瀕危植物曲莖石斛種子無菌萌發(fā)研究

劉 靖， 胡澤方， 程志杰， 王仕沁， 王玉兵

(三峽大學(xué)生物技術(shù)研究中心， 湖北 宜昌 443002)

曲莖石斛(Dendrobiumflexicaule)為蘭科石斛屬(Dendrobium)多年生草本植物，零星分布于河南、湖北、湖南、四川和重慶等地，多生于海拔1 200～2 000 m的懸崖石壁上[1]，曲莖石斛因具有極高的藥用價值而作為西楓斗的原植物之一。曲莖石斛生境特殊，分布范圍狹窄，加之藥農(nóng)的無節(jié)制采挖，其野生資源日趨枯竭，為國家一級保護(hù)植物[2]，被IUCN(世界自然保護(hù)聯(lián)盟)定為瀕危種[3]。目前曲莖石斛的研究主要集中于組織結(jié)構(gòu)[4]、實名認(rèn)證[5-7]、組織培養(yǎng)[8-10]和室外移栽[11]等方面，而其種子萌發(fā)的研究還屬空白。曲莖石斛與其他蘭科植物一樣，種子不具胚乳，在自然條件下萌發(fā)困難，因此開展曲莖石斛的種子萌發(fā)研究對其保護(hù)與利用具有重要的意義。本研究以曲莖石斛種子為研究材料，研究其萌發(fā)過程和最佳無菌萌發(fā)條件，其結(jié)果可為曲莖石斛的保育和快速繁殖提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

曲莖石斛蒴果于2018年11月采自湖北省神農(nóng)架國家公園，為自然授粉的果實，果實飽滿且無病蟲害。

1.2 方 法

1.2.1種子活力檢測

四唑測定法(Triphenyl Tetrazolium Chloride，TTC)測定種子活力，稱取約2 mg曲莖石斛的種子于5%次氯酸鈣中浸泡2 h，無菌水洗3次，蒸餾水浸泡24 h，去掉蒸餾水，置1%TTC溶液黑暗浸泡48 h，無菌水清洗3次，最后1次留1 mL水制成懸浮液。吸0.1 mL種子懸浮液于載玻片上，在顯微鏡下隨機(jī)觀察3個視野，記錄每個視野的種子總數(shù)及胚染成紅色的種子數(shù)，以胚染成紅色計為有活力的種子，重復(fù)10次，計算種子活力[12]。

1.2.2外植體消毒

將曲莖石斛蒴果先用流水洗凈，然后在超凈工作臺中用75%酒精浸泡120 s，并用0.1%的HgCl2滅菌16 min，最后用無菌水沖洗5次。

1.2.3不同培養(yǎng)基對曲莖石斛種子萌發(fā)的影響

將滅菌后蒴果用手術(shù)刀縱向切成兩半，將種子接種在1/2 N6(N6、1/2 MS、MS)+100 g·L-1馬鈴薯泥(香蕉泥)+ 0.5 g·L-1活性炭+30 g·L-1蔗糖培養(yǎng)基上，每個處理接種10個皿，重復(fù)3次。培養(yǎng)21 d后用體式顯微鏡(Leica MA 125)統(tǒng)計萌發(fā)率，以種子出現(xiàn)原球莖計為萌發(fā)[13-15]，在體式顯微鏡下取不同視野統(tǒng)計50～100粒種子中的萌發(fā)率[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子活力檢測

曲莖石斛種子經(jīng)TTC染色后，發(fā)現(xiàn)其種子活力較高，但染色程度不一，其中絕大部分種子染色較深，表明種子活力較強(qiáng)(圖1-a)；極個別種子未被染色(圖1-b)；少數(shù)種子染色較淺，表明活力較弱(圖1-c)。以種子成功染色計為具有活力，統(tǒng)計結(jié)果表明，曲莖石斛種子活力為93.52%。

注：a為染色較深的種子活力強(qiáng)；b為未染色種子無活力；c為染色較淺的種子活力弱。

2.2 種子萌發(fā)過程

成熟的曲莖石斛種子呈紡錘狀，兩端稍尖，中間較粗，有一個極細(xì)小的種胚，外部被一層透明狀的種皮包被(圖2-a)。其種子萌發(fā)大致會經(jīng)過4個階段，吸脹階段為從播種至播種7 d時，種子開始慢慢吸水，種子在一定程度上由黃綠色轉(zhuǎn)變?yōu)榈G色(圖2-b)。原球莖形成階段是播種的14～35 d：播種14 d后，種子持續(xù)增大，種胚擠壓種皮，致其破裂，露出部分種胚即為萌發(fā)(圖2-c)；播種21 d后，種胚膨大由橢圓形變?yōu)閳A形，突破種皮的種胚逐漸變綠，原球莖逐漸形成(圖2-d)；28 d后，種皮漸漸消失，表現(xiàn)出一定的極性，即原球莖有明顯的根底部(圖2-e)；播種35 d后，原球莖的頂端細(xì)胞分裂出現(xiàn)凸起，且基部出現(xiàn)纖毛狀假根(圖2-f)。葉形成階段是播種后的42～56 d：播種49 d后，成熟的原球莖兩極性明顯，原球莖頂端隆起部位不斷伸長分化成幼葉(圖2-g)。生根階段是播種后的56～84 d：播種56 d后，基部開始長出幼根(圖2-h)，隨后基部根逐漸伸長，至84 d時，幼苗平均生長2條根，葉片延長展開形成幼苗，此時苗高1 cm左右，根長1～2 cm(圖2-i)。

注：a為有胚的未發(fā)芽的種子；b為種胚吸水增大；c為種胚增大引起種皮破裂(萌發(fā))；d為原球莖的形成；e為長有“纖毛”的原球莖；f為幼葉形成；g為葉片的形成；h為幼苗初步形成；i為幼苗；CI為纖毛；SA為莖尖；FL為第1片幼葉；YR為幼根。

2.3 不同培養(yǎng)基對種子萌發(fā)的影響

曲莖石斛種子在不同培養(yǎng)基中均能萌發(fā)，并表現(xiàn)出較高的萌發(fā)率(表1)。從萌發(fā)率來看，基本培養(yǎng)基為1/2 N6，外源添加物為馬鈴薯泥或香蕉泥時種子萌發(fā)率最高，分別為98.8%和97.7%，并且萌發(fā)速度最快，可在14 d內(nèi)開始萌發(fā)；而未添加外源添加物的1/2 MS培養(yǎng)基中萌發(fā)率較低，但仍然在80%以上，表明外源添加物對曲莖石斛的萌發(fā)有明顯的促進(jìn)作用，并具有顯著性差異；馬鈴薯泥和香蕉泥對曲莖石斛種子萌發(fā)影響的差異不顯著。結(jié)果還表明，外源添加物對根的分化具有顯著影響，馬鈴薯泥可促進(jìn)根的形成，而香蕉泥對促進(jìn)根形成的影響并不明顯，當(dāng)香蕉泥為外源添加物時，其成苗過程中幾乎沒有根的形成。

表1 不同培養(yǎng)基中曲莖石斛種子萌發(fā)情況

3 討論與結(jié)論

種子活力指標(biāo)作為反映種子萌發(fā)速度、幼苗發(fā)育潛力的重要因素[16-17]，是播種育苗前的必要檢測指標(biāo)，而TTC法作為測定種子活力最主要的方法，具有操作簡單、耗時短，且不受種子休眠限制的優(yōu)點，被列入ISTA和我國的種子檢驗規(guī)程[15,18]。本研究利用TTC法測定曲莖石斛種子活力為93.52%，而無菌萌發(fā)結(jié)果表明，其種子萌發(fā)率最高可達(dá)98.8%，表明TTC法對于曲莖石斛種子活力的檢測具有一定的局限性，后期可在TTC濃度、次氯酸鹽濃度及處理時間等方面進(jìn)行條件優(yōu)化，以探索最佳TTC法檢測曲莖石斛種子活力的方法。石斛屬植物的無菌培養(yǎng)多用人工授粉的種子，并有較高的萌發(fā)率[18-19]，但林愛英[20]將細(xì)莖石斛(D.moniliforme)的自然授粉、人工異花、人工異源3種授粉方式的種子活力進(jìn)行了對比，發(fā)現(xiàn)自然授粉種子活性最強(qiáng)，其結(jié)果與本實驗結(jié)果相似，自然授粉的種子也有較高的種子活力。

蘭科植物種子無菌萌發(fā)可能與胚的體積有一定關(guān)系，不同蘭科植物形態(tài)變化也不盡相同，如黃花白芨(Bletillaochracea)種子吸水脹大，種胚從種皮一側(cè)突破形成偏長的原球莖，葉原基是在未完全突破種皮時形成的；獨蒜蘭(Pleionebulbocodioides)種子萌發(fā)則有兩種方式，一種是種胚變綠突破種皮形成橢圓形原球莖，另外一種則為種胚吸水逐漸成為淡黃色的胚體，胚體脹大從種皮一端突破而萌發(fā)，剛突破種皮時形成葉原基[21]；流蘇石斛[21](D.fimbriatum)、無距蝦脊蘭(Calanthetsoongiana)種子[22]則種胚吸水膨脹，從橢圓形逐步變?yōu)閳A球狀，然后從種皮的中央或一端突破形成球形原球莖，種皮褪去形成葉原基；春劍(Cymbidiumtortisepalumvar.longibracteatum)種子在無菌萌發(fā)時，種子吸水脹大形成原球莖，繼而膨大形成根狀莖，再逐步成苗[23]；而Dendrobiumaqueum的種子在萌發(fā)時，其種胚吸水脹大形成原球莖，頂端逐漸長出幼葉，隨后原球莖繼續(xù)膨大，形成完整植株[14,24]。同樣，曲莖石斛種子萌發(fā)也是經(jīng)歷從吸脹突破種皮，逐步變成原球莖，然后形成葉芽、生根成為完整植株，與Dendrobiumaqueum的種子在萌發(fā)成苗過程基本一致。

蘭科植物因種子細(xì)小，果實成熟時種胚未成熟，被透明狀種皮包裹的種胚，無胚乳，故在自然條件下萌發(fā)率極低，但可通過利用培養(yǎng)基進(jìn)行非共生培養(yǎng)以促進(jìn)種子快速萌發(fā)[25]?，F(xiàn)有研究表明，不同蘭科植物的非共生萌發(fā)所需基本培養(yǎng)基不盡相同，常用的基本培養(yǎng)基為MS、N6、B5等[26-27]。如鐵皮石斛(D.officinale)、鼓槌石斛(D.chrysotoxum)、齒瓣石斛(D.devonianum)等種子在N6基本培養(yǎng)中表現(xiàn)較高的萌發(fā)率[26]；而花葉開唇蘭(Anoectochilusroxburghii)種子在1/4 MS培養(yǎng)基上萌發(fā)最快，萌發(fā)率也最高，且萌發(fā)得到的原球莖最健壯[28]。高立獻(xiàn)等[29]對曲莖石斛的無菌播種進(jìn)行了初步研究，其結(jié)果以MS為最佳培養(yǎng)基，而本實驗通過多次摸索發(fā)現(xiàn)1/2 N6為曲莖石斛種子萌發(fā)的最佳基本培養(yǎng)基，與N6、1/2 MS及MS作為萌發(fā)基質(zhì)曲莖石斛萌發(fā)率之間存在顯著性差異，萌發(fā)率可達(dá)98.8%。

外源添加物也是影響石斛種子無菌萌發(fā)一個重要因素，許多研究表明，香蕉或馬鈴薯汁均對金釵石斛(D.nobile)和鐵皮石斛種子無菌萌發(fā)具有促進(jìn)作用，且馬鈴薯因含有重要的維生素(B1和B6)和礦物質(zhì)元素(如鉀、鐵、鎂，以及碳水化合物和氨基酸)對種子萌發(fā)促進(jìn)效果更佳[30-31]，本研究也得到相似的結(jié)果。Miransari和Smith[34]認(rèn)為，種子在發(fā)芽過程中消耗大量的氮，故添加有馬鈴薯的培養(yǎng)基中發(fā)芽率會更高。本實驗在基本培養(yǎng)基1/2 MS和1/2 N6中添加馬鈴薯泥之后，種子萌發(fā)時間不僅縮短，且萌發(fā)形成的原球莖既大又壯，有利于幼苗的形成以及根的生成，表明馬鈴薯泥不僅可促進(jìn)曲莖石斛種子萌發(fā)，而且對分化也有促進(jìn)作用。但白芨種子萌發(fā)過程誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加馬鈴薯泥之后，萌發(fā)率反而降低[26]。說明蘭科植物萌發(fā)需要的條件不盡相同，即蘭科不同種有不同的生物學(xué)特性。也有研究表明外源激素對蘭科植物種子的無菌萌發(fā)有促進(jìn)作用[31,35-36]，但本研究表明，在不添加外源激素的情況下，曲莖石斛種子萌發(fā)率依然很高，并且不添加外源激素，不僅可簡化操作步驟，還可節(jié)約成本。

該實驗摸索了曲莖石斛種子萌發(fā)過程及萌發(fā)最佳培養(yǎng)基質(zhì)，曲莖石斛種子在最佳萌發(fā)培養(yǎng)基中，萌發(fā)率不僅高，而且原球莖又大又壯，可為后期曲莖石斛擴(kuò)繁提供一定的實驗基礎(chǔ)。