MIF在不同直徑豬卵泡的表達(dá)變化規(guī)律

陳彥宏 曾申明

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，北京 100193)

卵泡發(fā)育由一系列相互關(guān)聯(lián)和高度協(xié)調(diào)的復(fù)雜事件組成，包括原始卵泡募集、顆粒細(xì)胞和膜細(xì)胞增殖、卵母細(xì)胞成熟和排卵等[1]。每個(gè)階段的卵母細(xì)胞、顆粒細(xì)胞和膜細(xì)胞層都會(huì)分泌大量的激素和細(xì)胞因子進(jìn)行信息交流[2]。卵泡的生長(zhǎng)和排卵伴隨著顆粒細(xì)胞和膜細(xì)胞的增殖，并有炎癥反應(yīng)發(fā)生，所以免疫系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)都對(duì)卵巢功能起著非常重要的作用。大量的免疫組化結(jié)果表明，細(xì)胞因子作為繁殖過(guò)程中的主要介質(zhì)之一，參與了卵巢功能的調(diào)節(jié)，在卵泡閉鎖、排卵和黃體溶解過(guò)程中起重要作用[3]。例如，IL-1β可增強(qiáng)排卵前的顆粒細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的基因表達(dá)[4]，以促進(jìn)排卵[5]，同時(shí)也能調(diào)控顆粒細(xì)胞的類(lèi)固醇生成[6]。研究表明，巨噬細(xì)胞參與調(diào)控卵泡發(fā)育和排卵，也對(duì)小鼠發(fā)情周期的正常進(jìn)行起到至關(guān)重要的作用[7]。在生長(zhǎng)小鼠的卵泡中，顆粒細(xì)胞與巨噬細(xì)胞共同培養(yǎng)，可增強(qiáng)顆粒細(xì)胞分泌孕酮[8]。這些結(jié)果表明巨噬細(xì)胞作為排卵過(guò)程中免疫反應(yīng)的關(guān)鍵細(xì)胞之一，可能在卵泡發(fā)育的局部調(diào)控中發(fā)揮重要作用。

巨噬細(xì)胞遷移抑制因子(Macrophage migration inhibitory factor, MIF)由各種免疫細(xì)胞分泌，通過(guò)抑制巨噬細(xì)胞遷移至炎癥部位，進(jìn)而參與細(xì)胞免疫[9]。MIF在先天免疫和后天免疫反應(yīng)中都具有重要作用[10]。已有研究表明，MIF可激活淋巴細(xì)胞、粒細(xì)胞和單核/巨噬細(xì)胞[11]。此外，MIF可以中和類(lèi)固醇激素，具有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的作用[11]。MIF還參與調(diào)節(jié)糖皮質(zhì)激素介導(dǎo)的免疫抑制，促進(jìn)細(xì)胞存活[12]。MIF參與巨噬細(xì)胞黏附和殺死腫瘤活性[13]。MIF 不僅有助于抵抗感染因子，而且對(duì)感染性、自身免疫性和變應(yīng)性疾病中的細(xì)胞和組織損傷修復(fù)也有貢獻(xiàn)[14]。多年以來(lái)，MIF被認(rèn)為與急性炎癥反應(yīng)中的炎癥因子(TNF-α、IL和IFN)分泌增加有關(guān)[15]。因此，MIF是炎癥反應(yīng)過(guò)程中的關(guān)鍵細(xì)胞因子之一。在關(guān)于卵巢功能的研究中發(fā)現(xiàn)，排卵是卵巢中最活躍的生物學(xué)過(guò)程之一，排卵過(guò)程常伴隨著眾多炎癥反應(yīng)，此時(shí)巨噬細(xì)胞則會(huì)釋放細(xì)胞因子參與免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)[16]。有研究表明，健康女性排卵期血清中的MIF質(zhì)量濃度顯著高于卵泡發(fā)育期[17]。這些結(jié)果說(shuō)明MIF 與卵泡發(fā)育和排卵機(jī)制有關(guān)。

豬作為多胎動(dòng)物，在卵泡發(fā)育過(guò)程中，會(huì)有很多卵泡發(fā)育成熟或閉鎖退化，這會(huì)引發(fā)卵巢的局部炎癥反應(yīng)[18]。Yang等[19]研究發(fā)現(xiàn)，在同一直徑的母豬健康和閉鎖卵泡中，健康卵泡MIF表達(dá)量顯著高于閉鎖卵泡?；谌撕托∈蟮亩囗?xiàng)研究，MIF參與人和小鼠的卵泡發(fā)育，具有參與調(diào)控免疫反應(yīng)調(diào)控的能力。然而，MIF在母豬卵泡發(fā)育中的具體作用尚不清楚。因此，本研究旨在探究母豬不同直徑健康卵泡中MIF表達(dá)變化規(guī)律，為母豬卵泡發(fā)育和排卵提供新的線索。

1 材料與方法

1.1 樣品準(zhǔn)備

每次試驗(yàn)需要30個(gè)母豬卵巢，分3次，總共90個(gè)母豬卵巢，均來(lái)自于北京市興星肉聯(lián)廠。用含有1%青鏈霉素混合液的37 ℃生理鹽水清洗卵巢。然后從母豬卵巢上選取不同直徑的健康卵泡：大卵泡(L)：>6 mm；中卵泡(M)：3～4 mm；小卵泡(S)：1～2 mm。根據(jù)以上標(biāo)準(zhǔn)，用手術(shù)刀、小剪刀和小鑷子，分離卵泡，并用游標(biāo)卡尺測(cè)量卵泡直徑，然后用10 mL注射器收集相應(yīng)的卵泡液和顆粒細(xì)胞。首先，選取大、中和小卵泡，各抽取卵泡液15 μL，200 g 室溫離心5 min，取上清液，通過(guò)ELISA檢測(cè)MIF質(zhì)量濃度；然后，選取大、中和小卵泡，各抽取卵泡液200 μL，200 g 室溫離心5 min，取沉淀，用PBS重懸，再200 g室溫離心5 min，棄上清，重復(fù)3次。在體視鏡下，用口吸管將卵母細(xì)胞-卵丘細(xì)胞分離，只剩下顆粒細(xì)胞，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western Blot檢測(cè)MIFmRNA和蛋白表達(dá)量；最后，收集分離好的完整的卵泡，放于4% PFA-PBS溶液固定標(biāo)本，通過(guò)免疫熒光檢測(cè)MIF在顆粒細(xì)胞中分布狀況。

1.2 卵泡液中MIF質(zhì)量濃度測(cè)定

根據(jù)試劑說(shuō)明書(shū)(上海機(jī)純實(shí)業(yè)有限公司，JLC30201)配置標(biāo)準(zhǔn)品。先將標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)卵泡液準(zhǔn)確加入酶標(biāo)包被板孔里，再用封板膜封板，置于37 ℃孵育30 min。孵育完成后，用洗滌液洗滌5次。再加入酶標(biāo)試劑后37 ℃孵育30 min。完成后，同樣洗滌5次。然后加入顯色劑，37 ℃避光顯色10 min，再添加終止液終止反應(yīng)。最后將酶標(biāo)包被板置于酶標(biāo)儀(Bio-Rad iMark，USA)，用450 nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度(OD值)。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)卵泡中顆粒細(xì)胞MIF mRNA表達(dá)量

根據(jù)文獻(xiàn)[20]提取豬卵泡的顆粒細(xì)胞RNA，再用微量紫外分光度計(jì)(Nano-300)測(cè)量RNA 的質(zhì)量濃度與純度，檢測(cè)合格后，再用mRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。按照Invitrogen Platinum SYBR Green qPCR SuperMix -UDG試劑(Thermo Fisher，C11744-500)說(shuō)明，以cDNA為模板，引物信息(生工生物工程(上海)股份有限公司合成)如表1，然后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)(Bio-Rad CFX96 Touch，USA)。

表1 RT-PCR 引物序列Table 1 RT-PCR primer sequence

1.4 卵泡中顆粒細(xì)胞MIF 蛋白質(zhì)表達(dá)量測(cè)定

首先用RIPA裂解液裂解母豬顆粒細(xì)胞，提取總蛋白，再用BCA試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司，DQ111-01)測(cè)蛋白質(zhì)量濃度。取15 μL蛋白樣和蛋白maker點(diǎn)樣，然后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、洗膜。切割目的條帶，分別與目的抗體4 ℃孵育過(guò)夜。再用TBST洗膜3次，加入ECL顯色，最后使用曝光儀(Tanon5200，China)曝光。使用ImageJ(National Institutes of Health，NIH)軟件進(jìn)行灰度值分析。

1.5 檢測(cè)MIF在顆粒細(xì)胞分布狀況

分離的卵泡樣本先組織復(fù)水，再進(jìn)行抗原修復(fù)，然后用0.1%PBS-PVA室溫清洗3次，再用0.5%Triton100-PBS 室溫通透1 h。隨后封閉、一抗(MIF，abcam ab175189)4 ℃孵育過(guò)夜，二抗(HRP山羊抗兔二抗 Servicebio GB23303)孵育，再用0.5%Triton-PBS清洗3次。染核和封片，最后用熒光顯微鏡(Olympus IX-70,Japan)觀察。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)試驗(yàn)數(shù)據(jù)均由3次獨(dú)立重復(fù)得出。試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示，利用SPSS(Version 21.0)對(duì)數(shù)據(jù)使用單因素方差進(jìn)行差異顯著分析。實(shí)時(shí)熒光定量PCR數(shù)據(jù)使用2-ΔΔct方法計(jì)算結(jié)果，所得結(jié)果后再進(jìn)行差異顯著分析。當(dāng)P<0.05(*)表示為差異顯著，P<0.01(**)則表示為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同直徑的健康卵泡液中MIF質(zhì)量濃度

用注射器抽取豬不同直徑的健康卵泡液，低速離心后取上清液，通過(guò)ELISA測(cè)得，在大卵泡(>6 mm)、中卵泡(3～4 mm)、小卵泡(1～2 mm)中，大卵泡的卵泡液里MIF質(zhì)量濃度為(32.29±1.47) ng/mL，中卵泡為(54.17±7.86) ng/mL，小卵泡為(38.89±0.98) ng/mL，其中中卵泡卵泡液里的MIF質(zhì)量濃度顯著高于大卵泡和小卵泡卵泡液中的MIF質(zhì)量濃度(P<0.05)(圖1)。

大卵泡(L)，中卵泡(M)，小卵泡(S)；*表示差異顯著P<0.05。Large follicle (L), medium follicle (M), small follicle (S); * indicates significant difference (P<0.05).圖1 不同直徑卵泡液中MIF質(zhì)量濃度Fig.1 Concentration of MIF in follicular fluid of different diameters

2.2 不同直徑的健康卵泡中顆粒細(xì)胞中MIF的表達(dá)

選取這類(lèi)卵泡液里的顆粒細(xì)胞檢測(cè)MIFmRNA的表達(dá)量，中等直徑卵泡MIF的mRNA表達(dá)量顯著高于大卵泡和小卵泡的表達(dá)量(P<0.05)(圖2(a))。再通過(guò)Western Blot 檢測(cè)顆粒細(xì)胞的MIF蛋白質(zhì)量濃度，中等直徑卵泡顆粒細(xì)胞 MIF蛋白質(zhì)表達(dá)量也顯著高于大卵泡和小卵泡表達(dá)(P<0.05)(圖2(b)和(c))。

2.3 MIF在顆粒細(xì)胞的分布

分離出不同直徑健康卵泡，通過(guò)免疫熒光檢測(cè)MIF在顆粒細(xì)胞的分布狀況，由圖3可看到，MIF主要集中在卵泡顆粒細(xì)胞里，顆粒細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均有分布，但主要集中分布于細(xì)胞質(zhì)。

大卵泡(L)，中卵泡(M)，小卵泡(S)；*表示差異顯著P<0.05Large follicle (L), Medium follicle (M), Small follicle (S); * indicates significant difference (P<0.05)(a) MIF mRNA表達(dá)量；(b)和(c) MIF蛋白表達(dá)(a) MIF mRNA expression; (b) and (c) MIF protein expression圖2 不同直徑卵泡中顆粒細(xì)胞中MIF的表達(dá)Fig.2 MIF expression in granulosa cells of different diameter follicles

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)中等直徑健康卵泡液的MIF質(zhì)量濃度最高，小卵泡和大卵泡的MIF含量較少。Wada等[21]研究發(fā)現(xiàn)，健康女性卵巢卵泡液中MIF 的質(zhì)量濃度隨卵泡直徑增大而減少。而且Matsuura 等[22]添加抗MIF 抗體處理卵巢后，與對(duì)照組相比，發(fā)現(xiàn)有腔卵泡數(shù)量減少，卵泡發(fā)育停滯，排卵數(shù)顯著減少(P<0.05)。在進(jìn)行IVF胚胎移植的患者中，Wada 等[23]測(cè)定了血清MIF質(zhì)量濃度的變化，在排卵當(dāng)天MIF質(zhì)量濃度達(dá)到了最大值。小鼠腹腔內(nèi)注射人絨毛膜促性腺激素顯著增加卵泡液中MIF的質(zhì)量濃度[23]。此外，在顆粒細(xì)胞培養(yǎng)基中，添加人絨毛膜促性腺激素刺激后，培養(yǎng)基中MIF質(zhì)量濃度顯著升高[23]。因此，MIF參與卵泡發(fā)育與排卵。

以前主流觀點(diǎn)認(rèn)為MIF一般由各種免疫細(xì)胞分泌。本研究通過(guò)免疫熒光發(fā)現(xiàn)，MIF大量集中于顆粒細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。Wada等[21]通過(guò)使用免疫組織化學(xué)研究，蛋白質(zhì)印跡分析和實(shí)時(shí)熒光定量PCR等方法，證明了培養(yǎng)人卵巢上的顆粒細(xì)胞能表達(dá)MIF。這都充分說(shuō)明，顆粒細(xì)胞能表達(dá)MIF。另外，促性腺激素主要作用于卵巢。為應(yīng)對(duì)促性腺激素的刺激，卵巢上的顆粒細(xì)胞、免疫細(xì)胞和其他細(xì)胞都可能產(chǎn)生MIF，從而導(dǎo)致MIF 在卵泡液和血液的質(zhì)量濃度增加。Calan等[17]研究發(fā)現(xiàn)，在健康女性血清中，排卵期的MIF質(zhì)量濃度顯著高于卵泡發(fā)育期?；诳焖俚恼T導(dǎo)免疫反應(yīng)，排卵被認(rèn)為是一種炎癥反應(yīng)。例如白細(xì)胞的大量涌入，其可分泌大量細(xì)胞因子參與調(diào)控[24]。這些白細(xì)胞(包括淋巴細(xì)胞，粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)通過(guò)分泌一系列蛋白酶和細(xì)胞因子促進(jìn)排卵[25]。巨噬細(xì)胞也在排卵過(guò)程中執(zhí)行多種功能，包括分泌細(xì)胞外基質(zhì)重塑的基質(zhì)金屬蛋白酶和參與顆粒細(xì)胞閉鎖的吞噬作用[26-27]。淋巴細(xì)胞還通過(guò)選擇性產(chǎn)生一系列細(xì)胞因子來(lái)促進(jìn)卵泡發(fā)育[28]。同樣，Van der Hoek等[7]通過(guò)使用氯膦酸脂質(zhì)體處理卵巢，小鼠的巨噬細(xì)胞數(shù)量和排卵數(shù)減少，發(fā)情間期延長(zhǎng)，說(shuō)明卵巢皮質(zhì)上的巨噬細(xì)胞可能參與調(diào)節(jié)卵泡的生長(zhǎng)和排卵，并對(duì)小鼠發(fā)情周期有一定影響。由于排卵期間卵巢內(nèi)會(huì)出現(xiàn)類(lèi)似炎癥反應(yīng)，循環(huán)血液及卵泡液中的炎癥因子(MIF、TNF、IFN和NO等)均上升表達(dá)[29]。細(xì)胞因子間可相互作用，MIF可誘導(dǎo)細(xì)胞分泌TNF、IFN和IL-1，從而刺激細(xì)胞反應(yīng)性表達(dá)[30]。本研究結(jié)果顯示，中等直徑卵泡顆粒細(xì)胞中MIFmRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)量也顯著高于大卵泡和小卵泡中的表達(dá)量(P<0.05)。所以MIF 在卵巢中可能是通過(guò)激活巨噬細(xì)胞來(lái)發(fā)揮作用，其可在卵泡生長(zhǎng)發(fā)育和排卵過(guò)程中誘導(dǎo)其他生長(zhǎng)因子的表達(dá)，為卵泡排卵做好準(zhǔn)備。因此，MIF在卵泡發(fā)育過(guò)程中出現(xiàn)的質(zhì)量濃度變化可能與排卵有著密切關(guān)系。

綜上，隨著母豬卵泡發(fā)育過(guò)程，MIF在健康的中卵泡中大量表達(dá)，小卵泡和大卵泡表達(dá)量都較少。這為母豬卵泡發(fā)育和排卵提供新的線索。后續(xù)研究應(yīng)當(dāng)著重關(guān)注MIF為何在中等直徑卵泡中表達(dá)量最高，以及如何調(diào)控其它炎癥因子，促進(jìn)卵泡發(fā)育與排卵。