丹參種子活力快速測(cè)定方法的建立及其與萌發(fā)率的相關(guān)性

廖 芳， 任瑞花， 孔德英， 劉 偉， 馮 潔， 韓 藝， 李關(guān)榮

(1.天津海關(guān)動(dòng)植物與食品檢測(cè)中心， 天津 300461； 2.西南大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院， 重慶 400716；3.重慶海關(guān)技術(shù)中心， 重慶 401333)

種子的生活力即種子萌發(fā)的潛在能力，是衡量種子質(zhì)量的重要指標(biāo)之一[1-2]。種子活力測(cè)定是種子檢驗(yàn)的重要環(huán)節(jié)，對(duì)種子引進(jìn)、儲(chǔ)藏、交換、播種等生產(chǎn)環(huán)節(jié)，都有十分重要的意義[3]。種子質(zhì)量檢驗(yàn)通常都采用發(fā)芽試驗(yàn)的方法，但發(fā)芽試驗(yàn)時(shí)間較長(zhǎng)，還會(huì)受到水分偏差、病菌的侵入等因素的影響，導(dǎo)致結(jié)果不太可靠[4]。因此快速測(cè)定種子活力非常重要。目前，種子活力的快速測(cè)定方法主要有氯化三苯基四氮唑(TTC)法、紅墨水(或酸性靛藍(lán))法、碘-碘化鉀法、溴麝香草酚藍(lán)(BTB)法等[5-7]。TTC法依賴于種胚呼吸脫下的氫使水溶性氯化三苯基四氮唑(TTC)還原為紅色的脂溶性三苯甲腙(TTF)并附著在種胚表面而使活性種胚著色[8-9]，是標(biāo)準(zhǔn)的種子活力快速測(cè)定法；紅墨水(或酸性靛藍(lán))法依賴于種胚活細(xì)胞的選擇透性不透過(guò)紅墨水(或酸性靛藍(lán))而使胚乳著上紅(藍(lán))色[10-12]；碘-碘化鉀法以測(cè)定種子主要儲(chǔ)藏物質(zhì)淀粉的豐度來(lái)快速測(cè)定種子的活力[3,13]；BTB法利用種胚活細(xì)胞呼吸作用放出的CO2擴(kuò)散使得種粒周圍環(huán)境的酸度增加而使酸堿指示劑BTB顯現(xiàn)黃色[13]，其黃色越深則表明種子活力越強(qiáng)。不同特性(大小，成分、物理特性等)的種子，其適宜的快速測(cè)定活力方法也不同。彭子模等[13]研究表明，碘-碘化鉀法對(duì)蓖麻、油葵、紅花、向日葵、棉花等脂肪類種子生活力的快速測(cè)定效果較好, 而靛藍(lán)染色法和碘-碘化鉀反應(yīng)法均不適合用作檀香種子生活力的快速測(cè)定[3]。

丹參為我國(guó)傳統(tǒng)的大宗藥材之一[14]，其功效包括活血祛瘀、通經(jīng)止痛、清心除煩、涼血消痛等[15]。丹參種子為三棱狀長(zhǎng)卵形的小堅(jiān)果，長(zhǎng)度1.8～2.5 mm，寬1.1～1.6 mm[16]，不適合采用TTC法和紅墨水(或酸性靛藍(lán))染色法來(lái)快速測(cè)定種子活力，因剝離暴露種胚及胚乳以觀察種胚或胚乳著色情況極為困難，加之丹參種子的果皮表面存在大量粘性物質(zhì)，包裹種子[17]，吸水膨脹使剝離種胚和胚乳更為困難。目前還未見(jiàn)丹參種子活力快速測(cè)定的方法報(bào)道。本研究采用BTB來(lái)建立丹參種子活力快速測(cè)定方法，并通過(guò)類原位萌發(fā)和常規(guī)萌發(fā)試驗(yàn)測(cè)定其發(fā)芽率，研究丹參種子BTB活力與萌發(fā)率之間的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材 料

本研究采用重慶市武隆區(qū)仙女山從四川省阿壩藏族羌族自治州紅原縣引進(jìn)的白花丹參種子為材料(W-SCHY-W-1)。

1.2 方 法

1.2.1BTB法處理丹參種子的活力觀測(cè)

取外觀飽滿、均一的丹參種子用溫水浸泡10 h[17]，隨機(jī)取吸脹種子200粒，整齊均勻排布于4個(gè)培養(yǎng)皿中(編號(hào)為Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ)，每皿50粒；另取吸脹種子50粒，煮沸20 min，作為對(duì)照組，置于編號(hào)為ck的培養(yǎng)皿中。將配置的含2% BTB的1%瓊脂溶膠沿著玻棒緩緩倒入上述5個(gè)培養(yǎng)皿中，使之呈均勻的薄層覆蓋種粒。將培養(yǎng)皿置于恒溫(25～30 ℃)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔1 h觀察種粒周圍藍(lán)色基質(zhì)的顏色變化；參照ck種粒周邊的顏色，確定活力表現(xiàn)穩(wěn)定的最適時(shí)間。統(tǒng)計(jì)4個(gè)重復(fù)培養(yǎng)皿中種粒周圍的黃色葷圈出現(xiàn)情況，以出現(xiàn)黃色葷圈的總粒數(shù)的百分率快速確定種子活力百分?jǐn)?shù)。

1.2.2類原位萌發(fā)試驗(yàn)

將上述經(jīng)BTB試驗(yàn)3 h后的ck，Ⅰ～Ⅳ培養(yǎng)皿中的種粒分別取出，類原位(對(duì)位)轉(zhuǎn)移至育苗盤ck，Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ的相應(yīng)位置，加入適量的蒸餾水。將育苗盤置于恒溫培養(yǎng)箱中，在光照16 h/黑暗8 h，光照強(qiáng)度8 000 lx，恒溫25 ℃下培養(yǎng)，在處理14 d后統(tǒng)計(jì)種子的萌發(fā)率。

1.2.3常規(guī)萌發(fā)試驗(yàn)

同上述方法進(jìn)行浸種，隨機(jī)取吸脹的種子250粒，其中200粒平均放在含有雙層濾紙的4個(gè)培養(yǎng)皿中(編號(hào)Ⅰ～Ⅳ)，剩余的50粒種子煮沸20 min作為對(duì)照組(ck)，在培養(yǎng)皿中加蒸餾水，保持濕潤(rùn)，萌發(fā)條件和發(fā)芽率統(tǒng)計(jì)方法同上。

1.3 發(fā)芽率的估算及相關(guān)性分析、回歸分析

丹參種子發(fā)芽率的測(cè)定參照國(guó)家《農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程與國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)》中的相關(guān)規(guī)定[6]：

發(fā)芽率(%)=(發(fā)芽的總粒數(shù)/50)×100%。

利用Excel軟件進(jìn)行快速測(cè)定活力與發(fā)芽率的相關(guān)性分析和回歸分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 BTB-瓊脂凝膠法處理丹參種子其活力的表現(xiàn)

以煮沸20 min的丹參種子為對(duì)照，在含有新制的2% BTB的瓊脂凝膠基質(zhì)(1%)的培養(yǎng)皿中播種對(duì)照和測(cè)試丹參種子，觀察種子周圍凝膠基質(zhì)的顏色變化情況。在BTB試驗(yàn)的1～3 h內(nèi)，ck丹參種子外圍基質(zhì)一直都呈淡藍(lán)色層暈圈，而試驗(yàn)組的4次重復(fù)(Ⅰ～Ⅳ)試驗(yàn)中，部分種子外圍基質(zhì)呈淡黃色暈圈，且隨處理時(shí)間延長(zhǎng)，有的黃色葷圈逐漸加深，部分種子仍呈淡藍(lán)色，且在處理3 h后比較穩(wěn)定(圖1 A)。BTB處理3 h種粒周圍基質(zhì)的局部放大觀察表明，ck煮死種子周圍出現(xiàn)淡藍(lán)色，而測(cè)試組的種子周圍呈現(xiàn)不同程度的黃色，說(shuō)明其活力存在差異(圖1 B)。因此，確定BTB法對(duì)丹參種子活力估算最適時(shí)間為3 h，此時(shí)通過(guò)統(tǒng)計(jì)出現(xiàn)黃色葷圈的種子粒數(shù)，可快速測(cè)定丹參種子的活力。

注：A為接種在含BTB-瓊脂凝膠基質(zhì)的培養(yǎng)皿中丹參種子周圍顏色變化；B為局部放大情況；ck為對(duì)照(煮沸20 min殺死種子);Ⅰ～Ⅳ為4次重復(fù)試驗(yàn)。

2.2 BTB法估算丹參種子活力

BTB試驗(yàn)不同時(shí)間(1～3 h)，估算具有活力的丹參種子活力百分率(表1)。隨時(shí)間的延長(zhǎng)，顯示具有活力的種子數(shù)逐漸增高，直到3 h時(shí)達(dá)到最高。

表1 BTB法估算四川紅原丹參種子活力

2.3 類原位和常規(guī)萌發(fā)發(fā)芽率

BTB處理3 h后進(jìn)行的類原位萌發(fā)試驗(yàn)結(jié)果表明，測(cè)試組中平均發(fā)芽率為53%，同時(shí)觀察到黃色葷圈顏色越深的種子，在類原位萌發(fā)中表現(xiàn)出萌發(fā)越快的特征；常規(guī)萌發(fā)試驗(yàn)測(cè)定組平均發(fā)芽率為70%，而ck均無(wú)萌發(fā)(表2)。常規(guī)萌發(fā)的萌發(fā)率均顯著高于類原位萌發(fā)的萌發(fā)率；測(cè)試組中的4個(gè)重復(fù)，其類原位萌發(fā)率和常規(guī)萌發(fā)率均存在較大差異。

表2 四川紅原丹參種子類原位和常規(guī)萌發(fā)的發(fā)芽率

類原位萌發(fā)和常規(guī)萌發(fā)過(guò)程觀察表明，常規(guī)萌發(fā)的萌發(fā)率均高于類原位萌發(fā)；與常規(guī)萌發(fā)比較，類原位萌發(fā)的小苗較纖細(xì)，根較細(xì)長(zhǎng)，莖較短，子葉不夠粗壯，可能經(jīng)BTB法測(cè)定活力后的種子，其萌發(fā)受到BTB的一定程度的影響，這有待進(jìn)一步研究確認(rèn)。

2.4 丹參種子BTB法快速測(cè)定活力與其類原位和常規(guī)萌發(fā)的相關(guān)性分析

根據(jù)本研究建立起的BTB法快速測(cè)定丹參種子活力，結(jié)合類原位和常規(guī)萌發(fā)的萌發(fā)率結(jié)果的相關(guān)性分析可知，類原位萌發(fā)發(fā)芽率(y)與BTB法估算的種子活力(x)的直線回歸方程為y=0.983 5x+1.859 5，R2=0.996(圖3 A)；常規(guī)萌發(fā)發(fā)芽率(y)與BTB法估算的種子活力(x)之間的回歸方程為y=0.347 1x+51.95，R2=0.972(圖3 B)。表明丹參種子萌發(fā)率與BTB法測(cè)定活力估算值之間存在顯著正相關(guān)。

圖3 BTB法估算種子活力與類原位和常規(guī)萌發(fā)發(fā)芽率的線性回歸方程散點(diǎn)圖

3 結(jié)論與討論

李暉[18]采用TTC法快速測(cè)定高原植物種子活力，用時(shí)較短、簡(jiǎn)單快捷, 結(jié)果可靠。張薇等[5]設(shè)置3個(gè)濃度的紅墨水溶液和3個(gè)濃度的TTC溶液，對(duì)10個(gè)粳稻品種試驗(yàn)材料分別浸種4.5、12、24 h以快速測(cè)定種子的生活力，結(jié)果表明，TTC染色法比紅墨水染色法測(cè)定結(jié)果更準(zhǔn)確。彭子模等[13]比較了4種不同種子活力測(cè)定方法，表明TTC法效果較好，方法簡(jiǎn)便，適用性廣，對(duì)淀粉含量較多的種子測(cè)定效果較好，而對(duì)于較小的種子，BTB法則更為方便。

本研究前期發(fā)現(xiàn)，丹參種子在含0.1%BTB的凝膠中顯現(xiàn)的淡黃色暈圈顏色較淺，主要是因?yàn)榈⒎N子的呼吸強(qiáng)度比較弱，可能還與其種子外有層膠質(zhì)影響二氧化碳的擴(kuò)散有關(guān)。后來(lái)通過(guò)BTB的濃度增加至2%，效果較好。 丹參種子在自然條件下的發(fā)芽率較低，只有30%～40%，且出苗不整齊[19]。但孫群等[15]通過(guò)研究陜西優(yōu)良農(nóng)家品種的丹參種子后發(fā)現(xiàn)，當(dāng)年的新種子發(fā)芽率達(dá)75%以上。

本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)年產(chǎn)的四川紅原白花丹參種子其類原位萌發(fā)試驗(yàn)的平均發(fā)芽率為53%，而B(niǎo)TB法估算具有活力種子的平均百分率為52%，估算結(jié)果與實(shí)際試驗(yàn)結(jié)果大致相同。這表明，BTB法可以快速測(cè)定丹參種子的活力。常規(guī)萌發(fā)試驗(yàn)的種子發(fā)芽率(平均達(dá)70%)總體高于類原位萌發(fā)試驗(yàn)的種子發(fā)芽率，可能是因?yàn)轭愒幻劝l(fā)挑取的種子帶有殘余的BTB瓊脂凝膠或因種子部分損傷所致。本研究采用較高濃度的BTB(2%)可能對(duì)類原位種子萌發(fā)有某種不利的影響，這有待于進(jìn)一步研究確認(rèn)。類原位萌發(fā)發(fā)芽率與BTB法估算種子活力的直線回歸方程為y=0.983 5x+1.859 5，R2=0.996；常規(guī)萌發(fā)發(fā)芽率與BTB法估算的種子活力之間的回歸方程為y=0.347 1x+51.95，R2=0.972。表明，丹參種子類原位和常規(guī)萌發(fā)率與本研究建立的BTB法測(cè)定活力估算值之間存在顯著正相關(guān)。BTB法估算種子活力與類原位萌發(fā)結(jié)果更接近，而與常規(guī)萌發(fā)發(fā)芽率結(jié)果有些許偏差，也可能是因?yàn)轭愒幻劝l(fā)采用的就是快速活力測(cè)定的種子，而常規(guī)萌發(fā)采用的則是另取的同批次丹參種子。