高濃度葡萄糖通過(guò)Bmi1促進(jìn)小兒腎母細(xì)胞瘤免疫逃逸的機(jī)制研究

梅娥,呂明珠,海本剛

(1.十堰市婦幼保健院，湖北 十堰 442000； 2.湖北醫(yī)藥學(xué)院 附屬東風(fēng)醫(yī)院，湖北 十堰 442000；3.十堰市鄖陽(yáng)區(qū)婦幼保健院，湖北 十堰 442000)

小兒腎母細(xì)胞瘤是兒童常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，全球每年的發(fā)病率為1/10萬(wàn)[1]。近年來(lái)隨著治療方法的優(yōu)化，小兒腎母細(xì)胞瘤的預(yù)后已得到明顯改善，但抑制其復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移一直是臨床研究熱點(diǎn)[2]。研究發(fā)現(xiàn)，小兒腎母細(xì)胞瘤患兒被診斷為糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)顯著增加[3]，表明小兒腎母細(xì)胞瘤與糖尿病之間存在一定的相關(guān)性。探究?jī)烧叩臐撛陉P(guān)系也是治療小兒腎母細(xì)胞瘤必須解決的重要問(wèn)題。B細(xì)胞特異性MLV整合位點(diǎn)- 1(Bmi1)是胚胎發(fā)育信號(hào)系統(tǒng)中重要的調(diào)控因子[4]。Duan等[5]發(fā)現(xiàn)，高濃度葡萄糖誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞的Bmi1表達(dá)升高，進(jìn)而降低自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)對(duì)胰腺癌細(xì)胞的免疫殺傷敏感性，說(shuō)明Bmi1在葡萄糖調(diào)控NK細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞中具有重要作用。近年研究顯示，Bmi1在小兒腎母細(xì)胞瘤中高表達(dá)，且與腫瘤的預(yù)后及轉(zhuǎn)移相關(guān)[6]。目前有關(guān)Bmi1與NK細(xì)胞對(duì)小兒腎母細(xì)胞瘤殺傷敏感性的研究尚未見(jiàn)報(bào)道，本研究通過(guò)觀察Bmi1在小兒腎母細(xì)胞瘤組織和細(xì)胞中的表達(dá)，闡明不同濃度葡萄糖作用下，Bmi1表達(dá)變化及沉默Bmi1對(duì)NK細(xì)胞殺傷小兒腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞敏感性的影響，以期為臨床探究小兒腎母細(xì)胞瘤免疫逃逸提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 組織樣本、細(xì)胞株及主要試劑

25例腫瘤組織樣本均來(lái)自十堰市婦幼保健院2018年3月至2020年2月收治的小兒腎母細(xì)胞瘤病例。所有患兒術(shù)后病理診斷皆為小兒腎母細(xì)胞瘤，術(shù)前未行化療或放療，且所有患兒監(jiān)護(hù)人已簽署知情同意書(shū)。本研究獲得十堰市婦幼保健院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。組織樣本均保存于-80 ℃。腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞G401和胚腎細(xì)胞CCC- HEK- 1均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所，McCoy’s 5A培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶和DMEM培養(yǎng)基均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自上海信裕生物科技有限公司，NK細(xì)胞培養(yǎng)基購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司，PE標(biāo)記的CD3、FITC標(biāo)記的CD56、NKG2D單抗、MHCⅠ類(lèi)多肽相關(guān)序列A(MICA)及MICB單抗均購(gòu)自美國(guó)BD公司，Trizol試劑和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT- PCR)試劑盒購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司，對(duì)照小干擾RNA(si- NC)、Bmi1小干擾RNA(si- Bmi1)、LipofectamineTM 3000及BCA 蛋白定量試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；Bmi1抗體、二抗(羊抗兔)和乳酸脫氫酶(LDH)釋放檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及小干擾RNA轉(zhuǎn)染

CCC- HEK- 1細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)；G401細(xì)胞用含10%胎牛血清的McCoy’s 5A培養(yǎng)基置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的G401細(xì)胞，顯微鏡下計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度至3.0×106個(gè)·ml-1，接種于6孔板內(nèi)。按照LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)，將50 ng的si- NC、si- Bmi1分別轉(zhuǎn)染G401細(xì)胞，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后更換培養(yǎng)基。在高濃度葡萄糖刺激實(shí)驗(yàn)中，含胎牛血清的培養(yǎng)基中分別加葡萄糖至終濃度為5、10、15 mmol·L-1。

1.3 NK細(xì)胞的分離及鑒定

依據(jù)淋巴細(xì)胞分離液實(shí)驗(yàn)步驟分離3例健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞，加入NK細(xì)胞培養(yǎng)基置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。PBS洗滌重懸NK細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×107個(gè)·ml-1，依次加入PE標(biāo)記的CD3抗體、FITC標(biāo)記的CD56抗體，室溫避光條件下孵育20 min，PBS重懸細(xì)胞后利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)NK細(xì)胞表型。

1.4 免疫組化法檢測(cè)Bmi1的表達(dá)

將獲得的小兒腎母細(xì)胞瘤組織樣本和瘤旁正常組織進(jìn)行常規(guī)石蠟切片，切片脫蠟后蒸餾水浸洗1 min，對(duì)切片進(jìn)行抗原修復(fù)，滴加3%的H2O2于組織切片，室溫孵育10 min，磷酸鹽緩沖溶液(PBS)沖洗。滴加稀釋的山羊血清，室溫孵育40 min，滴加Bmi1抗體，4 ℃孵育過(guò)夜。PBS沖洗切片，滴加二抗37 ℃孵育25 min。PBS沖洗切片，滴加DAB顯色液，自來(lái)水沖洗終止染色，加入Harris蘇木素復(fù)染1 min，水洗后用1%的鹽酸酒精分化，再用自來(lái)水水洗返藍(lán)。將切片進(jìn)行梯度酒精脫水后，再依次滴加二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ，封片劑封片后晾干、鏡檢、拍照。

1.5 qRT- PCR檢測(cè)Bmi1、MICA及MICB的mRNA表達(dá)

Trizol試劑提取組織樣本或細(xì)胞的總RNA，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒一步法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，根據(jù)熒光定量試劑盒所述實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行qRT- PCR反應(yīng)，引物序列見(jiàn)表1。反應(yīng)條件為：95 ℃變性15 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸10 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增結(jié)果采用2-ΔΔCt法計(jì)算Bmi1、MICA及MICB的mRNA相對(duì)表達(dá)量。

表1 qRT- PCR引物序列

1.6 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)Bmi1、MICA及MICB的蛋白表達(dá)

RIPA細(xì)胞裂解液裂解已轉(zhuǎn)染的G401細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，利用BSA法檢測(cè)細(xì)胞蛋白濃度。取120 μg 蛋白進(jìn)行變性，10%分離膠進(jìn)行SDS- PAGE電泳分離等量蛋白，將目標(biāo)蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜。5%脫脂牛奶4 ℃封閉1 h，TBST洗膜5 min共3次，加入Bmi1、MICA和MICB抗體(1∶1 500)，4 ℃搖床孵育過(guò)夜。TBST洗膜5 min共3次，加入HRP標(biāo)記的兔抗鼠的二抗(1∶1 000)37 ℃孵育1 h，TBST洗膜5 min共5次。顯影曝光，利用Image- Pro Plus圖像分析系統(tǒng)對(duì)蛋白條帶的灰度值進(jìn)行分析。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)NKG2D配體MICA、MICB的表達(dá)

收集G401細(xì)胞，PBS重懸洗滌細(xì)胞，以5.5×104個(gè)·ml-1的濃度接種于96孔板內(nèi)。根據(jù)每106個(gè)細(xì)胞1 μg的濃度加入MICA和MICB抗體，4 ℃孵育細(xì)胞25 min，PBS洗滌細(xì)胞，加入FITC標(biāo)記的山羊抗鼠二抗4 ℃孵育30 min，PBS洗滌3次，利用流式細(xì)胞儀分析陽(yáng)性細(xì)胞。

1.8 LDH法檢測(cè)NK細(xì)胞對(duì)G401細(xì)胞的殺傷敏感性

根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，胰酶消化葡萄糖處理或轉(zhuǎn)染的G401細(xì)胞(靶細(xì)胞)，利用含無(wú)胎牛血清的McCoy’s 5A培基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至4×105個(gè)·ml-1。收集NK細(xì)胞，PBS洗滌重懸細(xì)胞，NKG2D單抗孵育NK細(xì)胞20 min。PBS洗滌NK細(xì)胞及NKG2D單抗孵育的NK細(xì)胞(效應(yīng)細(xì)胞)，使用含無(wú)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至8×106個(gè)·ml-1。按照效靶比20∶1將細(xì)胞加入96孔板內(nèi)，為實(shí)驗(yàn)組。同時(shí)設(shè)置效應(yīng)細(xì)胞自然釋放組、靶細(xì)胞自然釋放組及靶細(xì)胞最大釋放組。每組各設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。將96孔板置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 h，離心后每孔吸取100 μl細(xì)胞上清置于96孔板，每孔加入100 μl的LDH溶液作用5 min，加入1 mol·L-1的鹽酸，利用酶標(biāo)儀在490 nm處檢測(cè)光密度值(OD值)。殺傷敏感性=(實(shí)驗(yàn)組OD值-效應(yīng)細(xì)胞自然釋放組OD值)/(靶細(xì)胞最大釋放組OD值-靶細(xì)胞自然釋放組OD值)×100%。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 20.0軟件，取3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)結(jié)果，數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)，多組間雙因素比較采用Two- way ANOVA分析，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Bmi1蛋白在小兒腎母細(xì)胞瘤組織及細(xì)胞中的表達(dá)

免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Bmi1在小兒腎母細(xì)胞瘤瘤旁正常組織中表達(dá)微弱，而在瘤組織中過(guò)度表達(dá)，見(jiàn)圖1。

圖1 小兒腎母細(xì)胞瘤組織和瘤旁正常組織Bmi1蛋白表達(dá)的免疫組化染色結(jié)果(×200) A.瘤旁正常組織； B. 小兒腎母細(xì)胞瘤組織

2.2 Bmi1蛋白在腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞G401和胚腎細(xì)胞CCC- HEK- 1中的表達(dá)

qRT- PCR及蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞G401中Bmi1蛋白和mRNA表達(dá)水平高于胚腎細(xì)胞CCC- HEK- 1(P<0.01)，見(jiàn)表2。

表2 G401細(xì)胞和CCC- HEK- 1細(xì)胞中Bmi1蛋白及mRNA的表達(dá)水平比較

2.3 不同濃度葡萄糖對(duì)G401細(xì)胞中Bmi1表達(dá)的影響

qRT- PCR及蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著葡萄糖濃度的增加，G401細(xì)胞中Bmi1 mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 不同濃度葡萄糖對(duì)G401細(xì)胞中Bmi1蛋白及mRNA表達(dá)的影響

2.4 不同濃度葡萄糖對(duì)G401細(xì)胞中MICA和MICB表達(dá)的影響

qRT- PCR及蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著葡萄糖濃度的增加，G401細(xì)胞中MICA和MICB的蛋白及mRNA表達(dá)水平逐漸降低(P<0.05)，見(jiàn)表4。流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著葡萄糖濃度的增加，G401細(xì)胞的MICA和MICB表達(dá)水平逐漸降低，見(jiàn)圖2。

圖2 不同濃度葡萄糖對(duì)G401細(xì)胞中MICA和MICB表達(dá)的影響 A、B、C、D深色曲線依次為0、5、10、15 mmol·L-1濃度的葡萄糖，淺色曲線為IgG對(duì)照

表4 不同濃度葡萄糖對(duì)G401細(xì)胞中MICA和MICB蛋白及mRNA表達(dá)的影響

2.5 沉默Bmi1對(duì)高濃度葡萄糖處理的G401細(xì)胞中MICA和MICB表達(dá)的影響

由于15 mmol·L-1葡萄糖處理G401細(xì)胞后Bmi1蛋白表達(dá)最高，MICA和MICB蛋白表達(dá)最低，因此選擇15 mmol·L-1葡萄糖處理的G401細(xì)胞作為此實(shí)驗(yàn)細(xì)胞。qRT- PCR及蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與si- NC相比，si- Bmi1促進(jìn)G401細(xì)胞中MICA和MICB的蛋白及mRNA的表達(dá)(P<0.05)，見(jiàn)表5。流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與si- NC相比，si- Bmi1促進(jìn)G401細(xì)胞中MICA和MICB的表達(dá)，見(jiàn)圖3。

圖3 沉默Bmi1對(duì)高濃度葡萄糖處理的G401細(xì)胞中MICA及MICB表達(dá)的影響 A.MICA； B. MICB

表5 沉默Bmi1對(duì)高濃度葡萄糖處理的G401細(xì)胞中MICA和MICB蛋白及mRNA表達(dá)的影響

2.6 NK細(xì)胞純度鑒定

流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CD3-CD56+的NK細(xì)胞純度達(dá)到90%以上，見(jiàn)圖4。

圖4 CD3-CD56+的NK細(xì)胞

2.7 不同濃度葡萄糖對(duì)NK細(xì)胞殺傷G401細(xì)胞敏感性的影響

LDH實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，NK細(xì)胞對(duì)無(wú)葡萄糖及含5、10、15 mmol·L-1葡萄糖的G401細(xì)胞的殺傷率依次為52.11及41.37、18.42、10.03，表明隨著葡萄糖濃度的升高，NK細(xì)胞對(duì)G401細(xì)胞的殺傷敏感性降低(P<0.05)。

2.8 沉默Bmi1對(duì)NK細(xì)胞殺傷高濃度葡萄糖處理的G401細(xì)胞敏感性的影響

由于15 mmol·L-1葡萄糖對(duì)NK細(xì)胞殺傷G401細(xì)胞的抑制作用最強(qiáng)，因此選擇15 mmol·L-1葡萄糖處理的G401細(xì)胞作為此實(shí)驗(yàn)細(xì)胞。LDH實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，NK細(xì)胞對(duì)si- NC組G401細(xì)胞的殺傷率為11.13±0.23，對(duì)si- Bmi1組G401細(xì)胞的殺傷率為32.16±0.27，兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.9 NKG2D抗體對(duì)NK細(xì)胞殺傷G401細(xì)胞敏感性的影響

LDH實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，NKG2D抗體封閉NK細(xì)胞表面的NKG2D受體，NK細(xì)胞對(duì)高濃度葡萄糖處理的G401細(xì)胞的殺傷敏感性低于單抗阻斷前(P<0.05)。比較抗體封閉前后不同葡萄糖濃度下NK細(xì)胞對(duì)G401細(xì)胞的殺傷敏感性差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表6。此外，NK細(xì)胞對(duì)沉默Bmi1后的高濃度(15 mmol·L-1)葡萄糖處理的G401細(xì)胞的殺傷敏感性低于單抗阻斷前(P<0.05)，見(jiàn)表7。

表6 NKG2D抗體對(duì)NK細(xì)胞殺傷不同濃度葡萄糖作用的G401細(xì)胞敏感性的影響

表7 NKG2D抗體對(duì)NK細(xì)胞殺傷沉默Bmi1高濃度葡萄糖處理的G401細(xì)胞敏感性的影響

3 討 論

小兒腎母細(xì)胞瘤是小兒泌尿系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤，發(fā)病率約占小兒實(shí)體瘤的8%[7]。研究顯示，小兒腎母細(xì)胞瘤患兒在治療過(guò)程中機(jī)體糖代謝異常，導(dǎo)致患兒患糖尿病的概率增加[8]。最新研究發(fā)現(xiàn)，機(jī)體內(nèi)高濃度的葡萄糖會(huì)抑制NK細(xì)胞的數(shù)量和功能[9- 10]。NK是機(jī)體重要的淋巴細(xì)胞，在抑制腫瘤免疫逃逸中發(fā)揮重要作用，因此探究高濃度葡萄糖對(duì)小兒腎母細(xì)胞瘤免疫逃逸的影響是十分必要的。

Bmi1是PRC1家族的主要成員之一，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮促癌因子的作用[11- 12]。最新研究顯示，高濃度葡萄糖可通過(guò)Bmi1促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞逃避NK細(xì)胞的免疫殺傷[5]。本研究發(fā)現(xiàn)Bmi1在小兒腎母細(xì)胞瘤組織和G401細(xì)胞中高表達(dá)，隨著葡萄糖濃度的升高，G401細(xì)胞中Bmi1表達(dá)量也隨之升高，說(shuō)明高濃度葡萄糖可促進(jìn)G401細(xì)胞中Bmi1的表達(dá)。

Duan等[5]研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)Bmi1通過(guò)抑制MICA和MICB表達(dá)，降低NK細(xì)胞對(duì)胰腺癌細(xì)胞的殺傷敏感性。NK細(xì)胞表面關(guān)鍵的活化性抗體NKG2D與腫瘤細(xì)胞表面活化性受體NKG2DL(MICA和MICB)結(jié)合，給予NK細(xì)胞活化性信號(hào)，直接殺傷腫瘤細(xì)胞。近年研究發(fā)現(xiàn)，高濃度葡萄糖參與調(diào)控NK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷敏感性[13]。連小珂等[14]研究發(fā)現(xiàn)，消化系統(tǒng)惡性腫瘤患者體內(nèi)的高血糖會(huì)抑制NK細(xì)胞數(shù)量及其功能的發(fā)揮。本研究發(fā)現(xiàn)，高濃度的葡萄糖抑制G401細(xì)胞中MICA和MICB的表達(dá)，并降低NK細(xì)胞對(duì)G401細(xì)胞的殺傷敏感性；在機(jī)制探討部分，我們著重研究Bmi1在其中發(fā)揮的作用。研究發(fā)現(xiàn)沉默Bmi1可逆轉(zhuǎn)高濃度葡萄糖對(duì)MICA和MICB表達(dá)及NK細(xì)胞殺傷G401細(xì)胞敏感性的抑制作用。此外，利用NKG2D抗體作用于NK細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，NK細(xì)胞對(duì)高濃度葡萄糖處理的G401細(xì)胞及沉默Bmi1的高濃度葡萄糖處理的G401細(xì)胞的殺傷敏感性均降低。這表明，高濃度葡萄糖是通過(guò)Bmi1抑制G401細(xì)胞MICA及MICB的表達(dá)，減少G401細(xì)胞表面MICA及MICB與NK細(xì)胞表面MG2D的結(jié)合，抑制NK細(xì)胞對(duì)G401細(xì)胞的殺傷敏感性。

綜上所述，Bmi1在小兒腎母細(xì)胞瘤組織及腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞G401中高表達(dá)，高濃度葡萄糖促進(jìn)Bmi1的表達(dá)，抑制MICA和MICB的表達(dá)，降低NK細(xì)胞對(duì)G401細(xì)胞的殺傷敏感性，沉默Bmi1可逆轉(zhuǎn)高濃度葡萄糖對(duì)MICA和MICB表達(dá)及NK細(xì)胞殺傷G401細(xì)胞敏感性的抑制作用，這可為進(jìn)一步探討小兒腎母細(xì)胞瘤免疫逃逸機(jī)制提供新的思路。