丙泊酚通過(guò)影響SIRT2調(diào)控線粒體自噬對(duì)酒精性肝損傷的保護(hù)作用

宣文婷，盧昕奕，李 俊

(1． 南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院麻醉科，江蘇 南京 210008；2．安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230032)

酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)是全球范圍內(nèi)常見(jiàn)的肝臟疾病，任何程度的飲酒均會(huì)對(duì)肝臟造成損傷，輕度多無(wú)癥狀，中重度可呈現(xiàn)類似慢性肝炎的表現(xiàn)。長(zhǎng)期發(fā)展下去，可逐漸由脂肪型肝炎演變?yōu)楦卫w維化、肝硬化甚至是肝癌[1]。目前對(duì)ALD的可選的治療方法很有限，主要包括調(diào)脂、抗氧化、抗纖維化等，一旦疾病進(jìn)展到肝硬化階段，有效的治療方案往往只有肝移植，但由于肝移植的供體緊缺，極大地限制了肝移植的進(jìn)展。因此，如能及時(shí)的抑制肝臟的損傷，會(huì)極大地減緩疾病的惡化情況以及為患者進(jìn)行治療而爭(zhēng)取極為寶貴的時(shí)間。

丙泊酚(propofol, Prop)是臨床上常用的靜脈麻醉鎮(zhèn)靜藥物，具有誘導(dǎo)快，患者恢復(fù)快的顯著優(yōu)點(diǎn)，在手術(shù)室和ICU得到了廣泛的應(yīng)用。有證據(jù)指出，Prop不僅具有良好的麻醉效果，還具有很多非麻醉效應(yīng)。適量的Prop能夠顯著緩解因?yàn)橥鈧鶎?dǎo)致的腦損傷。這是因?yàn)镻rop能夠顯著地調(diào)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞的細(xì)胞周期，使大部分細(xì)胞免于過(guò)量凋亡[2]。除此之外，Prop具有免疫調(diào)節(jié)作用，這可能與在多種腫瘤細(xì)胞中增強(qiáng)T細(xì)胞活性有關(guān)[3]。不僅如此，在大鼠原代心肌細(xì)胞的心肌缺血/再灌注模型中，Prop激活MAPK/ERK通路抑制凋亡發(fā)揮心肌保護(hù)作用[4]。在肝臟中，Prop能夠通過(guò)維護(hù)線粒體膜電位及線粒體呼吸鏈來(lái)減緩缺血/再灌注損傷[5]。

線粒體自噬(mitophagy)是自噬的一種選擇性形式，受損或功能障礙的線粒體被溶酶體吞噬后，形成自噬小體從而降解。肝細(xì)胞線粒體自噬是一種對(duì)線粒質(zhì)量的控制機(jī)制，它可以清除在溶酶體消化過(guò)程中受損的、衰老和多余的線粒體，對(duì)酒精性肝損傷和脂肪肝起到保護(hù)作用。線粒體自噬還能通過(guò)維持正常數(shù)目的線粒體的β氧化的能力來(lái)阻止肝臟脂質(zhì)堆積[6]。值得注意的是，在本課題組前期實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)證實(shí)酒精性肝損傷中的線粒體自噬水平略有提升，這是基于機(jī)體的自我保護(hù)，大幅度增強(qiáng)線粒體自噬水平是可以扭轉(zhuǎn)酒精對(duì)肝臟的損傷[7]。有文獻(xiàn)報(bào)道，Prop可以誘發(fā)骨骼肌的自噬[8]，但Prop在酒精性肝損傷中對(duì)自噬進(jìn)程的影響的尚不明確。

SIRT2是廣泛存在于原核和真核生物的一類蛋白質(zhì)去乙?；?，在哺乳動(dòng)物中，有7種SIRT蛋白，分別是SIRT1-7，存在于不同的亞細(xì)胞定位并且具有不同的功能，在代謝應(yīng)激、控制和限制能量、癌癥的進(jìn)展等中有著重要的作用。SIRT2蛋白最初來(lái)自于酵母細(xì)胞老化的研究，研究發(fā)現(xiàn)SIRT2額外拷貝增加了50%的壽命，而SIRT2的缺失縮短了壽命[9]。在酵母中，SIRT2通過(guò)抑制染色體外有毒的環(huán)狀rDNA的生成來(lái)延長(zhǎng)生命。在肝臟中，激活NAD+/SIRT2通路可以抑制NLRP3炎癥小體復(fù)合，減輕非酒精性肝損傷[10]。但是，在酒精性肝損傷中，SIRT2發(fā)揮著何種作用，尚無(wú)相關(guān)研究。因此，本研究通過(guò)高斌模型法建立小鼠酒精性肝損傷模型，腹腔注射Prop，探討Prop在小鼠酒精性肝損傷中發(fā)揮的作用及相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 本實(shí)驗(yàn)選用雄性C57BL/6J小鼠，8周齡，體質(zhì)量約23 g，購(gòu)自安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格號(hào)：SCXK(皖)2017-001。

1.1.2藥物與試劑 丙泊酚(批號(hào)：P-076)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；SirReal購(gòu)于美國(guó)Selleck公司；胎牛血清，購(gòu)自美國(guó)Lonsera公司；0.25%胰酶消化液購(gòu)自Gibco公司；DMEM/F-12細(xì)胞培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；標(biāo)準(zhǔn)型Lieber-DeCarli液體飼料購(gòu)自特洛菲生物科技公司；ALT試劑盒，購(gòu)自江蘇建成生物工程研究所；伊紅蘇木素染色試劑盒(hematoxylin-eosin staining，HE)購(gòu)自北京碧云天公司；SIRT2(批號(hào)：ab211033)、TOM20(批號(hào)：ab186735)、LC3B(批號(hào)：ab192890)抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，β-actin(批號(hào)：bsm-33036m)購(gòu)自中國(guó)Bioss公司。ECL發(fā)光試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1動(dòng)物模型構(gòu)建 本實(shí)驗(yàn)采用美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院酒精濫用研究中心推薦的酒精性肝損傷模型。先給與小鼠5 d液體飲食適應(yīng)，再給與10 d含酒精液體飼料喂養(yǎng)，最后1 d給與5 g·kg-120%的酒精灌胃。模型組的小鼠給予酒精含量為5%的液體飲食。Prop處理組小鼠預(yù)先2 d給予1、2、3 mg·kg-1Prop腹腔注射。SIRT2抑制劑處理組小鼠預(yù)先兩天給予 25、50 mg·kg-1SirReal2腹腔注射。對(duì)照組給與等量的液體飼料，最后1日灌胃予以麥芽糊精。

1.2.2HE染色 本實(shí)驗(yàn)使用冰凍切片進(jìn)行HE染色，使用4%的多聚甲醛固定小鼠肝臟，室溫干燥30 min后使用PBS溶液浸泡5 min，再蘇木精溶液浸泡5 min，流水沖洗去蘇木精染料，1%鹽酸乙醇浸泡數(shù)秒分色，分別使用20%、25%、50%、75%及無(wú)水酒精浸泡2 min，脫去肝臟中的水分，置于伊紅染料中浸泡2 min，沖洗后再經(jīng)過(guò)兩次的二甲苯溶液進(jìn)行透明化處理。在染色完畢后，應(yīng)用中性樹膠蓋住切片，再加以蓋玻片封片。

1.2.3油紅O染色 將組織標(biāo)本置于冰凍包埋劑中包埋，使用冰凍切片機(jī)將組織切成厚度為10 μm的切片。在多聚甲醛溶液中浸泡15 min以減少氧化，置于異丙醇溶液中浸泡5 min后，油紅O染料孵育10 min，洗凈切片后進(jìn)行蘇木素復(fù)染，最后使用甘油明膠封片處理。

1.2.4Western blot實(shí)驗(yàn) 造模成功的小鼠肝臟置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，?00 mg小鼠肝臟組織放入研磨器，加入1 mL RIPA裂解液，置于冰上研磨15 min。研磨后，2 000 r·min-1，離心15 min，棄去沉淀，取上清液加入SDS-PAGE，體積比例為4 ∶1，置于煮沸的水中，水浴15 min。取總量約為35 μg的總蛋白樣品加入SDS-PAGE凝膠中進(jìn)行電泳，隨后使用三明治轉(zhuǎn)膜方法，電壓100 V，100 min，置于冰水浴，以濕法轉(zhuǎn)膜方式將目的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜完成后，將PVDF膜放在5% 脫脂牛奶常溫封閉2 h，TBS洗滌3遍后，放置于已稀釋的一抗中，4 ℃孵育過(guò)夜。第二日，TBS洗滌3遍后，將入稀釋后的二抗室溫孵育1 h，隨后使用ECL發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯影。

1.2.5免疫熒光和免疫組化 免疫熒光：將儲(chǔ)存于-80 ℃的小鼠肝臟組織冰凍切片，常溫晾干15 min，再使用PBS浸泡10 min，再經(jīng)10%山羊血清室溫封閉1 h，一抗(TOM20 1 ∶200；LC3 1 ∶200)4 ℃孵育過(guò)夜后。次日，PBS洗滌3次，每次5 min，二抗(1 ∶400)室溫避光孵育1 h，PBS洗滌3次后，加入含有DAPI染色劑封片劑封片。在熒光顯微鏡下比較不同組的熒光強(qiáng)度。免疫組化：取出冰凍切片，室溫放置5 min，用冷丙酮固定15 min后，PBS沖洗3次。0.1% Triton X-100浸泡10 min，PBS洗滌3次，再置于3% H2O2溶液避光浸泡20 min,PBS洗滌3次，將組織切片置于10%山羊血清室溫封閉1 h。吸取封閉液，小心滴加一抗(SIRT2 1 ∶200)置于4 ℃冰箱孵育過(guò)夜。次日，PBS洗滌3遍，每遍5 min，然后置于二抗室溫孵育1 h，PBS洗滌3次，每次5 min，使用DAB顯色，自來(lái)水沖洗終止后，蘇木精復(fù)染30 s，再使用自來(lái)水沖洗15 min返藍(lán)。最后二甲苯透明化5 min后，使用中性樹膠封片，置于光學(xué)顯微鏡下分析。

1.2.6分子靶向?qū)?此次試驗(yàn)采用兩種方法預(yù)測(cè)。方法一，通過(guò)STITCH網(wǎng)站在線分析，對(duì)Prop進(jìn)行配體預(yù)測(cè)，得到了迄今為止在公共數(shù)據(jù)庫(kù)中，Prop的配體信息，分?jǐn)?shù)>0.8即有意義。方法二，通過(guò)靶向研究金標(biāo)準(zhǔn)Discovery studio分子模擬分子試驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 丙泊酚抑制酒精誘導(dǎo)的肝損傷通過(guò)血清學(xué)中的ALT和AST檢測(cè)實(shí)驗(yàn)(Fig 1A)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于對(duì)照組小鼠，模型組ALT、AST水平明顯上升(P<0.01)。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果指出2 mg·kg-1的Prop即顯著降低酒精引起的ALT、AST上升(P<0.01)(Fig 1B)。如Fig 1C所示，通過(guò)HE染色發(fā)現(xiàn)，相較于對(duì)照組，模型組小鼠肝臟中脂肪空泡明顯增多(P<0.01)，而Prop組(2 mg·kg-1)相較于模型組，脂肪空泡數(shù)量明顯減少(P<0.05)。由油紅O染色可知(Fig 1D)，相比于對(duì)照組，模型組小鼠肝臟中脂質(zhì)沉積明顯增加(P<0.05)。Prop處理組相較于酒精性肝損傷組，小鼠肝臟中脂肪沉積明顯減輕(P<0.01)。

2.2 丙泊酚顯著增強(qiáng)小鼠肝臟線粒體自噬水平通過(guò)免疫熒光對(duì)LC3和線粒體標(biāo)記物TOM20進(jìn)行共定位分析(Fig 2A)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相較于對(duì)照組，在模型組中，小鼠肝臟中的LC3向線粒體募集(肝臟中的黃色信號(hào)點(diǎn)增多)，提示線粒體自噬水平有所提升(P<0.05)。而對(duì)模型組小鼠進(jìn)行Prop的處理后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LC3顯著地向線粒體轉(zhuǎn)移(P<0.01)。同時(shí)通過(guò)對(duì)各組小鼠血清中的mtDNA進(jìn)行檢測(cè)(Fig 2B)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相較于對(duì)照組，模型組小鼠血清中mtDNA水平明顯升高(P<0.01)，而Prop組能夠明顯降低酒精誘導(dǎo)的高mtDNA水平(Fig 2B)。同時(shí)Western blot實(shí)驗(yàn)也證明酒精能夠略微上調(diào)LC3 II的表達(dá)水平，而Prop能夠明顯活化肝臟中的LC3蛋白(Fig 2C)。以上的實(shí)驗(yàn)表明，Prop能夠明顯增高線粒體自噬水平來(lái)減緩酒精導(dǎo)致的線粒體損傷。

Fig 2 Mitophagy level in mouse liver enhanced by n=3)

2.3 丙泊酚靶向結(jié)合SIRT2蛋白通過(guò)STITCH網(wǎng)站預(yù)測(cè)Prop的受體，發(fā)現(xiàn)SIRT2蛋白可與Prop結(jié)合，且進(jìn)一步分析中發(fā)現(xiàn)SIRT2蛋白與Prop有較高的結(jié)合分?jǐn)?shù)(Fig 3A)。然后我們使用了藥物模擬對(duì)接試驗(yàn)研究金標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SIRT2蛋白內(nèi)側(cè)存在Prop的結(jié)合域(Fig 3B)。以上兩種方法提示Prop可以與SIRT2蛋白相結(jié)合。在Western blot實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)模型組中SIRT2蛋白水平下降(P<0.05)，而在給予Prop處理后，其蛋白水平明顯上升(Fig 3C)。近一步的免疫組化實(shí)驗(yàn)也表明，Prop能明顯上調(diào)酒精導(dǎo)致的SIRT2蛋白低水平(Fig 3D)。以上的實(shí)驗(yàn)表明，Prop可能通過(guò)SIRT2蛋白來(lái)發(fā)揮肝臟保護(hù)作用。

Fig 3 SIRT2 protein specifically binding with propofol n=3)

2.4 SIRT2抑制劑減弱丙泊酚保護(hù)作用通過(guò)ALT和AST實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)Prop可以明顯抑制肝臟損傷，而20 mg·kg-1的SIRT2抑制劑(SirReal2)即可顯著抑制Prop的保護(hù)作用(Fig 4A)。在毒性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)50 mg·kg-1的SirReal2不會(huì)對(duì)正常小鼠的肝臟造成損傷(Fig 4B)。HE染色結(jié)果也表明SirReal2(20 mg·kg-1)即可以明顯抑制Prop的保護(hù)作用(Fig 4C)。同時(shí)Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，SirReal2能夠明顯抑制Prop對(duì)于LC3的活化作用(Fig 4D)。以上的實(shí)驗(yàn)表明SIRT2蛋白是參與肝臟保護(hù)作用的關(guān)鍵因子，介導(dǎo)Prop對(duì)于線粒體自噬的調(diào)控。

3 討論

酒精性肝損傷是各種急性和慢性肝損傷的重要誘因，它是一個(gè)復(fù)雜的病理?yè)p傷過(guò)程，包括從肝臟脂肪化到肝硬化。之前對(duì)酒精性肝損傷病理機(jī)制研究主要集中細(xì)胞損傷、炎癥、氧化應(yīng)激、細(xì)菌移位等。自噬是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)，可分為巨自噬和微自噬，線粒體自噬是微自噬的一種，Youle等[11]的團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)由Park3基因編碼的Parkin蛋白和E3泛素連接酶(E3 ubiquitin ligase)通過(guò)促進(jìn)自噬體吞噬喪失電子的線粒體從而清除功能障礙的線粒體。本課題組前期已經(jīng)證實(shí)線粒體自噬在酒精性肝損傷中發(fā)揮保護(hù)作用，并且可將促進(jìn)線粒體自噬當(dāng)做靶點(diǎn)作為酒精性肝損傷未來(lái)的一項(xiàng)治療策略[7]。Prop在內(nèi)毒素引起的急性肝損傷中，可通過(guò)調(diào)節(jié)TLR4/NF-κB/NLRP3通路降低炎癥和凋亡發(fā)揮保護(hù)作用。不僅如此，Prop還通過(guò)下調(diào)TLR4/NF-κ b介導(dǎo)的iNOS和IL-6基因表達(dá)抑制膿毒癥大鼠肝臟亞硝化和炎癥反應(yīng)發(fā)揮保護(hù)作用[12]。本實(shí)驗(yàn)采用高斌造模法在C57小鼠上構(gòu)建酒精性肝損傷模型，通過(guò)腹腔注射Prop，發(fā)現(xiàn)Prop可以明顯改善酒精引起的肝損傷，并發(fā)現(xiàn)線粒體自噬參與了這一過(guò)程，并發(fā)揮巨大的作用。

不僅如此，我們還通過(guò)分子靶向?qū)蛹夹g(shù)，分析發(fā)現(xiàn)了SIRT2蛋白與Prop有較高的結(jié)合分?jǐn)?shù)，并且在SIRT2蛋白內(nèi)側(cè)存在Prop結(jié)合域。我們通過(guò)蛋白質(zhì)Western blot和免疫組化實(shí)驗(yàn)，證明在小鼠酒精性肝損傷模型中，相較于對(duì)照組，SIRT2蛋白水平顯著下降，肝臟出現(xiàn)些許的線粒體自噬水平上升(基于生理保護(hù)機(jī)制)。經(jīng)Prop處理后，SIRT2蛋白水平和線粒體自噬水平相較于模型組發(fā)生了明顯的上升。這一系列的結(jié)果提示，酒精可能影響小鼠肝臟SIRT2蛋白水平，而SIRT2是參與線粒體自噬的關(guān)鍵分子,Prop可以顯著上調(diào)SIRT2蛋白水平，從而在酒精性肝損傷中發(fā)揮保護(hù)作用。為了證實(shí)這個(gè)結(jié)果，我們使用了SirReal2(特異性SIRT2蛋白抑制劑)，發(fā)現(xiàn)在小鼠酒精性肝損傷模型中，SirReal2減弱Prop引起的線粒體自噬的增強(qiáng)和ALT水平的下降。

SIRT2是NAD+(Nicotinamide adenine dinucleotide，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸)依賴的脫乙酰酶，它相較于其他SIRT家族成員目前研究較少。之前對(duì)SIRT2蛋白的研究主要集中在神經(jīng)系統(tǒng)疾病和腫瘤中[13-14]，我們首次發(fā)現(xiàn)在酒精性肝損傷中，SIRT2也發(fā)揮著重要作用，它通過(guò)上調(diào)自噬水平在酒精性肝損傷中發(fā)揮保護(hù)作用。Liu等[15]發(fā)現(xiàn)在SIRT2缺陷型小鼠中，自噬或線粒體自噬受損，這與我們的研究相一致。

綜上所述，Prop在小鼠酒精性肝損傷模型中發(fā)揮肝臟保護(hù)作用，其作用機(jī)制與調(diào)控SIRT2水平，促進(jìn)線粒體自噬有關(guān)。酒精性肝病的患者在臨床上非常常見(jiàn)，Prop作為臨床上常用的靜脈麻醉藥物，在手術(shù)室內(nèi)外發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)為酒精性肝病患者臨床麻醉的藥物選擇提供了新的用藥參考。