高產(chǎn)谷氨酸脫羧酶的菌株篩選及鑒定

■孫 磊 周 成 張 琇 孟 昆 柏映國 涂 濤*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；2.北方民族大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，寧夏特殊生境微生物資源開發(fā)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏銀川 750021；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，北京 100081)

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是一種普遍存在于自然界的四碳非蛋白質(zhì)氨基酸。它在人體內(nèi)作為一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，具有鎮(zhèn)靜安神、降血壓、抗癲癇哮喘、抗氧化衰老、調(diào)節(jié)激素分泌等重要的生理功效，因此，它在農(nóng)牧、食品、工業(yè)、醫(yī)療等多種產(chǎn)業(yè)中都具有廣闊的應(yīng)用前景[1-2]。在畜牧養(yǎng)殖業(yè)，研究發(fā)現(xiàn)GABA可以有效改善動(dòng)物機(jī)體熱應(yīng)激反應(yīng)，促進(jìn)動(dòng)物的生長生殖，因此可以作為一種新型的飼料添加劑，助推畜牧養(yǎng)殖業(yè)綠色健康發(fā)展[3-5]。趙紅霞等[6]的研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加GABA能夠提高凡納濱對蝦的攝食率、增重率和抗亞硝酸氮應(yīng)激的能力；李占占等[7]簡述了γ-氨基丁酸的生物學(xué)功能及其在養(yǎng)雞生產(chǎn)中的研究現(xiàn)狀、應(yīng)用前景；國強(qiáng)[8]在仔豬飼糧中添加20 mg/kg GABA 的研究發(fā)現(xiàn)可以顯著提高仔豬的生產(chǎn)性能，調(diào)節(jié)其血清中激素的分泌，對仔豬的免疫功能和腸道微生物有一定改善的作用；劉巖等[9]在反芻動(dòng)物體內(nèi)研究了γ-氨基丁酸的生理功能及其在奶牛熱應(yīng)激中的應(yīng)用。

目前GABA的生產(chǎn)制備主要有植物富集、化學(xué)合成和微生物發(fā)酵的方式，但是植物富集GABA的方法存在植物生長周期長、效率低的缺點(diǎn)，不能滿足需求，化學(xué)合成的方法又存在著底物腐蝕性、副產(chǎn)物多等弊端[10]。相比較來說，微生物具有生長傳代迅速、培養(yǎng)條件簡單、生產(chǎn)成本低廉的優(yōu)勢。微生物生產(chǎn)GABA是通過其體內(nèi)酶——谷氨酸脫羧酶（glutamate decarbox?ylase，GAD; EC 4.1.1.15）催化L-谷氨酸（L-glutamate，L-Glu）或谷氨酸鈉（monosodium glutamate，MSG）脫羧獲得的[11]。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，通過構(gòu)建表達(dá)水平高、生產(chǎn)效率高的基因工程菌來進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)化，使得該方法更有希望應(yīng)用于GABA的工業(yè)化生產(chǎn)[12]。田靈芝等[13]從植物乳桿菌擴(kuò)增獲得了GAD 基因lpgad，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET-28a-lpgad 后，在大腸桿菌BL21（DE3）中高效誘導(dǎo)其表達(dá)，利用菌體轉(zhuǎn)化L-Glu底物，轉(zhuǎn)化率為97.32%；張六六等[14]通過在枯草芽孢桿菌中優(yōu)化GAD 及輔因子磷酸吡哆醛（pyridoxal 5’-phos?phate，PLP）再生基因的串聯(lián)表達(dá)，構(gòu)建了1 株高產(chǎn)GAD 的重組枯草芽孢桿菌，通過24 h 的全細(xì)胞轉(zhuǎn)化得到327 g/L GABA 的產(chǎn)量。因此，利用微生物進(jìn)行發(fā)酵轉(zhuǎn)化生產(chǎn)GABA，逐漸成為具有發(fā)展?jié)摿Φ木G色生產(chǎn)方式[15]。

GAD已從多種生物資源中都得以挖掘和表征，而現(xiàn)如今，以微生物細(xì)胞為轉(zhuǎn)化平臺(tái)并沒有大規(guī)模實(shí)際應(yīng)用的實(shí)例報(bào)道，歸結(jié)原因主要是：①微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)GABA 的轉(zhuǎn)化率達(dá)不到工業(yè)生產(chǎn)的要求，轉(zhuǎn)化率低；②后期產(chǎn)物的分離純化工藝繁瑣、耗能大，收益低。因此，挖掘優(yōu)良的GAD資源，對于后期構(gòu)建高效率轉(zhuǎn)化性能的細(xì)胞平臺(tái)，實(shí)現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)GABA具有重要意義。本研究基于現(xiàn)如今產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀，確定了具體的研究目的：挖掘新穎的GAD 蛋白資源，進(jìn)行菌株的鑒定，為獲得具有產(chǎn)業(yè)價(jià)值的GAD 資源奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 土樣

從寧夏沙坡頭采集地表下5 cm左右的沙漠土壤樣品，將采集的土樣置于無菌自封袋中，保存于-20 ℃冰箱，用于后期的菌株篩選與分離研究工作。

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑配制

LB液體培養(yǎng)基：酵母粉5 mmol/L，NaCl 10 mmol/L，蛋白胨10 mmol/L，固體培養(yǎng)基另加15～20 mmol/L；發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖30.0 mmol/L、蛋白胨30.0 mmol/L、K2HPO40.6 mmol/L、L-Glu 8.0 mmol/L、NaNO33.0 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 mmol/L、FeSO4·7H2O 0.01 mmol/L、PLP 0.3 mmol/L，pH 6.0，固體發(fā)酵培養(yǎng)基另加瓊脂粉15 mmol/L；常見菌株生理生化鑒定培養(yǎng)基：依據(jù)東秀珠等[16]的《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》配制；50×TAE電泳緩沖液：稱取Tris 242 g，冰乙酸57.1 mL/L，0.5 mmol/L EDTA，pH 8.0；甲基紅指示劑：2 mmol/L，純乙醇溶解；溴甲酚綠指示劑：1 mmol/L，純乙醇溶解；甲基紅-溴甲酚綠指示劑：甲基紅和溴甲酚綠指示劑（V/V=1∶3）混合；NaHCO3：40 mmol/L；2, 4-二甲基胺基偶氮苯-4-磺酰氯溶液（4-N, N-dimethylaminoazobenzene-4'-sulfonyl chloride，DABS-Cl）：1 mmol/L，純乙腈溶解。

1.1.3 試劑及試劑盒

乙酸鈉、L-Glu 和GABA：純度≥99%（Sigma），色譜級乙腈、甲醇：純度≥99%（Thermo Fisher），DABSCl、PLP：純度≥98%（上海麥克林）；Ex Taq DNA 聚合酶購自Vazyme 公司；膠回收試劑盒核酸分子量Marker、細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司。其他所用試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.1.4 試驗(yàn)儀器

PCR 儀、凝膠成像儀均購自美國Bio-Rad 公司；移液器購自德國Eppendorf 公司；酶標(biāo)儀購自美國BioTek公司；高效液相SHIMADZU 20A檢測器購自日本島津公司；色譜柱ZORBAX SB-C18（150×4.6 mm，5 μm）購自美國Agilent公司；臺(tái)式離心機(jī)和立式高速冷凍離心機(jī)購自日本HITACHI 公司；核酸電泳儀、無菌操作臺(tái)、滅菌鍋、水浴鍋、恒溫?fù)u床、培養(yǎng)箱等為國產(chǎn)儀器。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 土樣處理

根據(jù)梯度稀釋法對土壤中的菌株進(jìn)行分離。分別稱取4 g采集的土壤樣品3份，放入盛有40 mL無菌生理鹽水和玻璃珠的100 mL 三角瓶中，土壤稀釋度為10-1。于30 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)30 min。靜置沉淀，吸取500 μL 三角瓶中的上清液置于盛有4.5 mL無菌生理鹽水的Ep 管中，充分振蕩混勻。用滅菌生理鹽水按照上述方法進(jìn)行三次梯度稀釋，共得到稀釋度為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5的土樣稀釋液，分別涂布于含有50 μg/mL 的卡那霉素、50 μg/mL 氨芐西林、100 μg/mL 氯霉素和無抗的4 種LB 固體培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)12 h，觀察菌株生長情況。

1.2.2 純化菌種

根據(jù)單菌分離法對土樣中的菌種進(jìn)行純化分離。挑選各培養(yǎng)皿中形態(tài)不同且出現(xiàn)頻率高的單菌落作為優(yōu)勢菌種進(jìn)行分離純化，直至長出形態(tài)均一的菌落為止。將獲得的菌株以1%的接種量接種于LB培養(yǎng)基中，30 ℃過夜培養(yǎng)后，取400 μL菌液添加到等量的40%的甘油于-80 ℃保存。另外，選擇平板和斜面培養(yǎng)基將菌種保存在4 ℃，每周進(jìn)行一次活化轉(zhuǎn)接。

1.2.3 產(chǎn)GABA菌株的篩選

1.2.3.1 顯色法初篩

調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基至不同pH，吸取20 μL甲基紅-溴甲酚綠指示劑加入到200 μL 發(fā)酵培養(yǎng)基中，觀察顏色變化。

將4 ℃保存的斜面菌用無菌牙簽挑取放入無抗LB 培養(yǎng)基中于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱活化12 h，然后吸取10 μL 滴加在固體發(fā)酵培養(yǎng)基上，置于30 ℃過夜培養(yǎng)。將甲基紅-溴甲酚綠指示劑滴加到平板培養(yǎng)基，靜置5 min，觀察顏色變化。

以1%的接菌量接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基30 ℃下培養(yǎng)72 h。裝液量40 mL/100 mL，搖床轉(zhuǎn)速200 r/min。取2 mL 發(fā)酵72 h 后的混合液于12 000 r/min 離心5 min，吸取20 μL 甲基紅-溴甲酚綠指示劑加入到200 μL發(fā)酵上清液中顯色，對比發(fā)酵前后顏色變化。

1.2.3.2 HPLC復(fù)篩

吸取500 μL發(fā)酵液添加到500 μL 80%的乙醇中終止反應(yīng)，按照邵金良等[17]的測定方法對樣品進(jìn)行HPLC測定。將1 mmol/L的L-Glu和GABA的標(biāo)準(zhǔn)溶液以及上述發(fā)酵后樣品離心后的上清分別取500 μL，依次加入100 μL的NaHCO3溶液和200 μL的DABS-Cl溶液，混合后于70 ℃反應(yīng)20 min，后經(jīng)0.22 μm 的濾膜過濾進(jìn)行HPLC測定。HPLC檢測條件如下：紫外檢測波長為436 nm；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫為30 ℃；流動(dòng)相流速為1.0 mL/min；流動(dòng)相A：乙酸鈉溶液（0.05 mmol/L），35%；流動(dòng)相B：乙腈，65%；色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）。

1.2.4 菌株的形態(tài)鑒定

將分離純化的菌株接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，挑取生長狀態(tài)良好的單菌落置于載玻片上，光學(xué)顯微鏡下觀察菌體的形態(tài)、顏色、邊緣、透明度、表面、有無鞭毛及芽孢著生等。

1.2.5 基因組的提取和16S rDNA的擴(kuò)增

將獲得的菌株以1%的接菌量接到40 mL LB 培養(yǎng)基，于30 ℃培養(yǎng)12 h 后，12 000 r/min 離心1 min，棄上清，收集菌體；采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒分別提取所獲菌株的基因組，提取方法參考試劑盒說明書進(jìn)行；提取基因組后送蘇州金唯智生物科技有限公司測序分析。

分別以菌株Z1、Z11、Z20 的基因組DNA 為模板，對菌株的16S rDNA基因片段進(jìn)行擴(kuò)增，采用通用的引物，正向引物27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCT?CAG-3’和反向引物1492R：5’-GGTTACCTTGTTAC?GACTT-3’。PCR 反應(yīng)體系如下（總體積50 μL）：dNTP 4 μL；正方向引物各2.5 μL；基因組DNA 1 μL；TaqDNA 聚合酶0.5 μL；10×Buffer 5 μL；最后ddH2O補(bǔ)齊至50 μL。

PCR 擴(kuò)增共進(jìn)行30 個(gè)程序循環(huán)：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性50 s，55 ℃退火50 s，72 ℃延伸3 min；再72 ℃延伸5 min。PCR 產(chǎn)物測序由北京六合華大基因科技有限公司完成。

1.2.6 系統(tǒng)發(fā)育分析

將本研究中的3 個(gè)谷氨酸脫羧酶的16S rDNA 序列與NCBI 數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行相似性比對，用MEGA 7.0 軟件中的ClustalW 進(jìn)行序列對比后，參數(shù)默認(rèn)；利用鄰接（Neighbour-joining）方法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，Bootstrap method的設(shè)定值為1 000。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)GABA菌株的篩選

2.1.1 顯色法初篩

未進(jìn)行發(fā)酵的發(fā)酵培養(yǎng)基在不同pH 下，顯示不同的顏色。產(chǎn)GABA 的菌株將底物消耗產(chǎn)生在水溶液中成中性pH的GABA后，培養(yǎng)基pH由酸性轉(zhuǎn)為中性，添加甲基紅-溴甲酚綠酸堿指示劑后，培養(yǎng)基呈現(xiàn)綠色或深綠色顏色（圖1A）。本研究從沙漠土壤樣品中分離到47株菌株，分別接種到發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h后，利用甲基紅-溴甲酚綠酸堿指示劑顯色的方法對GABA產(chǎn)生菌進(jìn)行初篩。從而初步鑒定出3株具有產(chǎn)GABA能力的菌株，并命名為Z1、Z11、Z20（圖1B）。

圖1 發(fā)酵培養(yǎng)基在酸堿指示劑下的顏色反應(yīng)

2.1.2 HPLC復(fù)篩

利用HPLC 對發(fā)酵過后顯綠色的菌株進(jìn)行初篩結(jié)果的驗(yàn)證。首先，如圖2A 所示，經(jīng)HPLC 檢測，L-Glu 的衍生物在0.8 min 左右出峰，而GABA 的衍生物在4.2 min 出峰，推測2.3 min 左右存在的峰是衍生試劑本身的峰。雜質(zhì)峰與GABA 衍生物的峰不存在交叉覆蓋影響，具有良好的峰形。

HPLC檢測發(fā)酵上清液后發(fā)現(xiàn)3株菌在4.0～4.2 min左右都有GABA吸收峰的出現(xiàn)（圖2B），說明經(jīng)72 h發(fā)酵培養(yǎng)后，3株菌都具有將底物轉(zhuǎn)化生成GABA的能力。1 mmol/L GABA的峰面積在1 435 760左右，憑借GABA標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度和峰面積可以計(jì)算出菌株Z1、Z11、Z20所產(chǎn)GABA的濃度，分別為0.80、0.85、0.75 mmol/L。Z1、Z11、Z20所產(chǎn)GABA的峰面積與濃度見表1。

圖2 GABA液相色譜

表1 Z1、Z11、Z20所產(chǎn)GABA的峰面積與濃度

2.2 菌株的鑒定

2.2.1 形態(tài)鑒定

菌株Z1、Z11、Z20在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上呈淡黃色圓形菌落，表面粗糙不透明，邊緣整齊，革蘭氏染色呈陽性。顯微鏡下菌體呈桿狀，兩端鈍圓，多成串出現(xiàn)，有橢圓形芽孢，芽孢囊不膨大，中生或次端生。根據(jù)形態(tài)特征初步判斷菌株Z1、Z11、Z20 為芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)。

2.2.2 16S rDNA序列分析

以菌株Z1、Z11 和Z20 的基因組DNA 為模板，利用通用引物分別對16S rDNA 保守序列進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，均獲得1.5 kb大小的序列，見圖3。

圖3 16S rDNA的PCR產(chǎn)物電泳圖

將純化后的PCR 產(chǎn)物連接到T 載體，經(jīng)過菌落PCR驗(yàn)證得到條帶大小正確的轉(zhuǎn)化子，測序結(jié)果表明三條序列大小均為1.5 kb。三條16S rDNA 序列分別與GenBank 數(shù)據(jù)庫中的16S rDNA 核苷酸序列進(jìn)行同源比較，結(jié)果顯示與黃海芽孢桿菌（Bacillus marisfla?vi）、水生芽孢桿菌（Bacillus aquimaris）、芽孢桿菌CSS-5、芽孢桿菌NH6 等來源的16S rDNA 核苷酸序列相似性最高，可以達(dá)到98%。

2.2.3 序列系統(tǒng)發(fā)育分析

將菌株Z1、Z11 和Z20 的16S rDNA 序列與Gen?Bank 數(shù)據(jù)庫中的16S rDNA 序列做相似性比對，結(jié)果表明3 株菌的16S rDNA 序列均與芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）相關(guān)菌株的16S rDNA 序列的相似性較高，聚為一簇，構(gòu)建Neighbor-Joining 系統(tǒng)進(jìn)化樹如圖4 所示。

圖4 Z1、Z11、Z20與芽孢桿菌屬相關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

結(jié)合形態(tài)特征和系統(tǒng)發(fā)育分析，判定菌株Z1、Z11和Z20均為芽孢桿菌屬，并命名為Bacillus sp. Z1、Bacillus sp. Z11和Bacillus sp. Z20，將所得的菌株保存在中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保存中心（Agriculture Culture Collection of China，ACCC），保藏號分別為ACCC 61750、61747和61748。

2.3 基因組的提取及分析

基因組測序一般包括提取基因組DNA、打斷基因組、末端修復(fù)、加接頭、純化DNA 和上機(jī)測序。將原始數(shù)據(jù)去接頭、去除低質(zhì)量數(shù)據(jù)后獲得高質(zhì)量數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝后，便可以進(jìn)行下一步的編碼基因預(yù)測、非編碼RNA 的預(yù)測，利用NR、KEGG、COG、CAZy 等數(shù)據(jù)庫對預(yù)測出的編碼基因進(jìn)行功能注釋分析。

2.3.1 基因組組裝分析

基因組樣本經(jīng)檢測合格用來構(gòu)建文庫，大片段DNA 將被打斷為約500 bp 的大小片段進(jìn)行測序，測序得到的序列利用Velvet、SSPACE、GapFiller 等軟件進(jìn)行拼接組裝和補(bǔ)齊。三株菌的基因組測序數(shù)據(jù)結(jié)果統(tǒng)計(jì)顯示，菌株Z1、Z11和Z20的基因組全長分別為4.3、4.8 和4.8 Mb，G+C 含量分別為48.5%、47.5%和47.4%。結(jié)果見表2。

表2 基因組組裝分析

2.3.2 基因功能注釋

利用NCBI 的NR（Non-Redundant Protein Data?base）數(shù)據(jù)庫對芽孢桿菌基因進(jìn)行注釋，同時(shí)注釋的結(jié)果包含了物種信息，可用作物種分類。表3 以Z1、Z11、Z20 每個(gè)菌株中的兩個(gè)基因片段為例，闡釋NR數(shù)據(jù)庫的功能注釋作用。

表3 NR數(shù)據(jù)庫的注釋信息

KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）數(shù)據(jù)庫將生物代謝通路劃分為細(xì)胞過程（Cel?lular processes）、遺傳信息處理（Genetic information processing）、新陳代謝（Metabolism）等6類。通過該數(shù)據(jù)庫注釋分析，有助于查看相應(yīng)基因參與的生物通路和生物功能。菌株Bacillus sp. Z1、Bacillus sp. Z11 和Bacillus sp. Z20的基因主要參與碳水化合物、氨基酸、輔因子和維生素的新陳代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、外源物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)等代謝通路。

NR 數(shù)據(jù)庫對基因片段進(jìn)行注釋時(shí)，發(fā)現(xiàn)菌株Z1的6～84 基因片段、Z11 的7～249 片段和Z20 的8～237片段均與來源于蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringi?ensis）的GAD 具有87%的對比相似度，KEGG 對其功能注釋為具有催化活性的谷氨酸脫羧酶。三個(gè)谷氨酸脫羧酶的序列長度均為1 470 bp，編碼489 個(gè)氨基酸和1 個(gè)終止密碼子，理論分子量55 ku。使用SignalP-5.0 在線軟件進(jìn)行分析其序列中不含信號肽片段。三條基因序列的相似性較高，gadz1 與gadz11的序列相似性為97.3%，具有58 個(gè)不同堿基；與gadz20 之間有103 個(gè)不同的堿基，序列相似性為94.5%；gadz11 和gadz20 之間具有106 個(gè)堿基的差別，序列相似性為94.5%。將上述3 個(gè)谷氨酸脫羧酶的序列信息分別提交至GeneBank 數(shù)據(jù)庫，注冊號分別為：MW 703457、MW 703456和MW 703455。

3 討論

γ-氨基丁酸在多個(gè)行業(yè)都具有重要的應(yīng)用價(jià)值。相較于反應(yīng)條件苛刻、能耗高、副產(chǎn)物污染環(huán)境的化學(xué)生產(chǎn)方式，以及受限于植物生長周期長、效率低等弊端的植物富集提取，利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)GABA 更具有開發(fā)的優(yōu)勢。依靠微生物體內(nèi)的谷氨酸脫羧酶將L-Glu 脫羧轉(zhuǎn)化生成GABA，該方法反應(yīng)條件更溫和，且微生物生長傳代迅速[18-20]。根據(jù)不同工業(yè)的應(yīng)用需求，會(huì)有不同的菌株應(yīng)用于生產(chǎn)，比如產(chǎn)GABA 的乳酸菌和米曲霉可以分別應(yīng)用于乳制品和酒品中以增加產(chǎn)品中GABA的含量，使產(chǎn)品更具有保健價(jià)值[21-23]。

GAD為胞內(nèi)酶，其活性的檢測通常需要經(jīng)過細(xì)胞收集破碎、粗酶液提取、酶反應(yīng)、底物減少或產(chǎn)物增加等繁瑣的步驟，因此，建立快捷準(zhǔn)確的GAD活性檢測方法具有重要意義。目前對微生物氨基酸脫羧酶的鑒定中，通常是在培養(yǎng)基中添加溴甲酚紫、甲基紅和相應(yīng)氨基酸，氨基酸脫羧后根據(jù)體系pH會(huì)發(fā)生變化，根據(jù)培養(yǎng)基顏色是否變綠可以進(jìn)行判斷[16]。楊勝遠(yuǎn)等[24]建立了一種pH指示劑法用于快速篩選GAD活性的基因，并且與紙層析法和LC/MS 檢測到的結(jié)果相似。本研究中，利用GAD 脫羧反應(yīng)前后的pH 變化，通過酸堿指示劑從土壤中篩選出產(chǎn)GABA 的疑似菌株，并用HPLC 的方法對初篩的結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證。HPLC檢測GABA具有靈敏度高、準(zhǔn)確性大的優(yōu)點(diǎn)，本研究中選擇DABS-Cl作為衍生試劑，獲得的GABA衍生物性質(zhì)穩(wěn)定，在436 nm處有明顯的紫外吸收峰，且出峰時(shí)間短，有利于后續(xù)試驗(yàn)的進(jìn)行。

本研究通過菌落形態(tài)鑒定和16S rDNA 序列比對，將3 株篩選到的產(chǎn)GABA 的菌株鑒定為芽孢桿菌屬。并通過基因組測序分析，獲得了編碼GAD 的基因序列。雖然芽孢桿菌作為一種新型的具有潛在藥用價(jià)值化合物的產(chǎn)生菌，自1971 年便首次報(bào)道可以產(chǎn)GABA，但實(shí)際上利用芽孢桿菌進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)GABA并沒有突出優(yōu)勢，性質(zhì)最具突出性的GAD多是來源于或異源表達(dá)于大腸桿菌[25-27]。因此，本研究中獲得的GAD編碼序列能否在大腸桿菌中進(jìn)行異源表達(dá)，并實(shí)現(xiàn)后續(xù)GABA 的高效生物轉(zhuǎn)化，需要進(jìn)一步的研究。

4 結(jié)論

本研究從寧夏沙漠土壤樣品中，篩選到了3株產(chǎn)GABA的菌株，經(jīng)過菌落形態(tài)鑒定和16S rDNA序列比對分析鑒定菌株Z1、Z11和Z20均為芽孢桿菌屬，并命名 為Bacillus sp. Z1、Bacillus sp. Z11 和Bacillus sp.Z20，保藏于中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保存中心，保藏號分別為ACCC 61750、61747 和61748。針對3 株菌的全基因組進(jìn)行測序發(fā)現(xiàn)，每株菌含有1個(gè)谷氨酸脫羧酶基因，豐富了谷氨酸脫羧酶的基因資源，為構(gòu)建高效生物轉(zhuǎn)化γ-氨基丁酸GABA工程菌提供了有效素材。