纖花香茶菜苗期抗旱性鑒定及抗旱生理特性初步研究

趙雙雙， 劉 洋，2， 劉軍民，2， 葉 姿， 邱佳佳， 王德勤， 詹若挺，2

(1.廣州中醫(yī)藥大學中藥學院， 廣東 廣州 510006；2.嶺南中藥資源教育部重點實驗室(廣州中醫(yī)藥大學)， 廣東 廣州 510006；3.廣州白云山和記黃埔中藥有限公司, 廣東 廣州 510515)

唇形科(Labiatae)香茶菜屬(Isodon)植物纖花香茶菜(Isodonlophanthoides(Buch.-Ham. Ex D.Don)var.Graciliflora(Benth.)H. Hara)是中藥溪黃草的主要來源之一，具有清熱利濕、涼血散瘀的功效，臨床上常用來治療急性黃疸型肝炎、急性膽囊炎、腸炎等[1-2]，也是消炎利膽片、膽石通膠囊等多種中成藥的主要原料。纖花香茶菜主產于嶺南地區(qū)，生于水濕條件豐富的溪邊、水溝旁、河岸、田邊及林下潮濕處。由于野生資源滿足不了藥用需求，當前在嶺南地區(qū)廣泛栽培。

干旱是制約植物生長的重要因素，植物受到干旱脅迫后不僅形態(tài)會發(fā)生改變，體內生物量的積累以及次生代謝物的形成也會受到影響。苗期是植物生長過程中的關鍵時期，苗期生長的好壞直接影響植株后期的生長和繁殖，受到干旱脅迫的幼苗體內會產生一系列生理生化物質的變化，這些變化可能導致植物產量變低、質量變差甚至死亡。纖花香茶菜生長過程中對水分的要求較高，苗期對水分的耐受力直接影響到其生長發(fā)育全程，如遇干旱植株會萎蔫，嚴重影響后期的生長及生物量的積累。生產上為了滿足其對水分的需求，不僅種植地的選擇受到限制，種植地灌溉、遮陰等設施成本也隨之增加。因此亟需對不同居群的纖花香茶菜種質進行抗旱性鑒定，篩選優(yōu)良抗旱種質用于藥材生產。

研究表明，植物的抗旱能力一般是由遺傳因素和環(huán)境因素決定，抗旱性鑒定則是篩選和評價植物抗旱能力的過程，對現(xiàn)有種質資源進行芽期和苗期抗旱性鑒定并定向選擇是可行有效的[3]。纖花香茶菜種質資源具有較高的遺傳多樣性，且居群間分化大于居群內分化[4]，芽期抗旱性鑒定結果顯示，不同類型種質芽期表現(xiàn)出不同的抗旱能力[5]，為了篩選出兩生育期均具有良好抗旱特性的種質，本文進一步開展了纖花香茶菜種質資源的苗期抗旱性鑒定研究，并分析比較3份不同抗旱性種質在干旱脅迫下的生理生化特征變化，探究其生理特性的變化規(guī)律。本研究結果可為纖花香茶菜優(yōu)良抗旱品種的選育研究及抗旱機制的探索提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與材料

1.1.1儀 器

便攜式土壤墑情分析儀(DK-W型，深圳市德卡科技股份有限公司)；便攜式葉綠素儀(SPAD-502型，日本美能達公司)；數(shù)顯卡尺(MNT-150型，上海美耐特實業(yè)有限公司)；電子天平(JY-3002型，廣州玉治儀器有限公司)；葉面積測定儀(YMJ-C型，浙江托普儀器有限公司)；超低溫冰箱(DW-HL 528型，日本SANYO公司)；雙光束紫外可見分光光度計(A 560型，上海翱藝儀器有限公司)；電熱恒溫水浴鍋(HWS 24型，上海一恒科技有限公司)；BP-110 S型分析天平(德國Sartorius公司)。

1.1.2試 劑

磺基水楊酸、PEG-6000、冰乙酸、茚三酮、甲苯、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、二硫蘇糖醇、聚乙烯吡咯烷酮、考馬斯亮藍G-250、蒽酮、濃硫酸、甲硫氨酸、氮藍四唑、乙二胺四乙酸二鈉、核黃素、Tris、過氧化氫、愈創(chuàng)木酚、三氯乙酸、硫代巴比妥酸等均為國產分析純。脯氨酸(標準物質，國家食品藥品檢定研究院)、無水葡萄糖(分析純，天津市大茂化學試劑廠)、牛血清白蛋白(標準物質，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)。

1.1.3試驗材料

試驗材料為廣東、福建等地收集的不同居群纖花香茶菜種質17份，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學劉軍民教授鑒定為纖花香茶菜(Isodonlophanthoides(Buch.-Ham. Ex D.Don)var.Graciliflora(Benth.)H. Hara)，收集后均種植于廣州中醫(yī)藥大學時珍山種質資源圃。種子成熟后采收，待其自然干燥后密封保存于4 ℃冰箱中。詳細信息見表1。

表1 供試材料種質來源及類型

1.2 試驗方法

1.2.1苗期抗旱性鑒定

采用盆栽反復干旱法，在嶺南中藥材種子種苗繁育基地(云浮)溫室大棚中進行。供試土壤為泥炭土、黃土、沙子(比例為4∶4∶1)，種子與沙子按照1∶20比例混勻撒播在育苗床上，當幼苗長出一對真葉和一對心葉時移栽到育苗杯中(8 cm×8 cm)，待長出三對真葉后，移栽到裝有3 kg混合土的花盆(25 cm×16 cm×19 cm)中，每盆定植5棵。本試驗為完全隨機區(qū)組設計，每份材料設置正常供水和反復干旱處理，每個處理重復3次。

當干旱處理組的所有材料達到90%冠層萎蔫時進行第1次復水(間隔8 d)，每盆材料澆水500 mL；第1次復水后干旱處理組不再供水，直到干旱處理組所有材料再次達到90%冠層萎蔫時(間隔6 d)，對干旱處理組進行第2次復水，每盆澆水500 mL。

1.2.2抗旱生理特性研究

選擇具有抗旱性差異的3份種質R 4、R 6、R 16為供試材料，采用霍格蘭溶液水培法[6]。待植株生長至20 cm左右時，洗凈根部泥土，放入敞口玻璃瓶中，每瓶5株，處理瓶中加入含10% PEG-6000的霍格蘭營養(yǎng)液，對照瓶中加入等量霍格蘭營養(yǎng)液，每種處理3次重復。不同處理時間模擬不同程度的干旱脅迫，分別于0 h、24 h、48 h取上部成熟功能葉，液氮速凍后保存于-80 ℃超低溫冰箱中。

1.3 測定項目與方法

1.3.190%冠層萎蔫

當所有居群植株達到三葉期后進行控水處理，觀察各個居群植株葉片的萎蔫程度，記錄不同材料達到90%幼苗出現(xiàn)萎蔫的時間，為90%冠層萎蔫。

1.3.2葉片含水量

在第1次復水前一天上午，剪取3個不同花盆的第3對葉稱量鮮重，之后將葉片在105 ℃殺青20 min，80 ℃烘干至恒重，稱量干重。

葉片含水量=(鮮重-干重)/鮮重。

1.3.3株高莖粗

在第2次復水后72 h，隨機選取3棵植株，測量株高和莖粗。株高為莖頂端生長點到根莖之間距離，莖粗為主莖中部最長節(jié)中部的直徑。

1.3.4葉片形態(tài)

使用便攜式葉面積儀測量葉面積、葉長、葉寬。

1.3.5SPAD值

即葉綠素的相對含量。采用SPAD-502便攜式葉綠素儀進行測定，在第2次復水24 h后，對第3對成熟葉片進行測定。

1.3.6生物量

第2次復水72 h后，每個居群植株帶根整個挖出，將泥土洗凈并吸干表面水分，稱取幼苗重量，即地上部分鮮重，稱取根系鮮物質重量即為根鮮重。

1.3.7生理生化指標測定

葉片中脯氨酸(Pro)含量、可溶性蛋白含量及可溶性糖含量，分別采用酸性茚三酮法、考馬斯亮藍G-250染色法及蒽酮-濃硫酸法進行測定[7]。葉片中超氧化物歧化酶(SOD)及過氧化物酶(POD)活性測定、丙二醛(MDA)含量測定，分別采用氮藍四唑光化還原法、愈創(chuàng)木酚法及硫代巴比妥酸比色法進行測定[7]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel 2010軟件對數(shù)據(jù)進行整理以及抗旱系數(shù)計算，采用SPSS 22.0軟件對苗期各指標的抗旱系數(shù)進行相關性分析和主成分分析，對平均抗旱隸屬函數(shù)值進行聚類分析，采用Spearman相關(雙尾)分析進行相關性分析，聚類分析采用系統(tǒng)聚類法(組間連接，平方歐氏距離)，對各生理生化指標進行差異性分析。

其中，DC為抗旱系數(shù)，CDC為綜合抗旱系數(shù)，Xi為某種質i指標處理組的實測值，cki為某種質i指標的對照組實測值，Ui為i指標的隸屬值，U為抗旱性綜合評價值。

2 結果與分析

2.1 干旱脅迫對纖花香茶菜幼苗生長的影響

對纖花香茶菜幼苗受到干旱脅迫后的各生長指標進行統(tǒng)計(表2)。干旱處理組各項指標的變異系數(shù)范圍在4.20%～29.63%之間，其中以90%冠層萎蔫和SPAD值表現(xiàn)的差異最大，變異系數(shù)分別為29.63%和22.73%。對照組各項指標的變異系數(shù)范圍在1.57%～24.55%之間，表明供試的纖花香茶菜各指標之間存在明顯差異，其中株高和根鮮重的變異系數(shù)最大，分別為21.61%和24.55%，表明各種質之間的株高和根鮮重存在較大差異。對照組與處理組各指標相比較分析可知，經(jīng)干旱脅迫的纖花香茶菜所有性狀指標均受到抑制。

表2 干旱脅迫下17份供試材料苗期各指標變化統(tǒng)計

2.2 抗旱系數(shù)與隸屬函數(shù)值的相關性分析

對干旱脅迫下纖花香茶菜苗期各指標的抗旱系數(shù)進行相關性分析(表3)。其中各抗旱系數(shù)呈顯著或極顯著相關關系的均為正相關。平均隸屬函數(shù)值與葉片含水量、葉面積、葉長、葉寬、根鮮重均呈極顯著相關，其中與葉長和葉面積的相關性較大，相關系數(shù)分別為0.833和0.830；與90%冠層萎蔫、地上部分鮮重呈顯著相關；與株高、莖粗、SPAD值相關性不顯著。多數(shù)指標的抗旱系數(shù)未達到顯著相關，其中株高、莖粗和SPAD值與其他指標均無明顯相關性。

表3 干旱脅迫下17份纖花香茶菜種質資源10個性狀抗旱性系數(shù)間的相關系數(shù)

2.3 抗旱系數(shù)主成分分析

對纖花香茶菜苗期各指標的抗旱系數(shù)進行主成分分析，前3個主成分貢獻率分別為36.64%、20.699%、17.1%，累計貢獻率為74.438%，且各成分特征值均大于1(表4)。提取前3個主成分，可以代表11個指標大部分信息。主成分1(F 1)特征值為3.664，對應載荷量相對較大的是葉面積、葉寬、葉片含水量，都與光合作用相關，稱為光合因子，受到干旱脅迫的植株，其光合作用亦會受到抑制。主成分2(F 2)特征值為2.07，對應載荷量相對較大的是地上部分鮮重、根鮮重，與生物產量相關，概括為產量因子，干旱脅迫會使植物地上部分鮮重降低。主成分3(F 3)特征值為1.71，對應載荷量相對較大的是莖粗、SPAD值，與植物的生長密切相關，歸為生長因子，干旱脅迫會影響莖粗及SPAD值的增大。

表4 干旱脅迫下纖花香茶菜種質資源苗期抗旱系數(shù)的主成分分析

2.4 綜合抗旱性評價與抗旱性聚類分析

計算供試材料各指標的抗旱系數(shù)的隸屬函數(shù)及平均隸屬函數(shù)并排序(表5)，對各生長指標的平均隸屬函數(shù)值進行聚類分析(圖1)，當平方歐氏距離為5時，17份纖花香茶菜種質被分為強抗旱型、中抗旱型、弱抗旱型和抗旱性敏感型四種類型。強抗旱型包括R 3、R 11、R 13，平均隸屬函數(shù)值在0.616～0.674之間；中抗旱型包括R 9、R 16、R 10、R 6、R 15，平均隸屬函數(shù)值在0.487～0.546之間；弱抗旱型包括R 4、R 5、R 7、R 8、R 17，平均隸屬函數(shù)值在0.334～0.434之間；抗旱性敏感型包括R 1、R 14、R 12、R 2，平均隸屬函數(shù)值在0.220～0.260之間。

圖1 纖花香茶菜種質資源苗期平均隸屬函數(shù)值的聚類分析

表5 反復干旱處理后纖花香茶菜種質資源苗期各指標抗旱系數(shù)的隸屬函數(shù)與排序

根據(jù)各指標的平均隸屬函數(shù)值以及種植過程中各性狀實際情況，可篩選出5份抗旱性優(yōu)良種質，分別為R 3、R 6、R 9、R 10和R 16。其中R 3平均隸屬函數(shù)值為0.616，抗旱性最好。

2.5 纖花香茶菜抗旱生理特性研究

對3份抗旱性差異種質的生理特性研究發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫下3份材料的Pro、可溶性蛋白、可溶性糖等滲透調節(jié)物質的含量隨脅迫時間的延長而不斷增加(圖2)。當干旱脅迫時間為24 h，3份種質Pro含量均有所增加，輕度干旱脅迫下Pro的積累有利于滲透調節(jié)；R 6、R 16的可溶性蛋白小幅度增加，R 4可溶性蛋白含量顯著增加；可溶性糖含量均有不同程度增加，三者含量大小為R 16>R 6>R 4。干旱脅迫48 h時，3份種質Pro含量均快速上升，R 4的Pro含量積累最多；R 6、R 16的可溶性蛋白含量大幅增加，而R 4可溶性蛋白含量略微增加；R 4、R 16可溶性糖含量較0～24 h增加多，R 6相對增加較少。在模擬干旱脅迫處理期間3份種質的Pro含量、可溶性糖含量均有極顯著差異；R 6可溶性蛋白含量呈極顯著差異，R 16呈顯著差異，R 4差異不顯著。

圖2 干旱脅迫下纖花香茶菜不同種質葉片中3種滲透調節(jié)物質的變化

SOD和POD是植物酶系統(tǒng)的重要成員，MDA是判斷膜系統(tǒng)受傷害程度的重要指標之一。對不同干旱脅迫時間下SOD和POD活性、MDA含量測定結果(圖3)顯示，R 4、R 16的SOD活性先下降后上升，并且整個脅迫期間SOD活性的變化量均較小，而R 6的SOD活性先上升后下降，R 16的SOD活性在模擬干旱脅迫期間有顯著性差異，R 4、R 16則沒有顯著差異；脅迫時間從0 h增加到24 h時，R 4的POD活性大幅上升，增幅達6倍以上，整個脅迫期間3份材料的POD活性均有不同程度增加，R 6、R 16的POD活性在脅迫期間均有極顯著差異，R 4無顯著性差異；脅迫0 h時，3份材料的MDA含量大小為R 4>R 16>R 6，脅迫時間為24 h時，三者積累的MDA含量相近，脅迫時間延長至48 h時，三者MDA含量繼續(xù)增加，其中R 4增幅最大，R 4、R 16在脅迫期間MDA含量均有極顯著差異，R 6有顯著性差異。

圖3 干旱脅迫下纖花香茶菜不同種質葉片中SOD、POD活性及MDA含量的變化

3 討論與結論

3.1 抗旱性鑒定方法及性狀指標的選擇

關于植物抗旱性鑒定已有大量的研究報道，但植物的抗旱性因時間、地點甚至生長發(fā)育階段不同而難以精確測量。雖然鑒定方法標準不一，但李瑞雪等[8]、張智猛等[9]、謝小玉等[10]的研究仍具有重要參考價值。苗期抗旱性鑒定方法有高滲溶液法、田間直接鑒定法、旱棚或人工氣候室法及盆栽法等，其中盆栽法簡便易行、穩(wěn)定性較好，已應用在薏苡[11]、綠豆[12]、糜子[13]等植物上，被認為是植物苗期抗旱性鑒定中較好的處理方法。植物苗期的抗旱性與多種性狀有關，是由多種影響因素構成的復雜的數(shù)量性狀，所有因素綜合作用才能促進抗旱性的形成，僅應用單一性狀指標無法準確判斷，因此一般進行多指標測定，從而對抗旱性進行綜合評價[3]。目前，研究人員多從形態(tài)結構[14]、生理生化[15]以及生長產量[16]等方面對植物種質資源的抗旱性進行多指標測定研究，并運用多種分析方法，如隸屬函數(shù)法、主成分分析法、灰色系統(tǒng)理論法、聚類分析等對所得指標數(shù)據(jù)進行綜合評價。王琪等[17]通過研究水分脅迫下芍藥的表型性狀、光合指標、水分生理指標等，運用主成分分析法和隸屬函數(shù)法對4個芍藥品種的抗旱性進行了排序。曾輝等[18]對30份菜豆進行抗旱性鑒定發(fā)現(xiàn)不同材料之間存在明顯的抗旱差異性，其中發(fā)芽率、地下鮮重、地上鮮重、全株鮮重、電導率和Fv/Fm可以作為普通菜豆苗期抗旱性篩選的主要鑒定指標。因此，本研究采用盆栽反復干旱法對17份纖花香茶菜種質資源的苗期的多個形態(tài)及生長指標進行測定，運用隸屬函數(shù)法、相關性分析、主成分分析、聚類分析等方法對這些指標進行綜合分析。結果17份種質被分為4種不同抗旱類型，初步篩選出5份苗期抗旱性優(yōu)良種質，綜合分析可將葉面積作為其苗期抗旱性鑒定的主要測定指標。觀測植株生長狀態(tài)發(fā)現(xiàn)，相對矮小的種質所表現(xiàn)出的抗旱性優(yōu)于植株較為高大的種質，如矮小的植株發(fā)生90%萎蔫的時間明顯延長、積累的生物量更多，可能由于矮小的植株生長所需的水分較相對高大的植株少，因此在干旱脅迫下受到的影響較小。結合芽期與苗期抗旱性鑒定結果并考慮植株實際生長狀況，最終篩選出R 16為綜合抗旱性優(yōu)良種質。

3.2 干旱脅迫對不同抗旱性種質生理特性的影響

植物受到干旱脅迫后通過調整體內的生理生化代謝來適應環(huán)境，這個過程是一系列復雜的多方面的變化，目前研究人員多從生理滲透調節(jié)和保護酶活性方面進行研究。滲透調節(jié)是植物在水分脅迫下，通過主動積累溶質來提高細胞液濃度，降低滲透勢，在水勢下降時維持細胞膨壓來適應干旱環(huán)境[19]。植物在利用氧氣的過程中會產生具有毒害作用的活性氧(ROS)，當植物受到干旱脅迫時會破壞ROS產生與清除之間的平衡，導致膜脂、生物膜系統(tǒng)、組織等受到傷害，并產生和積累過氧化產物MDA，MDA含量可反映膜脂過氧化程度，參與植物清除ROS的酶類主要有SOD和POD等[20]。Yin等[21]發(fā)現(xiàn)，高粱幼苗通過降低Pro含量和滲透勢、增加可溶性糖含量來應對干旱脅迫。張翠梅等[22]研究發(fā)現(xiàn)，在不同程度的干旱脅迫下，不同抗旱性苜蓿品種存在形態(tài)特征相同，生理特性不同的生長及生理響應策略，其中在輕度和中度干旱脅迫下，弱抗旱性品種通過改變細胞膜系統(tǒng)穩(wěn)定性、根系活力及滲透調節(jié)能力來應對干旱；在重度干旱脅迫下，不同抗旱性品種均可通過改變根系生長特征和啟動抗氧化系統(tǒng)來適應干旱。謝小玉等[10]對10個甘藍型油菜種質苗期的抗旱性進行評估，發(fā)現(xiàn)其MDA、Pro、可溶性糖、可溶性蛋白含量和SOD、POD活性相對值都呈現(xiàn)出上升趨勢，與本研究結果類似。在本研究中，隨著干旱脅迫時間延長，纖花香茶菜葉片中的Pro、可溶性蛋白、可溶性糖含量不斷增加，脅迫48 h時，葉片表觀形態(tài)損傷嚴重，Pro含量大幅增加，尤其R 4種質增加最多，說明R 4受到脅迫損傷最嚴重，與抗旱性鑒定結果相符；可溶性蛋白含量在脅迫24 h時就有明顯差異，而可溶性糖含量的積累主要在脅迫后期。3份種質的SOD活性在脅迫期間均變化不大，而POD活性快速上升，MDA含量有不同程度的積累，其中R 4在應對干旱脅迫時的POD活性以及MDA含量在3份種質中增加最多。弱抗旱型種質(R 4)在應對干旱脅迫時的滲透調節(jié)物質含量以及抗氧化酶活性都處于較高水平，膜脂過氧化嚴重，說明弱抗旱型種質需要做出更強烈的生理應答來應對干旱脅迫，與前人的研究結果一致；而抗旱性較強的種質(R 6、R 16)主要通過增加滲透調節(jié)來適應干旱脅迫；同為抗旱種質的野生型(R 6)和栽培型(R 16)在應對干旱脅迫時的生理生化指標變化亦不同，野生型的滲透調節(jié)物質和酶活積累量較少。綜上，抗旱性不同的種質對干旱脅迫的應答機制不同，弱抗旱型種質需要做出更強烈的生理應答來應對干旱脅迫。