甘木通活性化合物的抗氧化活性及對(duì)H2O2誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

梁 璐，蔡曉彤，岑慧裕，徐文艷，洪 超，譚 霖，余細(xì)勇

(廣州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，第五附屬醫(yī)院分子靶點(diǎn)與臨床藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼吸道疾病國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 511436)

心血管疾病目前死亡率是排名第一，嚴(yán)重威脅著人類(lèi)健康[1-2]。心血管疾病發(fā)生機(jī)制非常復(fù)雜，心肌細(xì)胞損傷是各種心血管疾病的病理生理學(xué)基礎(chǔ)[3]。心肌細(xì)胞的凋亡可能由氧化應(yīng)激導(dǎo)致，進(jìn)一步損傷心肌細(xì)胞的正常生理功能，最終導(dǎo)致心力衰竭等心血管疾病的發(fā)生[3]。抗氧化劑發(fā)揮抗氧化作用包括直接途徑和間接途徑，前者是通過(guò)抗氧化劑提供氫或電子，對(duì)自由基、活性氧和活性氮等起到直接抑制作用；而間接途徑涉及通過(guò)誘導(dǎo)II期解毒和抗氧化酶的高表達(dá)來(lái)提供對(duì)氧化應(yīng)激的防御[4]。因此，臨床上應(yīng)更加關(guān)注氧化應(yīng)激在心臟損傷中的發(fā)病機(jī)制，開(kāi)發(fā)更多抗氧化劑的治療干預(yù)手段。

由于天然抗氧化劑的高安全性，植物抗氧化劑的研究引起了人們的廣泛關(guān)注[5]。本研究所選植物甘木通含有珍貴的木脂素和黃酮類(lèi)化合物，具有多種藥理作用。甘木通(ClematisfilamentosaDunn.)是毛莨科絲鐵線蓮屬植物，在我國(guó)廣東、廣西、海南、云南等地均有分布，其對(duì)多種心血管疾病有較好的治療效果。然而，甘木通中藥理活性成分尚不清楚，目前缺乏從甘木通中分離提取的單體化合物對(duì)心血管系統(tǒng)疾病的研究。本研究通過(guò)分離純化甘木通提取物，得到木犀草素、咖啡酸、落葉松樹(shù)脂醇、脲醛苷、二氫脫氫雙煙酰基醇、芹菜素、黃芩苷、蒙花苷、齊墩果酸和鼠尾草素，化學(xué)結(jié)構(gòu)如Fig 1所示。H2O2是一種性質(zhì)穩(wěn)定的細(xì)胞損傷模型的誘導(dǎo)劑，易于穿透細(xì)胞膜進(jìn)入胞內(nèi)，H2O2誘導(dǎo)心肌細(xì)胞氧化損傷是目前實(shí)驗(yàn)室常用的一種心肌細(xì)胞損傷造模方法[6]，能較好地模擬體內(nèi)細(xì)胞損傷過(guò)程[7]。本研究以大鼠H9C2細(xì)胞為研究對(duì)象，探討甘木通中10種化合物的抗氧化活性及其對(duì)H2O2誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，旨在為甘木通活性化合物的臨床應(yīng)用及心肌細(xì)胞損傷的藥理作用研究提供參考依據(jù)。

Fig 1 The chemical structures of isolated compounds from Clematis filamentosa Dunn.

1 材料與方法

1.1 植物材料甘木通采集于中國(guó)省云南永壽區(qū)，由云南大學(xué)中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)李國(guó)棟教授鑒定。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器低溫高速離心機(jī)(德國(guó)Hettich 公司)；垂直電泳槽、轉(zhuǎn)膜儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；凈工作臺(tái)(蘇州儀器廠)；CO2培養(yǎng)箱(Thermo)；-80 ℃冰箱(Thermo Fisher Scientific Inc)；酶標(biāo)儀(美國(guó)加利福尼亞州森尼維爾市分子設(shè)備公司)；Agilent StrataGene Mx3000P QPCR(Agilent Technolo-gies)；流式細(xì)胞儀(Becton Dickinson-Facsort)。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑DMEM培養(yǎng)基(貨號(hào)：12491-015)、胎牛血清(貨號(hào)：10099)購(gòu)于美國(guó)Gibco公司；胰蛋白酶(貨號(hào)：T2601)、青-鏈霉素溶液(貨號(hào)：ZS507)、MTT(貨號(hào)：M2128)、DMSO(貨號(hào)：D2650)購(gòu)自美國(guó) Sigma 公司；GAPDH 抗體(貨號(hào)：TA-08)、抗兔二抗(貨號(hào)：ZDR-5118)、抗鼠二抗(貨號(hào)：ZDR-5117)購(gòu)自北京中杉金橋；anti-caspase-3抗體(貨號(hào)：AB13847)、anti-HO-1 抗體(貨號(hào)：AB13248)、anti-β-actin抗體(貨號(hào)：AB8227)購(gòu)自Abcam公司；Lipofectamine 2000(貨號(hào)：11668027)、TRIzol(貨號(hào)：10296010)購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；熒光素酶報(bào)告試劑盒(貨號(hào)：KA3714)購(gòu)自美國(guó)Promege 公司；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)：C1067S)購(gòu)自碧云天生物公司，Quantitect逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號(hào)：204145)購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)從上海生物科學(xué)研究所(中國(guó)上海)購(gòu)買(mǎi)H9C2心肌細(xì)胞，細(xì)胞在含有10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中。

1.5 細(xì)胞活性測(cè)定96孔板中每孔接種3 000個(gè)H9C2細(xì)胞。24 h后，將細(xì)胞分別與從甘木通中分離的10個(gè)化合物(最終濃度分別為5、10和20 μmol·L-1)進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)12 h，然后用450 μmol·L-1的H2O2處理，1 h后，用新的培養(yǎng)基替換原培養(yǎng)基，24 h后往各孔加入20 μL MTT試劑，混勻，于37 ℃孵育4 h。棄上清后各孔加入150 μL二甲基亞砜，于37 ℃孵育30 min，用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔在570 nm處的吸光度(OD值)。

1.6 DPPH自由基清除活性測(cè)試將10 μL樣品(終濃度分別為5、10、20 mol·L-1)與90 μL的乙醇充分混合均勻后加入200 μL 0.004% DPPH。將其混勻，然后立即放入紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，以監(jiān)測(cè)517 nm處的吸光度下降過(guò)程，持續(xù)監(jiān)測(cè)70 min，直到反應(yīng)達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。抗壞血酸是一種穩(wěn)定的抗氧化劑，作為合成參考物，純乙醇作為對(duì)照樣品。IC50值表示清除DPPH抑制產(chǎn)生的50%自由基所需的濃度/%=[(空白樣品吸光度值A(chǔ)B-被測(cè)樣品吸光度值A(chǔ)A)/空白樣品吸光度值A(chǔ)B]×100%。

1.7 還原能力測(cè)定用鐵還原法評(píng)價(jià)從甘木通中分離得到的化合物的鐵還原活性。取甘木通提取物乙醇溶液500 μL，分別加入等量0.2 mol·L-1磷酸鹽緩沖液和1%鐵氰化鉀，50 ℃孵育20 min，加入10%三氯乙酸2.5 mL，650 r·min-1離心10 min。取500 μL上層溶液與500 μL蒸餾水和100 μL 0.1% FeCl3混合，檢測(cè)700 nm處的吸光值。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)將H9C2心肌細(xì)胞與20 μmol·L-1木犀草素、20 μmol·L-1二氫脫氫雙煙?；?、5 μmol·L-1落葉松樹(shù)脂醇、20 μmol·L-1芹菜素、20 μmol·L-1脲醛苷、5 μmol·L-1咖啡酸培養(yǎng)12 h，然后暴露于450 μmol·L-1H2O2中1 h，用PBS洗滌兩次并收集細(xì)胞，加入5 μL Annexin V-FITC，4 ℃避光孵育10 min，用PI復(fù)染，10 min后測(cè)定各組凋亡率。

1.9 活性氧測(cè)量利用DCFH-DA流式細(xì)胞儀監(jiān)測(cè)活性氧的生成。將H9C2心肌細(xì)胞與20 μmol·L-1木犀草素、20 μmol·L-1二氫脫氫雙煙酰基醇、5 μmol·L-1落葉松樹(shù)脂醇、20 μmol·L-1芹菜素、20 μmol·L-1脲醛苷、5 μmol·L-1咖啡酸培養(yǎng)12 h，隨后暴露于450 μmol·L-1H2O2中1 h，然后，將細(xì)胞加入含50 mmol·L-1葡萄糖的PBS中，在37 ℃環(huán)境下與10 μmol·L-1DCFH-DA孵育30 min，流式細(xì)胞儀測(cè)定非特異性細(xì)胞酯酶水解二氯二氫熒光素-二醋酸酯(DCFH-DA)與DCFH的熒光生成以及隨后的過(guò)氧化物氧化DCFH的結(jié)果。

1.10 Western blot提取總蛋白后進(jìn)行蛋白定量。在12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠的電泳孔中分別加入marker和蛋白樣品后在100 V恒壓下電泳，250 mA恒流轉(zhuǎn)膜，室溫下用含5%脫脂奶粉的TBST將硝酸纖維素膜封閉1 h。然后孵育一抗：anti-caspase3(1 ∶1 000)、anti-HO-1(1 ∶500)，anti-GCLC(1 ∶500)和anti-β-actin(1 ∶10 000)。室溫孵育二抗1 h，用HRP化學(xué)發(fā)光液顯色。

2 結(jié)果

2.1 甘木通提取物的自由基清除作用和還原能力測(cè)定為了探究甘木通提取物對(duì)自由基清除活性是否有直接的抗氧化作用，采用DPPH法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示，自由基清除率與木犀草素、二氫脫氫雙煙酰基醇 、落葉松樹(shù)脂醇、芹菜素、脲醛苷和咖啡酸劑量呈正相關(guān)，其中木犀草素具有最高的清除活性(Fig 2A)。并且，我們測(cè)定了10種甘木通提取物對(duì)Fe3+轉(zhuǎn)化為Fe2+的還原能力。鐵還原法測(cè)定結(jié)果顯示，還原力與木犀草素、二氫脫氫雙煙酰基醇、落葉松樹(shù)脂醇、芹菜素、黃芩苷、脲醛苷、咖啡酸和鼠尾草素濃度呈正相關(guān)，其中木犀草素還原力最高(Fig 2B)。

Fig 2 DPPH radical scavenging activities (A) and ferric reducing assays (B) of ten compounds from Clematis filamentosa Dunn.

2.2 甘木通提取物對(duì)H2O2誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞損傷的影響MTT法測(cè)定結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，20 μmol·L-1木犀草素、20 μmol·L-1二氫脫氫雙煙?；?、5 μmol·L-1落葉松樹(shù)脂醇、20 μmol·L-1芹菜素、20 μmol·L-1脲醛苷和5 μmol·L-1咖啡酸處理組細(xì)胞存活率從(49.46±2.32)%(H2O2單獨(dú)處理)顯著增加到(96.1±5.49)%，(80.65±6.37)%、(73.75±5.35)%、(77.23±0.9)%、(69.89±1.83)%和(62.42±2)%(Fig 3)。這些結(jié)果表明，從甘木通中分離得到的化合物減弱了H2O2誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞損傷。因此，基于以上研究結(jié)果，我們用20 μmol·L-1木犀草素、20 μmol·L-1二氫脫氫雙煙?；?、5 μmol·L-1落葉松樹(shù)脂醇、20 μmol·L-1芹菜素、20 μmol·L-1脲醛苷和5 μmol·L-1咖啡酸進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

Fig 3 Effects of ten compounds from Clematis filamentosa Dunn. on cell viability with or without 450 μmol·L-1 H2O2 in H9C2 cells

2.3 甘木通化合物對(duì)H2O2誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響細(xì)胞內(nèi)活性氧是細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激指標(biāo)[8]。DCFH-DA熒光探針研究結(jié)果顯示，木犀草素、二氫脫氫雙煙酰基醇、落葉松樹(shù)脂醇、芹菜素、脲醛苷和咖啡酸對(duì)H2O2誘導(dǎo)的活性氧升高有抑制作用。單純H2O2處理的細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度為(53.17±1.26)%。在H2O2誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞中，木犀草素、二氫脫氫雙煙?；?、落葉松樹(shù)脂醇、芹菜素、脲醛苷和咖啡酸處理后，其均值分別降為(9.48±2.05)%、(38.53±3.01)%、(12.62±2.13)%、(42.92±3.95)%、(10.5±1.39)%和(11.46±0.97)%(Fig 4A)。表明了甘木通提取物可以降低H2O2誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞內(nèi)ROS的水平。

Fig 4 Effects of luteolin, dihydrodehydrodiconiferyl alcohol, lariciresinol, apigenin, urolignoside and caffeic acid from Clematis filamentosa Dunn. on ROS formation and apoptosis in H2O2-induced H9C2 cells

2.4 甘木通提取物對(duì)H2O2誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞凋亡的影響流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明，H2O2誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞凋亡率為(41.36±2.63)%，對(duì)照組為(2.73±1.34)%。在H2O2誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞中，木犀草素、二氫脫氫雙煙?；肌⒙淙~松樹(shù)脂醇、芹菜素、脲醛苷和咖啡酸處理后，凋亡細(xì)胞的百分比分別下降到(10.5±2.69)%、(39.21±3.14)%、(12.31±1.58)%、(36.21±1.42)%、(13.21±2.09)%和(16.24±3.04)%(Fig 4B)。提示，甘木通提取物能顯著抑制H2O2誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞凋亡。

2.5 甘木通提取物對(duì)H2O2誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞中caspase-3和抗氧化酶表達(dá)的影響Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，450 μmol·L-1H2O2誘導(dǎo)后，cleaved-caspase-3的表達(dá)水平明顯提升。木犀草素、落葉松樹(shù)脂醇、脲醛苷、二氫脫氫雙煙?；肌⑶鄄怂睾涂Х人崮苁笻2O2誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞中caspase-3的活化受到抑制。木犀草素、二氫脫氫雙煙?；?、落葉松樹(shù)脂醇、芹菜素、脲醛苷和咖啡酸處理H2O2誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞中HO-1和GCLC蛋白水平顯著升高(Fig 5)。我們的研究表明，通過(guò)抗氧化酶的激活，甘木通提取物可保護(hù)H9C2心肌細(xì)胞免受氧化損傷。

Fig 5 Effects of luteolin, dihydrodehydrodiconiferyl alcohol, lariciresinol, apigenin, urolignoside and caffeic acid from Clematis filamentosa Dunn. on caspase-3 and antioxidant enzyme expression in H2O2-induced H9C2 cells

3 討論

甘木通能擴(kuò)張血管并改善血循環(huán)，其成藥“冠心康片”有緩解冠心病病人心絞痛的功效，但其確切的有效成分尚不明確，提示甘木通中活性成分對(duì)心肌細(xì)胞損傷的藥理作用及機(jī)制值得進(jìn)一步探討。本研究從甘木通中提取得到木犀草素、咖啡酸、落葉松樹(shù)脂醇、脲醛苷、二氫脫氫雙煙?；?、芹菜素、黃芩苷、蒙花苷、齊墩果酸和鼠尾草素10個(gè)化合物。因此，甘木通的抗氧化特性可能與這些活性物質(zhì)的存在有關(guān)。DPPH反應(yīng)和還原能力測(cè)定結(jié)果表明，木犀草素的自由基清除能力和還原能力最強(qiáng)，其次是咖啡酸、落葉松樹(shù)脂醇、脲醛苷、二氫脫氫雙煙酰基醇、芹菜素、黃芩苷、蒙花苷、齊墩果酸和鼠尾草素。它們使H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激受到抑制，H9C2心肌細(xì)胞的存活率有所提高。其中木犀草素、二氫脫氫雙煙?；?、落葉松樹(shù)脂醇、芹菜素、脲醛苷和咖啡酸具有較強(qiáng)的細(xì)胞保護(hù)作用，并進(jìn)一步測(cè)定了它們對(duì)H2O2誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)機(jī)制。

有報(bào)道指出，H2O2可通過(guò)刺激細(xì)胞產(chǎn)生ROS自由基誘發(fā)凋亡，ROS自由基過(guò)多已經(jīng)成為缺血性心臟病的主要特征[9]。研究發(fā)現(xiàn)，ROS過(guò)量生成會(huì)導(dǎo)致線粒體滲透性轉(zhuǎn)換孔(mPTP)進(jìn)一步開(kāi)放，從而使線粒體膜電位去極化，caspase-3通路被激活，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[10]。大量的活性氧能誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞自噬，從而造成細(xì)胞死亡[11-12]。本研究結(jié)果表明，從甘木通中分離得到化合物(木犀草素、二氫脫氫雙煙?；?、落葉松樹(shù)脂醇、芹菜素、脲醛苷和咖啡酸)能夠保護(hù)H9C2心肌細(xì)胞免受H2O2的損傷，降低H2O2誘導(dǎo)產(chǎn)生的活性氧積累，同時(shí)，抑制caspase-3的激活可進(jìn)一步抑制細(xì)胞凋亡。因此，從甘木通中分離的化合物對(duì)H2O2誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞凋亡的抑制作用與caspase-3凋亡途徑有關(guān)。

核因子NF-E2相關(guān)因子(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)是氧化應(yīng)激反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子，可與抗氧化反應(yīng)元件ARE產(chǎn)生作用，誘導(dǎo)下游調(diào)控的多種解毒酶和抗氧化酶表達(dá)，使血紅素氧合酶(heme oxygenase 1，HO-1)和谷胱甘肽(GSH)的表達(dá)水平提高[13]，清除自由基，細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡得到維持，保護(hù)內(nèi)源性細(xì)胞。甘木通提取物能夠上調(diào)HO-1和GSH生物合成的限速酶(glutamate-cysteine ligase catalyzes the subunit，GCLC)的表達(dá)，提供了有效的內(nèi)源性抗氧化防御機(jī)制。

綜上，甘木通活性化合物能減少H2O2對(duì)H9C2細(xì)胞的損傷，提高細(xì)胞活性并抑制其凋亡，改善心肌細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激。這可能與H9C2心肌細(xì)胞中抗氧化酶的激活有關(guān)。這些結(jié)果為甘木通活性化合物的臨床應(yīng)用及心肌細(xì)胞損傷的藥理作用提供了參考。