)種胚周圍的物質(zhì)軟化和加速胚細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化，并誘導(dǎo)一些酶類的合成與表達(dá)，來(lái)加快貯存物質(zhì)的分解和具有胚軸結(jié)構(gòu)物質(zhì)的合成[6-7]；生長(zhǎng)素(IAA)對(duì)種子萌發(fā)的調(diào)控具有雙面性，即適宜濃度IAA促進(jìn)種子萌發(fā)，過(guò)高濃度對(duì)種子有抑制作用[8]。玉米素苷(ZR)是屬于細(xì)胞分裂素一類的植物激素，在植物生長(zhǎng)和發(fā)育過(guò)程中起著重要的調(diào)控作用[9-11]。關(guān)于GA3浸種影響柴胡種子發(fā)芽的研究已有報(bào)道，孫延超[12]用不同濃度GA3溶液對(duì)柴胡種子進(jìn)行浸種處理，結(jié)果表明，種子的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率均呈顯著差異；周潔等[13]研究表明，濃度為100～250 mg·L-1的GA3處理31號(hào)柴胡種子，提高了種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)，且能使萌發(fā)啟動(dòng)日提前。但有關(guān)GA3浸種后柴胡種子發(fā)芽過(guò)程中的內(nèi)源激素變化未見(jiàn)報(bào)道。因此本研究以冀柴1號(hào)為試驗(yàn)材料，研究不同濃度GA3浸種對(duì)柴胡種子發(fā)芽的影響，測(cè)定分析種子發(fā)芽過(guò)程中ABA、GA3、IAA、ZR的含量變化，為揭示柴胡種子萌發(fā)調(diào)控及提高柴胡種子發(fā)芽率提供理論依據(jù)和可行方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試冀柴1號(hào)柴胡種子來(lái)源于河北省邯鄲市涉縣柴胡種植基地。

1.2 儀器與試劑

BIC-250人工氣候培養(yǎng)箱、BS-223 S電子分析天平、Agilent 1260型高效液相色譜儀、KQ-300 VDV型雙頻數(shù)控超聲波清洗器、HG-9240 A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、TDZ 4-WS低速臺(tái)式離心機(jī)、NAI-DCY-24 F型氮吹儀、MDF-382 E超低溫冰箱。

ABA、GA3、IAA、ZR的標(biāo)準(zhǔn)品均從Solarbio公司購(gòu)進(jìn)，甲醇(色譜醇)、娃哈哈純凈水，其余試劑均為分析純。

1.3 試驗(yàn)方法

分別用濃度為0(ck)、50 mg·L-1、100 mg·L-1、150 mg·L-1和200 mg·L-1的GA3溶液浸泡柴胡種子12 h，進(jìn)行種子發(fā)芽試驗(yàn)，測(cè)定各處理浸種的柴胡種子萌發(fā)啟動(dòng)時(shí)間、高峰期、發(fā)芽勢(shì)及發(fā)芽率，分析種子發(fā)芽過(guò)程中ABA、GA3、IAA、ZR的含量變化。

1.3.1發(fā)芽率的測(cè)定

取不同浸種處理的柴胡種子進(jìn)行紙培發(fā)芽試驗(yàn)，每皿100粒，16 h黑暗8 h光照，發(fā)芽溫度為20 ℃，每個(gè)處理重復(fù)3次。每天記錄種子發(fā)芽數(shù)，計(jì)算其發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率等指標(biāo)。

發(fā)芽勢(shì)(%)=(規(guī)定時(shí)間內(nèi)發(fā)芽種子數(shù)/供試種子總數(shù))×100%;

發(fā)芽率(%)=(發(fā)芽種子數(shù)/供試種子總數(shù))×100%。

1.3.2內(nèi)源激素含量的測(cè)定

每個(gè)處理分別發(fā)芽50皿，每隔0、8、16、24、32 d觀察記錄發(fā)芽情況，并將柴胡種子鮮樣置于液氮中速凍，然后放入-80 ℃超低溫冰箱保存，用于內(nèi)源激素檢測(cè)。用高效液相色譜法測(cè)定種子發(fā)芽過(guò)程中ABA、GA3、IAA和ZR的含量。

1) 色譜條件：色譜柱AgilentTC-C 18柱(4.6×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相A：甲醇，流動(dòng)相B：pH=3冰乙酸，進(jìn)行梯度洗脫(表1)；流速1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量每次10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm；柱溫30 ℃。

表1 梯度洗脫程序

2) 對(duì)照品溶液的制備：精密稱取IAA、GA3、ABA和ZR標(biāo)準(zhǔn)品各0.005 g，用甲醇溶解定容到100 mL的棕色容量瓶中，配制成50 mg·L-1的母液，過(guò)0.45 μm有機(jī)濾膜，即為混合對(duì)照品溶液。

3) 樣品的制備：稱取約1.000 g發(fā)芽中的柴胡種子至預(yù)冷研缽中,加入預(yù)冷的80%甲醇溶液8 mL(加抗氧化劑BTH)，用液氮研磨勻漿，4 ℃避光浸提16 h。浸提液4 ℃ 16 000 r·min-1離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液至10 mL離心管中，加入0.2 g·g-1試樣的PVPP去除酚類等雜質(zhì)，超聲震蕩40 min過(guò)濾，濾液過(guò)C 18固相萃取柱，將流出液氮吹至水相(1.5～2.0 mL)。水相用1 mol·L-1檸檬酸調(diào)節(jié)pH=3.0，加入3 mL乙酸乙酯萃取，超聲震蕩40 min，轉(zhuǎn)移上部液體至新的離心管氮吹(吹干乙酸乙酯)，之后加2 mL甲醇復(fù)溶，過(guò)0.45 μm有機(jī)濾膜即進(jìn)瓶樣品，樣品備用[14-15]。

4) 線性關(guān)系建立：將混合對(duì)照品溶液用0.45 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾，分別精密吸取混合對(duì)照品溶液2.5、5.0、7.5、10.0、12.5 μL，注入液相色譜儀，按上述色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖。橫坐標(biāo)為進(jìn)樣體積，縱坐標(biāo)為峰面積，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算出回歸方程：

ABA，Y1=4 810.9x+142(r2=0.999 9)；

GA3，Y2=82.651X+41.383(r2=0.999 3)；

IAA，Y3=787.55x+4.702(r2=0.999 8)；

ZR，Y4=89.121X+68.542(r2=0.999 4)。

1.3.3數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，利用軟件SPSS 23.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 GA3浸種對(duì)種子發(fā)芽的影響

由表2可見(jiàn)，不同濃度GA3溶液浸種處理，使柴胡種子的萌發(fā)啟動(dòng)時(shí)間提前1～3 d，萌發(fā)高峰期提前1～3 d，種子的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率均顯著提高。隨著GA3濃度的增大，種子發(fā)芽率呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢(shì)，150 mg·L-1處理的種子發(fā)芽率最高(64.5%)，200 mg·L-1處理的發(fā)芽率降低(41.7%)；種子發(fā)芽勢(shì)表現(xiàn)相同的變化趨勢(shì)，150 mg·L-1處理的種子發(fā)芽勢(shì)最高(30.1%)，200 mg·L-1處理的發(fā)芽勢(shì)降低(17.4%)。

表2 不同浸種處理的柴胡種子發(fā)芽狀況

2.2 種子發(fā)芽過(guò)程中內(nèi)源激素含量的變化

2.2.1種子發(fā)芽過(guò)程中的ABA含量變化

不同濃度GA3浸種處理的柴胡種子，發(fā)芽過(guò)程中的ABA含量變化基本一致，均呈“下降-上升-下降”的變化趨勢(shì)(表3)，且均顯著降低了柴胡種子發(fā)芽過(guò)程中的ABA含量，其中以150 mg·L-1處理的作用最為明顯。未萌發(fā)時(shí)，50 mg·L-1、100 mg·L-1、150 mg·L-1、200 mg·L-1處理的種子ABA含量分別為160.33 ng·g-1、154.41 ng·g-1、154.36 ng·g-1、140.00 ng·g-1，比對(duì)照分別下降了6.93%、10.37%、10.40%、18.73%。第16天時(shí)，50 mg·L-1、100 mg·L-1、150 mg·L-1、200 mg·L-1處理的ABA含量在種子發(fā)芽過(guò)程中均最低，分別為36.61 ng·g-1、34.98 ng·g-1、30.77 ng·g-1、38.56 ng·g-1，ABA含量降幅最大，比對(duì)照分別下降了30.92%、34.00%、41.94%、27.25%。

表3 不同浸種處理柴胡種子發(fā)芽過(guò)程中的ABA含量

2.2.2種子發(fā)芽過(guò)程中的GA3含量變化

由表4可知，0 mg·L-1、50 mg·L-1、100 mg·L-1、150 mg·L-1浸種處理的種子GA3含量變化基本一致，均隨發(fā)芽時(shí)間呈“降-升-降-升”的變化，分別在發(fā)芽第8天和第24天出現(xiàn)2個(gè)低峰值，200 mg·L-1處理的種子GA3含量一直呈逐漸下降趨勢(shì)，發(fā)芽第32天時(shí)最低。不同GA3浸種處理均顯著增加了柴胡種子發(fā)芽過(guò)程中的GA3含量，未萌發(fā)和發(fā)芽第8天均以200 mg·L-1處理的最高，分別為16.50 ng·g-1、15.61 ng·g-1；發(fā)芽16 d后均以150 mg·L-1處理的最高，發(fā)芽16 d、24 d、32 d分別為14.71 ng·g-1、9.31 ng·g-1、9.87 ng·g-1，比對(duì)照分別增加了283.07%、233.69%、166.76%。

表4 不同浸種處理柴胡種子發(fā)芽過(guò)程中的GA3含量

2.2.3種子發(fā)芽過(guò)程中的IAA含量變化

由表5可見(jiàn)，對(duì)照的IAA含量變化呈“下降-上升”趨勢(shì)，未萌發(fā)時(shí)最高，為56.01 ng·g-1，第24天降至28.27 ng·g-1，第32天回升至31.74 ng·g-1。50 mg·L-1、100 mg·L-1、150 mg·L-1、200 mg·L-1處理的IAA含量變化基本一致，均呈“降-升-降-升”趨勢(shì)，分別在發(fā)芽第8天和第24天出現(xiàn)2個(gè)低峰值。不同GA3浸種處理均顯著降低了柴胡種子發(fā)芽過(guò)程中的IAA含量，未萌發(fā)時(shí)50 mg·L-1、100 mg·L-1、150 mg·L-1、200 mg·L-1處理的IAA含量分別為48.56 ng·g-1、47.44 ng·g-1、33.88 ng·g-1、32.00 ng·g-1。第24天時(shí)，50 mg·L-1、100 mg·L-1、150 mg·L-1、200 mg·L-1處理的IAA含量在種子發(fā)芽過(guò)程中均最低，分別為25.26 ng·g-1、25.32 ng·g-1、21.67 ng·g-1、18.01 ng·g-1，比對(duì)照分別下降了10.65%、10.44%、23.35%、36.29%。

表5 不同浸種處理柴胡種子發(fā)芽過(guò)程的IAA含量

2.2.4種子發(fā)芽過(guò)程中的ZR含量變化

不同濃度GA3浸種的柴胡種子發(fā)芽過(guò)程中ZR含量均呈“升-降-升”的變化(表6)。與對(duì)照相比，其他處理均顯著增加了柴胡種子發(fā)芽過(guò)程中的ZR含量，其中以150 mg·L-1處理的作用最為明顯。未萌發(fā)時(shí)，50 mg·L-1、100 mg·L-1、150 mg·L-1、200 mg·L-1的ZR含量在種子發(fā)芽過(guò)程均最低，分別為4.99 ng·g-1、4.98 ng·g-1、5.62 ng·g-1、4.64 ng·g-1，第16天時(shí)均最高，分別為7.54 ng·g-1、7.59 ng·g-1、7.81 ng·g-1、7.79 ng·g-1，比對(duì)照分別增加了2.45%、3.13%、6.11%、5.84%。

表6 不同浸種處理柴胡種子發(fā)芽過(guò)程中的ZR含量

2.2.5種子發(fā)芽過(guò)程中的激素比值變化

柴胡種子在發(fā)芽過(guò)程中IAA+GA3+ZR/ABA比值見(jiàn)表7，不同濃度GA3浸種處理的IAA+GA3+ZR/ABA比值均為“升-降-升”的變化。未萌發(fā)時(shí)，150 mg·L-1處理的激素比值為0.362，顯著低于其他處理，發(fā)芽第8天之后，150 mg·L-1處理的激素比值均顯著高于其他處理，其中第16天最高，為1.094，比對(duì)照增長(zhǎng)了111.20%。50 mg·L-1處理的激素比值與100 mg·L-1處理的差異不顯著。

表7 不同浸種處理柴胡種子發(fā)芽過(guò)程中的IAA+GA3+ZR/ABA比值

2.3 種子內(nèi)源激素與種子發(fā)芽率的相關(guān)性分析

不同浸種處理的柴胡種子內(nèi)源激素含量和發(fā)芽率的相關(guān)性分析結(jié)果(表8)表明，種子的ABA含量與發(fā)芽率呈極顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.825。GA3含量、IAA+GA3+ZR/ABA比值與種子發(fā)芽率均呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.968、0.849。ZR含量與種子發(fā)芽率呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.443。IAA含量與種子發(fā)芽率的相關(guān)系數(shù)為0.423，兩者未達(dá)到顯著相關(guān)水平。

表8 柴胡種子發(fā)芽率與內(nèi)源激素的相關(guān)系數(shù)

3 小結(jié)與討論

GA3作為一種信號(hào)物質(zhì)，在促進(jìn)種子發(fā)芽過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，主要有加速細(xì)胞分裂、促進(jìn)成熟細(xì)胞伸長(zhǎng)的作用[3-5]。本研究結(jié)果表明，不同濃度GA3溶液浸種處理均能顯著提高柴胡種子的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率，且均以150 mg·L-1處理的最高，發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率分別為30.1%、64.5%。

種子發(fā)芽與其內(nèi)源激素的含量變化密切相關(guān)[6-7]，GA3具有拮抗ABA的作用，通過(guò)增強(qiáng)種胚的活力來(lái)促進(jìn)種子萌發(fā)[8,11]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照相比，不同濃度GA3浸泡的種子發(fā)芽過(guò)程中ABA含量均顯著降低，GA3含量均顯著增加，表明GA3浸種在降低柴胡種子ABA含量的同時(shí)提高了GA3含量，從而使柴胡種子朝著有利于發(fā)芽的方向發(fā)展。此結(jié)果與王寧等[10]、宋發(fā)軍等[11]的研究結(jié)論一致。另外，不同濃度GA3浸種處理的IAA含量均低于對(duì)照，且IAA含量與柴胡種子發(fā)芽率的相關(guān)系數(shù)為0.423，未達(dá)到顯著水平，這與韓志龍等[16]用GA3處理駝絨藜種子的研究結(jié)論不相符，有待進(jìn)一步探討。種子ZR含量與ABA含量變化趨勢(shì)相反，ABA含量下降時(shí)，ZR含量上升，此結(jié)果也與王寧等[3]的研究結(jié)論基本一致。

影響種子發(fā)芽和休眠的內(nèi)源激素可能不是單獨(dú)起作用的，而是受到激素間交互作用的影響，特別是促進(jìn)與抑制生長(zhǎng)激素之間的比例對(duì)種子發(fā)芽具有重要意義[3,17]，GA3可以通過(guò)影響種子內(nèi)源激素含量及其比值變化從而促進(jìn)種子發(fā)芽[18-20]。本研究結(jié)果表明，柴胡種子發(fā)芽過(guò)程中，不同濃度GA3浸種處理的IAA+GA3+ZR/ABA比值均顯著高于對(duì)照，且該比值與種子發(fā)芽率呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.849。表明GA3處理可能通過(guò)調(diào)節(jié)IAA+GA3+ZR/ABA比值上升，進(jìn)而促進(jìn)柴胡種子發(fā)芽。