基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)?；鞘懰峥寡鬃饔眉皺C(jī)制

王妙然，李 月，張蕓綺，藺曉菁，鐘 瑩，陳春秀，周 永，肖曉秋，李繼斌

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)教研室，2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院重大代謝性疾病轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400016；3.重慶市巴南區(qū)人民醫(yī)院臨床營(yíng)養(yǎng)科，重慶 401320)

動(dòng)物膽汁及其結(jié)石是一種沿用數(shù)千年的傳統(tǒng)中藥原料,可用于治療肝膽疾病、驚厥、創(chuàng)傷和皮膚潰瘍、感染性疾病等。其主要成分包括膽汁酸、膽色素、膽固醇、磷脂及抗氧化物(如維生素E,褪黑素,谷胱甘肽等)。膽汁酸是膽汁的主要成分，由膽固醇在肝臟中合成，儲(chǔ)存于膽囊，并隨進(jìn)食活動(dòng)分泌到腸道。除了能促進(jìn)脂類和脂溶性維生素吸收，還可作為調(diào)節(jié)代謝、炎癥和免疫功能的生物信號(hào)分子[1-2]。牛膽汁和牛膽結(jié)石(牛黃)因其來(lái)源豐富而被廣泛使用。牛膽汁中包含的膽汁酸主要有TCA、TDCA、TCDCA、TLCA、GCA、GDCA、GCDCA、GLCA、ACA等[3]。其中，牛磺石膽酸(taurolithocholic acid，TLCA)是由CDCA衍生而來(lái)的一種典型的次級(jí)膽汁酸，也存在于人類膽汁中，具有抑制炎癥反應(yīng)的作用[4]，但其具體機(jī)制尚未完全明確。近年來(lái)，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法越來(lái)越多地用于中藥復(fù)方或單體成分作用靶點(diǎn)的分析預(yù)測(cè)[5]，具有系統(tǒng)性解釋藥物治療疾病作用機(jī)制的優(yōu)點(diǎn)。因此，本文利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)來(lái)研究TLCA的抗炎作用及機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 TLCA分子結(jié)構(gòu)與作用靶標(biāo)獲取查詢PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/home/chemicals/)并下載TLCA的3D分子結(jié)構(gòu)。將文件導(dǎo)入PharmMapper Service數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.lilabecust.cn/pharmmapper/)和SWISS數(shù)據(jù)庫(kù)(http://swisstargetprediction.ch/)獲得TLCA潛在作用靶點(diǎn)，利用UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)的Retrieve/ID Mapping功能，將靶點(diǎn)UniProt ID轉(zhuǎn)換為Gene Symbol。

1.2 炎癥靶點(diǎn)篩選在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)中(https://www.genecards.org/)檢索獲取炎癥相關(guān)基因，分別與TLCA作用靶點(diǎn)進(jìn)行匹配，得到共同靶點(diǎn)。

1.3 構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖將TLCA炎癥靶點(diǎn)基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string.db.org/)，獲取靶點(diǎn)蛋白-蛋白相互作用關(guān)系圖(PPI)，設(shè)置combined score>0.4，將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape軟件，構(gòu)建TLCA炎癥靶點(diǎn)可視化PPI網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 GO功能富集和KEGG通路分析運(yùn)行R軟件進(jìn)行GO功能富集分析(gene ontology)和KEGG通路富集分析(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)并輸出注釋結(jié)果。

1.5 分子對(duì)接在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)查找TGR5氨基酸序列并輸入SWISS-MODEL數(shù)據(jù)庫(kù)(http://swissmodel.expasy.org/)對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行同源建模。利用AutoDock軟件對(duì)TLCA與TGR5進(jìn)行分子對(duì)接分析。

2 材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

2.1.1材料 小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞由重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院龔建平教授課題組惠贈(zèng)。

2.1.2試劑 高糖DMEM培養(yǎng)基(貨號(hào)：C11995500BT)購(gòu)自Gibco公司。胎牛血清(貨號(hào)：04-005-1A)購(gòu)自BI公司。TLCA(貨號(hào)：700252P)及LPS(貨號(hào)：L2630)購(gòu)自Sigma公司。IFN-γ(貨號(hào)：HY-P7071)購(gòu)自MCE公司。PBS(貨號(hào)：AR1155)購(gòu)自博士德公司。青-鏈霉素溶液(貨號(hào)：C0222)、RIPA裂解液(貨號(hào)：P0013C)、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(貨號(hào)：P0010)、彩色預(yù)染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)液(貨號(hào)：P0068)和Western一抗稀釋液(貨號(hào)：P0023A)均購(gòu)自碧云天公司。辣根素過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(貨號(hào)：98164)、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(貨號(hào)：91196)購(gòu)自CST公司。TRIzol總RNA提取試劑盒(貨號(hào)：9109)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號(hào)：RR047A)、SYBR Green(貨號(hào)：RR820A)購(gòu)自TaKaRa公司。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司設(shè)計(jì)合成。CD86抗體(貨號(hào)：sc-28347)購(gòu)自Santa公司，P65(貨號(hào)：8242)、p-P65(貨號(hào)：3033)、IκBα(貨號(hào)：4818)、p-IκBα(貨號(hào)：2859)、β-actin抗體(貨號(hào)：3700S)購(gòu)自CST公司。Western blot檢測(cè)試劑盒購(gòu)于advansta(貨號(hào)：190720-33)。FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(H+L)購(gòu)自ZSGB-BIO (貨號(hào)：ZF-0312)。

2.1.3儀器 細(xì)胞培養(yǎng)箱、酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司)，正置熒光顯微鏡(德國(guó)Leica公司)，定量PCR儀、電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司)，凝膠/發(fā)光圖像分析系統(tǒng)(法國(guó)Vilber Lourmat公司)。

2.2 方法

2.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及處理 RAW264.7細(xì)胞在含10% FBS、1%青-鏈霉素溶液的DMEM高糖培養(yǎng)基中于37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合至80%左右，按每孔2.0×108L-1個(gè)接種于6孔板，培養(yǎng)過夜后，分別給予TLCA(30 μmol·L-1)、LPS(100 μg·L-1)和IFN-γ(20 μg·L-1)、TLCA聯(lián)合LPS及IFN-γ進(jìn)行干預(yù)，24 h后提取細(xì)胞總RNA和總蛋白。

2.2.2RT-qPCR 按TRIzol RNA提取試劑盒說明書提取細(xì)胞總RNA。取1μg總RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。以GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，根據(jù)2-ΔΔCt計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量,見Tab 1。

2.2.3 免疫熒光將RAW264.7細(xì)胞按每孔5×107L-1個(gè)接種于12孔板過夜，分別給予TLCA(30 μmol·L-1)、LPS(100 μg·L-1)和IFN-γ(20 μg·L-1)、TLCA聯(lián)合LPS及IFN-γ處理24 h。棄培養(yǎng)液，取出爬片，PBS洗3遍后用多聚甲醛固定15 min，山羊血清封閉30 min，4 ℃孵育一抗過夜，孵育熒光二抗，DAPI染胞核后于熒光顯微鏡下觀察并保存圖片，用ImageJ軟件計(jì)算熒光強(qiáng)度。

2.2.4Western blot 提取各組細(xì)胞總蛋白，用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。蛋白變性處理后進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉及抗體TGR5(1 ∶1 000)、P65(1 ∶1 000)、p-P65(1 ∶1 000)、IκBα(1 ∶1 000)、p-IκBα(1 ∶1 000)、β-actin(1 ∶10 000)孵育。辣根素過氧化物酶標(biāo)記二抗孵育后，ECL化學(xué)發(fā)光法顯影，計(jì)算目的蛋白表達(dá)水平。

3 結(jié)果

3.1 TLCA作用靶點(diǎn)篩選將PharmMapper和SWISS數(shù)據(jù)庫(kù)的TLCA 作用靶點(diǎn)與GeneCards得到的炎癥相關(guān)基因進(jìn)行比對(duì)，篩選出87個(gè)TLCA抗炎潛在作用靶點(diǎn)。

利用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，去除離散點(diǎn)后，得到81個(gè)靶點(diǎn)蛋白的相互作用(PPI)關(guān)系圖，其中包括GPBAR1等，再用Cytoscape軟件進(jìn)行可視化處理后篩選得到其核心靶點(diǎn)為SRC、EGFR、MAPK3、PIK3CA、JAK2、IL10、MMP2、KDR和ESR1。

3.2 GO功能富集分析和KEGG通路分析GO結(jié)果表明，這些靶點(diǎn)被富集到1 506個(gè)生物學(xué)過程，與炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)、白細(xì)胞遷移、細(xì)菌分子響應(yīng)、固有免疫調(diào)節(jié)等生物學(xué)過程密切相關(guān)；在細(xì)胞組分方面，富集最多的包括：細(xì)胞膜脂筏、膜微結(jié)構(gòu)域、膜區(qū)；在分子功能中，主要起作用的是蛋白酪氨酸激酶活性、絲氨酸/蘇氨酸激酶活性(Fig 1)。

Fig 1 GO classification enrichment analysis

KEGG結(jié)果顯示, 與81個(gè)潛在靶點(diǎn)基因顯著相關(guān)(P≤0.05)的通路有124條,排名靠前的信號(hào)通路為: PI3K-Akt信號(hào)通路、人類巨細(xì)胞病毒感染、腫瘤蛋白多糖等(Fig 2)。

Fig 2 KEGG pathway analysis

3.3 分子對(duì)接鑒于PPI網(wǎng)絡(luò)圖顯示GPBAR1蛋白(G protein-coupled bile acid receptor 1，即TGR5)為TLCA靶點(diǎn)之一，GO分析也提示靶點(diǎn)基因功能主要富集在“脂筏、微結(jié)構(gòu)域、膜區(qū)”，說明TLCA的抗炎作用與細(xì)胞膜上的分子高度相關(guān)。TGR5是一種G蛋白偶聯(lián)膜受體，作為一種較晚發(fā)現(xiàn)的膽汁酸受體，可能是介導(dǎo)TLCA調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵。因此，本研究選擇TGR5作為關(guān)鍵靶點(diǎn)，利用AutoDock軟件，進(jìn)行分子對(duì)接分析。結(jié)果顯示TLCA與TGR5對(duì)接分?jǐn)?shù)為-9.0，結(jié)合活性較強(qiáng)。此外，運(yùn)用Pymol軟件分析結(jié)合部位發(fā)現(xiàn)，TLCA結(jié)合于TGR5蛋白靠近中心部位，結(jié)合位置較穩(wěn)固(Fig 3)。

Fig 3 Molecular docking of TLCA and TGR5

3.4 TLCA抑制RAW 264.7細(xì)胞M1型極化經(jīng)LPS和IFN-γ處理的RAW 264.7細(xì)胞出現(xiàn)M1型極化特征，包括體積變大、形態(tài)不規(guī)則、伸出偽足，胞質(zhì)顏色變淡；而聯(lián)合TLCA處理后，M1型RAW 264.7細(xì)胞數(shù)量減少。相應(yīng)地，LPS和IFN-γ處理顯著上調(diào)M1型極化相關(guān)炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α、iNOS的mRNA表達(dá)水平(P<0.01)，抗炎介質(zhì)IL-10和M2型標(biāo)志物Arg1表達(dá)也有升高(P<0.01)。聯(lián)合TLCA處理后，IL-6、TNF-α、iNOS的mRNA表達(dá)明顯下降(P<0.05)，但對(duì)IL-10、Arg1表達(dá)無(wú)顯著降低作用(Fig 4)。

Fig 4 Effects of TLCA on expression of IL-1β, TNF-α, iNOS, IL-6, IL-10 and Arg1 induced by LPS and IFN-γ n=6)

免疫熒光結(jié)果表明，M1型極化細(xì)胞標(biāo)志物CD86在LPS和IFN-γ處理后表達(dá)明顯增加(P<0.01)；而TLCA可降低CD86表達(dá)(P<0.01，F(xiàn)ig 5)。

Fig 5 CD86 immunofluorescence

3.5 TLCA抑制RAW264.7細(xì)胞NF-κB通路Western blot結(jié)果顯示，RAW 264.7細(xì)胞在給予TLCA處理后，TGR5蛋白表達(dá)水平明顯上升(Fig 6)。LPS及IFN-γ處理組細(xì)胞p-P65和p-IκBα蛋白表達(dá)增加(P<0.05)，P65蛋白表達(dá)不變，IκBα表達(dá)下降，提示NF-κB信號(hào)通路被激活。而聯(lián)合TLCA處理時(shí)，p-P65、p-IκBα蛋白表達(dá)下降，P65蛋白表達(dá)不變，IκBα表達(dá)升高(P<0.05，F(xiàn)ig 6)。

4 討論

炎癥是多種代謝性疾病發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制，慢性炎癥以分泌促炎細(xì)胞因子的巨噬細(xì)胞積聚為主要特征，被認(rèn)為是腫瘤、胰島素抵抗、肥胖等疾病的重要變化，其病理生理機(jī)制復(fù)雜多樣。其中，炎癥因子在多種疾病中發(fā)揮作用，如：COVID-19、非酒精性脂肪性肝炎、動(dòng)脈粥樣硬化等。當(dāng)病毒感染和/或繼發(fā)感染觸發(fā)的免疫反應(yīng)過量釋放細(xì)胞因子，會(huì)導(dǎo)致組織細(xì)胞“炎癥風(fēng)暴”[6]，表現(xiàn)為全身性高炎癥水平和多器官衰竭，增加患者死亡率。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析篩出TLCA發(fā)揮抗炎作用的靶基因有87個(gè)，其核心靶基因包括SRC、EGFR、MAPK3、PIK3CA、JAK2、IL-10、MMP2、KDR和ESR1。其中SRC、EGFR、MAPK3/ERK1、ESR1、MMP2與腫瘤發(fā)生、血管生成、轉(zhuǎn)移和炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[7-9]。IL-10作為一種重要的抗炎因子可經(jīng)多條信號(hào)通路參與炎癥調(diào)節(jié)。PIK3CA是PI3K的一個(gè)亞基，參與眾多細(xì)胞生物學(xué)過程，包括葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)、癌癥發(fā)生和炎癥反應(yīng)。GO分析和KEGG注釋結(jié)果表明TLCA大多數(shù)抗炎靶點(diǎn)富集于PI3K信號(hào)通路?！凹?xì)胞成分”富集分析排名前3位分別為“脂筏、微結(jié)構(gòu)域、膜區(qū)”，說明TLCA抗炎作用與分布于細(xì)胞膜的分子高度相關(guān)。

膽汁酸主要通過FXR核受體和TGR5膜受體調(diào)控一系列生理活動(dòng)。TGR5又稱GPBAR1，分布于膽囊、肝、骨骼肌和棕色脂肪組織，巨噬細(xì)胞表達(dá)最為豐富[10]。配體與TGR5結(jié)合后，可通過多條激酶通路，如PKA、AKT、SRC激酶、Rho激酶、mTORC1和ERK1/2，進(jìn)而參與葡萄糖穩(wěn)態(tài)、能量代謝和巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥調(diào)節(jié)[11-14]。膽汁酸是最主要的內(nèi)源性配體，其中石膽酸、去氧膽酸、鵝去氧膽酸和膽酸都是有效激活劑[15]。TLCA作為一種結(jié)合次級(jí)膽汁酸，是TGR5的天然強(qiáng)效激動(dòng)劑，EC50為300 nmol·L-1[11]。在本研究中，分子對(duì)接分析也證實(shí)TLCA與TGR5分子具有較高的結(jié)合活性。

巨噬細(xì)胞在炎癥反應(yīng)中居重要地位，已有研究提示TGR5可通過多條途徑降低巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[16-17]。在本研究中，我們選擇LPS和IFN-γ誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞驗(yàn)證TLCA抗炎作用。RAW264.7細(xì)胞具有高度異質(zhì)性，在不同信號(hào)刺激下發(fā)生不同的表型變化。LPS和/或IFN-γ介導(dǎo)的經(jīng)典激活中，巨噬細(xì)胞向促炎表型(M1亞型)極化，TNF-α、IL-6和IL-1β等炎性細(xì)胞因子分泌增多；而IL-4則誘導(dǎo)抗炎表型(M2亞型)極化，產(chǎn)生IL-10等抗炎細(xì)胞因子[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，LPS和IFN-γ處理可誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞M1型極化，炎癥因子表達(dá)水平上升。同時(shí)，p-P65、p-IκBα蛋白表達(dá)升高，提示與巨噬細(xì)胞NF-κB通路被激活有關(guān)。在給予TLCA處理之后，M1型標(biāo)志物表達(dá)下降，NF-κB信號(hào)通路被抑制，但對(duì)M2極化無(wú)明顯降低作用。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選了TLCA抗炎癥的作用靶點(diǎn)，構(gòu)建了藥物-靶點(diǎn)-疾病相互作用網(wǎng)絡(luò)，預(yù)測(cè)了其多靶點(diǎn)機(jī)制。其中，膜受體TGR5作為TLCA的關(guān)鍵靶點(diǎn)是其抗炎作用重要環(huán)節(jié)。在LPS和IFN-γ誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥模型中， TLCA可通過抑制NF-κB信號(hào)通路發(fā)揮抗炎作用。此外，本研究結(jié)果為分析TLCA其他潛在抗炎機(jī)制以及開發(fā)潛在抗炎藥物提供了新的思路。