芪參還五膠囊中蟲類藥材的仿生酶解工藝優(yōu)化及抗凝血、溶栓活性評價

王世信，楊美娜，崔友祥，閆國強，丁洪青

（1. 河北省滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 中藥藥學(xué)部，河北 滄州 061001；2. 河北省滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 腦病三科，河北 滄州 061001）

蟲類藥材應(yīng)用歷史悠久，但由于其自身特點和現(xiàn)代研究技術(shù)手段的局限性，對于蟲類藥材的化學(xué)組成、有效成分提取、藥效物質(zhì)基礎(chǔ)等方面的研究始終面臨諸多困難，且難以建立相應(yīng)的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，用藥仍以原蟲、原粉或超細粉入藥，服用劑量較大。由于蟲類藥材的組成結(jié)構(gòu)、成分含量與植物藥有很大區(qū)別，所以傳統(tǒng)植物藥的提取方式并不適用于大多數(shù)蟲類藥研究。蟲類藥材中的蛋白質(zhì)、氨基酸、黏多糖等大分子物質(zhì)，在胃腸道多種有機酸、消化酶等作用下，被分解成小分子肽、低聚糖和其他小分子物質(zhì)，進一步吸收入血并發(fā)揮藥效[1-2]?；诖耍瓯姸鄬W(xué)者研究模擬蟲類藥材在生物體內(nèi)的消化過程，采用仿生酶解法提取有效成分，在保證藥效的同時，以減少服藥劑量和藥物毒性[3]。

芪參還五膠囊是由經(jīng)方“補陽還五湯”合用“桃紅四物湯”加減化裁而來，做為我院協(xié)定處方應(yīng)用多年，后開發(fā)成為醫(yī)院制劑。全方由黃芪、太子參、桃仁、紅花等十九味中藥組成，具有補氣活血、清熱養(yǎng)陰、息風(fēng)化痰、祛瘀通絡(luò)等功效，方中含有地龍、全蝎、水蛭三味蟲類藥材，配合其他諸藥合用，使息風(fēng)止痙、破血逐淤、通絡(luò)止痛效果更甚?，F(xiàn)代藥理研究證實，以上三味藥具有抗凝血、抗血栓、促纖溶等多重藥理活性，臨床用于治療腦中風(fēng)、腦血栓、中風(fēng)后遺癥等，療效顯著[4-5]。為進一步提升藥品質(zhì)量，減少給藥劑量，本文研究芪參還五膠囊中地龍、全蝎、水蛭三味蟲類藥材的提取工藝，采用仿生酶解法與水煎煮、醇提、勻漿等傳統(tǒng)提取工藝進行比較，篩選和優(yōu)化三味蟲類藥材的最佳提取工藝，并對其抗凝血、溶栓活性進行初步評價，現(xiàn)具體報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

ME104T/02電子分析天平（Mettler Toledo公司）；JJ-2高速組織勻漿機（無錫杰瑞安儀器設(shè)備有限公司）；DZF-6050型真空干燥箱（上海博訊實業(yè)有限公司）；Alpha1860S紫外可見分光光度計（上海譜元儀器有限公司）。

1.2 試藥

地龍、全蝎、水蛭藥材購自于安徽友信藥業(yè)有限公司，并經(jīng)滄州市藥檢所鑒定分別為巨蚓科動物參環(huán)毛蚓Pheretima aspergillum （E. Perrier）、鉗蝎科動物東亞鉗蝎Buthus martensii Karsch 和水蛭科動物螞蟥Whitmania pigra Whitman的干燥體。人工胃液：取鹽酸9 ml加水稀釋至1000 ml，即得。人工腸液：取0.2 mol/L磷酸二氫鉀溶液250 ml，加0.2 mol/L 氫氧化鈉溶液118 ml，加水稀釋至1000 ml，即得。胃蛋白酶（≥ 250 u/mg）、胰蛋白酶（≥250 u/mg）、牛血清白蛋白 BSA（純度≥96 %）均購自于Solarbio公司?；罨糠帜蠲笗r間（APTT）、凝血酶原時間（PT）和血漿凝血酶時間（TT）試劑盒均購自于上海江萊生物科技有限公司。水為雙蒸水，其余試劑均為分析純。

1.3 動物

選用健康SD大鼠（雌雄各半），SPF級，8周齡，體質(zhì)量260±20 g，由維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，許可證號：SCXK（京）2016-0006，置于溫度25±2 ℃，濕度45 %～70 %環(huán)境下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，光照 12 h/12 h，每8 h通風(fēng)換氣，自由進食飲水。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取方法的選擇

2.1.1 水煎煮提取法 參照原芪參還五膠囊制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（JZBZ20090553）中的煎煮工藝，取處方比例的三味蟲藥（地龍20 g、全蝎12 g、水蛭20 g），混合后粉碎成細粉（過80目），加8倍量水煎煮1 h，煎煮2次，離心去沉淀后，合并兩次水煎液，分成2等分，一份減壓濃縮后真空干燥，即得水煎煮提取物。

2.1.2 水提醇沉法 參考文獻中方法[6-7]，取“2.1.1”項下另一份水煎液，加入95 %乙醇調(diào)節(jié)含醇量達70 %，冷藏過夜，濾過，棄去沉淀，濾液減壓回收乙醇后濃縮干燥，即得醇沉提取物。

2.1.3 生理鹽水浸提法 參考文獻中方法[8]，取處方比例的三味蟲藥細粉，加10倍量生理鹽水，超聲10 min，冷浸20 min，3500 r/min離心20 min，上清減壓濃縮后真空干燥，即得生理鹽水浸提物。

2.1.4 勻漿法 參考文獻中方法[9-10]，取處方比例的三味蟲藥細粉，加入組織勻漿機內(nèi)，加入10 倍量水，高速勻漿（10 000 r/min）3次，5 min/次，離心，合并3次上清，減壓濃縮后真空干燥，即得勻漿提取物。

2.1.5 胃蛋白酶酶解法 參考文獻中方法[7,11-12]，取處方比例的三味蟲藥細粉，加入人工胃液調(diào)節(jié)pH 2.0，密閉，37 ℃水浴保溫30 min，放冷至室溫，加入生藥量2 %胃蛋白酶，酶解2 h，3500 r/min離心20 min，取上清，減壓濃縮后真空干燥，即得胃蛋白酶酶解提取物。

2.1.6 胰蛋白酶酶解法 參考文獻中方法[7,11,12]，取處方比例的三味蟲藥細粉，加入人工腸液調(diào)節(jié)pH 7.5，密閉，37 ℃水浴保溫30 min，放冷至室溫，加入生藥量2 %胰蛋白酶，酶解2 h，3500 r/min離心20 min，取上清，減壓濃縮后真空干燥，即得胰蛋白酶酶解提取物。

2.1.7 仿生酶解法 參考文獻中方法[7,11-12]，取處方比例的三味蟲藥細粉，加入人工胃液調(diào)節(jié)pH 2.0，密閉，37 ℃水浴保溫30 min，加入生藥量2 %胃蛋白酶，酶解2 h，然后加入人工腸液調(diào)節(jié)pH 7.5，密閉，37 ℃水浴再保溫30 min，加入生藥量2 %胰蛋白酶，繼續(xù)酶解2 h，3500 r/min離心20 min，取上清，減壓濃縮后真空干燥，即得仿生酶解提取物。

2.2 不同提取方法的比較

2.2.1 總蛋白含量比較 參照2020年版《中國藥典》[13]四部附錄0731蛋白質(zhì)含量測定法項下Bradford法測定。

（1）考馬斯亮藍G-250 溶液制備：精密稱取考馬斯亮藍G-250 0.1 g，溶于50 ml乙醇中，再加磷酸100 ml，用水稀釋至1000 ml，混勻，濾過，即得。

（2）標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液制備：以牛血清白蛋白（BSA）加水溶解，制成每l ml含2 mg的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，即得。

（3）供試品溶液制備：精密稱取上述不同提取物粉末0.1 g，用水稀釋定容至10 ml，搖勻，濾過，即得。

（4）標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制和總蛋白含量測定：精密量取上述標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液各0.02，0.04，0.06，0.08，0.10 ml，分別加水稀釋至0.1 ml，配置成濃度分別為0.4，0.8，1.0，1.6， 2.0 mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，再各加入5.0 ml 考馬斯亮藍G-250 溶液，搖勻后倒入比色皿，在紫外-可見分光光度計595 nm 處測定吸光度，以稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液濃度（X）和相應(yīng)吸光度值（Y）進行線性回歸，計算得回歸方程為：Y=7.5042X+0.0961（R=0.9997），表明，總蛋白濃度在0.4～2.0 mg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

（5）方法學(xué)考察：① 精密度試驗：取同一標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，同法連續(xù)測定6次吸光度，計算得吸光度的RSD值為0.78 %，表明，本法精密度良好。② 重復(fù)性試驗：取同一提取物粉末6份，同法制備供試品溶液并測定吸光度，計算得6份提取物樣品吸光度的RSD值為1.13 %，表明，本法重復(fù)性良好。③ 穩(wěn)定性試驗：取同一份供試品溶液，室溫下放置，每15 min測定一次吸光度，共測定6次，計算得吸光度的RSD值為1.49 %，表明，本法穩(wěn)定性良好。④ 加樣回收率實驗：取同一已知含量提取物粉末6份，各精密稱取約10 mg，精密加入BSA 1.0 mg，同法制備供試品溶液并測定吸光度，以回歸方程計算蛋白濃度，得6份提取物樣品的平均加樣回收率為97.54 %，RSD值為1.35 %。

（6）總蛋白含量測定：精密量取不同提取物供試品溶液各0.1 ml，加入5.0 ml 考馬斯亮藍G-250溶液，同法測定吸光度，以回歸方程計算蛋白濃度并換算成百分含量，結(jié)果見表1。

2.2.2 抗凝血活性比較 取SD大鼠90只（雌雄各半），按表1所示隨機分為 9組，每組10只，提取物各組給予不同提取物灌胃給藥[50 mg/（kg·d）-1，溶于10 ml蒸餾水，分早晚2次灌胃]，空白對照組給予等量生理鹽水灌胃，陽性對照組給予阿司匹林灌胃（10 mg/（kg·d）-1，溶于5 ml蒸餾水，頓服），均連續(xù)給藥7 d。術(shù)前12 h禁食不禁水，于末次給藥2 h后，2 %戊巴比妥鈉麻醉后，無菌條件下腹主動脈取血，加入3.8 %枸櫞酸鈉抗凝血（抗凝液與全血比例為1：9），混勻后，3500 r/min離心15 min，分離取血漿。以生理鹽水為空白對照，阿司匹林為陽性對照，采用試劑盒法測定活化部分凝血活酶時間（APTT）、凝血酶原時間（PT）和血漿凝血酶時間（TT），檢測方法參照試劑盒說明書，結(jié)果見表1。

表1 不同提取方法對總蛋白含量和抗凝血活性的影響（±s，n=10）

表1 不同提取方法對總蛋白含量和抗凝血活性的影響（±s，n=10）

注：*P<0.05，△P<0.01 vs 空白對照組

編碼水平APTT PT TT空白對照組 ─ 19.46±3.32 12.07±1.21 14.35±1.30陽性對照組 ─ 44.08±4.57 29.43±3.14 35.12±3.92水煎煮組 11.25 29.35±3.68△22.50±2.53△23.73±2.38△水提醇沉組 12.31 31.46±4.37△24.86±2.42△28.16±2.47△生理鹽水浸提組 9.06 23.58±3.31* 17.43±1.74*20.42±1.86△勻漿組 16.13 36.17±4.06△28.07±2.55△32.08±2.42△胃蛋白酶酶解組 14.28 34.92±3.53△26.39±2.83△30.55±3.34△胰蛋白酶酶解組 12.90 32.05±3.44△23.56±2.06△25.94±3.65△仿生酶解組 18.72 42.83±5.12△30.42±3.45△36.43±4.06△提取方法總蛋白含量/%

由表1可見，仿生酶解提取物中的總蛋白含量最高，其次是勻漿提取物和胃蛋白酶酶解提取物。大鼠體外抗凝血活性實驗結(jié)果表明，與空白對照組比較，各組的APTT、PT和TT均顯著升高（P<0.05或 P<0.01），其中，以仿生酶解提取物的APTT、PT和TT最優(yōu)，與阿司匹林陽性對照的抗凝血活性相當(dāng)，其次為勻漿提取物和胃蛋白酶酶解提取物。

2.2.3 溶栓活性比較[14-15]取 SD大鼠90只（雌雄各半），按表2所示隨機分為 9組，每組10只，給藥方式同“2.2.2”項。術(shù)前12 h禁食不禁水，于末次給藥 2 h后，各組大鼠給予10 %烏拉坦麻醉，將大鼠仰面固定于手術(shù)架上，取腹部正中切口開腹，分離下腔靜脈，于左腎靜脈下方2 mm處以絲線結(jié)扎下腔靜脈，確認大鼠呼吸平穩(wěn)，逐層關(guān)閉腹腔。術(shù)后6 h再次打開腹腔，于結(jié)扎下方1 cm 處夾閉血管，剖開取出血栓，記錄血栓濕重，60 ℃烘干，稱量干重，并計算血栓抑制率。血栓抑制率% =（空白組血栓干重-各給藥組血栓干重）/ 空白組血栓干重×100 %，結(jié)果見表2。

表2 不同提取方法對溶栓活性的影響（±s，n=10）

表2 不同提取方法對溶栓活性的影響（±s，n=10）

注：*P<0.05，△P<0.01 vs 空白對照組

提取方法 血栓濕重/mg 血栓干重/mg 血栓抑制率/%空白對照組 40.15±4.23 19.42±2.26 ─陽性對照組 21.06±2.45△ 10.83±1.75△ 44.23水煎煮組 33.42±3.84△ 16.36±2.14* 15.76水提醇沉組 31.37±3.14△ 15.58±1.95△ 19.77生理鹽水浸提組 36.62±3.71* 17.49±2.26* 9.94勻漿組 24.58±2.89△ 12.85±1.68△ 33.83胃蛋白酶解組 26.61±2.75△ 14.26±1.77△ 26.57胰蛋白酶解組 29.34±3.08△ 14.92±1.56△ 23.17仿生酶解組 22.48±2.66△ 11.27±1.63△ 41.97

由表2可見，與空白對照組比較，各組的血栓濕重和血栓干重均顯著降低（P<0.05 或P<0.01），其中，以仿生酶解提取物的溶栓活性最佳，與阿司匹林陽性對照的溶栓活性相當(dāng)，其次為勻漿提取物和胃蛋白酶酶解提取物。綜合以上結(jié)果得出，仿生酶解提取法可作為芪參還五膠囊中三味蟲類藥材的最佳提取方法。

2.3 仿生酶解法的工藝條件優(yōu)化

2.3.1 正交實驗設(shè)計 仿生酶解法參考人體消化道環(huán)境，將酶解溫度恒定為37 ℃，胃蛋白酶酶解pH值設(shè)定為2.0，胰蛋白酶酶解pH值設(shè)定為7.5，以保持酶的最佳活性。根據(jù)文獻和預(yù)實驗結(jié)果[3,16]，采用正交實驗設(shè)計考察影響提取效果的3個因素，即藥材粉碎粒度、加酶量和酶解時間，并以總蛋白含量（%）、抗凝血活性（s）和血栓抑制率（%）為評價指標(biāo)，優(yōu)化工藝條件。正交實驗因素水平見表3。

表3 正交實驗因素水平表

取處方比例的三味蟲藥細粉9份，按照L9（34）正交表設(shè)計安排實驗，同“2.1.7”項下方法進行仿生酶解提取，測定所得提取物的總蛋白含量、抗凝血活性和血栓抑制率。正交實驗結(jié)果見表4，方差分析結(jié)果見表5。

表4 正交實驗結(jié)果表

表5 方差分析結(jié)果表

由以上結(jié)果可見，各因素對仿生酶解法提取效果的影響順序為：B>C>A，其中，加酶量和酶解時間對提取效果有顯著性影響（P<0.05），藥材粉碎粒度對提取效果無顯著性影響（P>0.05）。正交實驗結(jié)果提示A2B3C2為最佳提取工藝，綜合評分結(jié)果以A2B3C2得分最高（99.55分），考慮到A因素對提取效果無顯著性影響，為降低生產(chǎn)成本，提高生產(chǎn)效率，綜合得出最佳仿生酶解工藝條件為A2B3C2，即藥材粉碎粒度為80目，加酶量為2 %生藥量，胃蛋白酶和胰蛋白酶各自酶解時間為2 h。

2.3.2 驗證實驗 按照所得最佳仿生酶解工藝條件進行3次平行工藝驗證，結(jié)果見表6?？梢?，3次平行實驗的總蛋白含量、抗凝血活性和血栓抑制率結(jié)果均較為穩(wěn)定，RSD值均小于1 %，提示本實驗優(yōu)選的最佳仿生酶解工藝條件穩(wěn)定可行。

表6 驗證實驗結(jié)果

討論

中藥中蟲類藥材的傳統(tǒng)提取方法通常為原蟲提、醇提或原粉直接入藥等，因蟲類藥材自身含較多的大分子蛋白等活性物質(zhì)，使得傳統(tǒng)提取方對蟲類藥材的利用率較低，活性物質(zhì)未得到充分用。研究發(fā)現(xiàn)，酶解法能將動物藥中的蛋白成分解成小分子肽類物質(zhì)，更利于人體吸收，同時，解后的小分子肽類成分作用位點增多，藥物的藥更強。如水蛭中的蛋白質(zhì)經(jīng)酶解后可得到小分子的水蛭肽成分，有較好的抗凝血作用[17]。地龍中的主要成分蛋白，經(jīng)酶解成小分子多肽才能被人體吸收并發(fā)揮藥效[18-19]。全蝎中的大分子蛋白質(zhì)能經(jīng)酶解分離純化出多種具有藥理活性的多肽類成分，如鎮(zhèn)痛多肽、抗血栓多肽、抗腫瘤多肽等，更易被人體吸收[20-21]。本研究采用仿生酶解法，模擬藥物在胃、腸液中的消化過程，對芪參還五膠囊中地龍、全蝎、水蛭三味蟲類藥材的提取工藝進行優(yōu)化，將藥物中的有效成分水解成易于吸收的小分子物質(zhì)，在保證藥效的同時，進一步提升藥品質(zhì)量，縮小給藥劑量。

本研究將仿生酶解法與水煎煮、醇提、勻漿等傳統(tǒng)提取工藝進行了比較，通過體外抗凝血實驗、溶栓活性指標(biāo)和總蛋白含量測定，篩選得出仿生酶解法可作為處方中三味蟲類藥材較理想的提取方法，并通過正交實驗考察了藥材粉碎粒度、加酶量和酶解時間3個因素不同水平對提取效果的影響，優(yōu)選出本法的最佳酶解工藝條件，該方法能夠最大限度地利用藥材中的活性物質(zhì)，所獲得的酶解提取物具有較強的抗凝血、溶栓活性。研究選擇了體外抗凝血實驗，測定大鼠血漿體外活化部分凝血活酶時間、凝血酶原時間和血漿凝血酶時間[22]；同時，測定體內(nèi)溶栓活性，考察了血栓抑制率[14]，兩個試驗從體外、體內(nèi)兩個維度分別對不同提取產(chǎn)物進行了藥效學(xué)考察。由結(jié)果可見，基本能有效地反映不同提取產(chǎn)物的藥效學(xué)效果。

4 結(jié)論

本研究篩選出的仿生酶解法工藝條件穩(wěn)定可行，所得酶解提取物抗凝血、溶栓效用較佳，本法可作為芪參還五膠囊中三味蟲類藥材的提取方法，也為蟲類藥材的制備工藝優(yōu)化和藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供了新的研究思路。