E6/E7 mRNA檢測(cè)篩查妊娠期高危型人乳頭瘤病毒感染的價(jià)值研究

楊詠梅，王鳳英*，廖秦平，肖群，康寧，吳潔

宮頸癌的發(fā)生與高危型人乳頭瘤病毒（HR-HPV）的持續(xù)感染密切相關(guān)［1］。病毒與宿主DNA整合實(shí)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄被認(rèn)為是宮頸病變惡性進(jìn)展的一個(gè)重要標(biāo)志［2-3］。針對(duì)HR-HPV DNA的檢測(cè)方法靈敏度高，但特異度低，陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果無(wú)法準(zhǔn)確判斷是否伴有宮頸組織學(xué)高級(jí)別病變，反而易造成過(guò)度治療導(dǎo)致醫(yī)療資源浪費(fèi)［4］。妊娠期宮頸病變的診治要同時(shí)考慮對(duì)孕婦和胎兒的影響，因此更應(yīng)審慎。但HR-HPV感染，如不能明確有無(wú)宮頸病變，一方面易給孕婦造成不必要的精神負(fù)擔(dān)，另一方面也易造成宮頸癌的漏診。在非妊娠期女性中，應(yīng)用E6/E7 mRNA檢測(cè)宮頸癌較DNA檢測(cè)具有同樣的臨床靈敏度及陰性預(yù)測(cè)值，同時(shí)特異度較高，可降低陽(yáng)性預(yù)測(cè)值的假陽(yáng)性率［5-6］。但是E6/E7 mRNA檢測(cè)是否可以用于妊娠期HPV感染的診斷與管理，尚無(wú)有效的試驗(yàn)支持。本研究將妊娠期HR-HPV感染E6/E7 mRNA載量檢測(cè)與HR-HPV DNA檢測(cè)進(jìn)行對(duì)照比較，以宮頸活檢病理結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，探討將E6/E7 mRNA檢測(cè)應(yīng)用于妊娠期HR-HPV感染及宮頸病變?cè)\斷與分流管理，提高診斷效能，從而減少妊娠期非必要的有創(chuàng)檢查。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年1月至2019年1月在首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院婦產(chǎn)科建檔定期產(chǎn)檢的20～45歲育齡妊娠期女性為研究對(duì)象，均為單胎妊娠，既往體健，無(wú)內(nèi)外科合并癥及免疫抑制性疾病，未服用任何免疫抑制性藥物，均簽署知情同意書(shū)。

納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）2次以上薄層液基細(xì)胞學(xué)檢查（TCT）結(jié)果為不典型鱗狀上皮細(xì)胞（ASCUS）伴HR-HPV DNA檢測(cè)陽(yáng)性；（2）TCT結(jié)果顯示病變程度在ASCUS以上伴/不伴HR-HPV DNA檢測(cè)陽(yáng)性；（3）HR-HPV DNA檢測(cè)結(jié)果為HPV 16、18亞型。

排除標(biāo)準(zhǔn)：拒絕簽署知情同意書(shū)；拒絕行陰道鏡檢查及宮頸活檢。

1.2 樣本采集與處理 研究對(duì)象進(jìn)行TCT及HR-HPV DNA檢測(cè)，結(jié)果異常者進(jìn)一步行陰道鏡檢查并取活組織送病理檢查，同時(shí)留取宮頸脫落細(xì)胞，檢測(cè)HR-HPV E6/E7 mRNA 片段。

1.2.1 TCT樣本的采集與處理 研究對(duì)象取膀胱截石位，圍繞宮頸順時(shí)針?lè)较蛐D(zhuǎn)5～7周，采集宮頸外口及宮頸管的脫落細(xì)胞。病理科制片后由2名細(xì)胞病理專(zhuān)家在不知道HR-HPV DNA檢測(cè)結(jié)果的情況下閱片進(jìn)行診斷，按2001國(guó)際癌癥協(xié)會(huì)（NCI）推薦的The Bethesda System（TBS）方式進(jìn)行報(bào)告。如診斷存疑，請(qǐng)第3位上級(jí)專(zhuān)家協(xié)助，共同做出診斷。本研究將2次檢測(cè)為ASCUS、ASCUS以上和各級(jí)腺細(xì)胞異常記為T(mén)CT結(jié)果異常。

1.2.2 HR-HPV DNA樣本采集方法及處理 應(yīng)用快速導(dǎo)流雜交基因芯片技術(shù)結(jié)合低密度基因芯片技術(shù)（HPV GenoArray Test kit，Hybribio Ltd. Hong Kong）對(duì)標(biāo)本進(jìn)行HR-HPV DNA分型檢測(cè)，鑒別21種HPV基因亞型，包括15種高危型亞型：HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68 以 及 6 種低危型（6、11、42、43、44和 CP8304）。

1.2.3 陰道鏡樣本采集與處理 對(duì)于TCT結(jié)果異?；騂R-HPV DNA檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性的妊娠期研究對(duì)象，如存在以下情況：液基細(xì)胞學(xué)TBS報(bào)告中提示2次結(jié)果為ASCUS伴HR-HPV DNA檢測(cè)陽(yáng)性；或病理結(jié)果顯示病變程度在ASCUS以上伴或不伴HR-HPV DNA檢測(cè)陽(yáng)性；或HPV 16、18亞型感染，采用德國(guó)LEISEGANG公司的光學(xué)電子數(shù)碼陰道鏡，由2名經(jīng)過(guò)專(zhuān)業(yè)培訓(xùn)經(jīng)驗(yàn)豐富的婦科醫(yī)師進(jìn)行操作及檢查。病理結(jié)果解讀：在不知道HR-HPV DNA檢測(cè)結(jié)果及TCT結(jié)果的情況下，由2名病理學(xué)專(zhuān)家共同閱片確定最后病理結(jié)果。病理檢查結(jié)果分為正?；蜓装Y、宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）Ⅰ級(jí)、CINⅡ級(jí)、CINⅢ級(jí)、宮頸浸潤(rùn)癌。將CINⅠ級(jí)及正常或炎癥定義為宮頸低級(jí)別病變及正常，將CINⅡ級(jí)、CINⅢ級(jí)定義為宮頸高級(jí)別病變。

1.2.4 HR-HPV E6/E7 mRNA 樣本采集方法及處理留取行陰道鏡檢查的妊娠期女性宮頸脫落細(xì)胞，檢測(cè)HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68等13種高危亞型的HR-HPV E6/E7 mRNA片段。本研究以HR-HPV E6/E7 mRNA 拷貝數(shù)≥1 copy/ml為陽(yáng)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料以相對(duì)數(shù)表示，比較采用Pearson χ2檢驗(yàn)、McNemar配對(duì)χ2檢驗(yàn)。靈敏度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值采用傳統(tǒng)列聯(lián)表計(jì)算。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人口學(xué)特征 本研究共調(diào)查20～45歲健康單胎妊娠女性1 058名，其中孕早期322名、孕中期374名、孕晚期362名，平均年齡（29.8±3.3）歲。1 058名妊娠期女性中，TCT結(jié)果異常和/或HPV 16、18亞型者118名，同意行陰道鏡檢測(cè)并成功獲得病理檢查結(jié)果者84名。病理檢查結(jié)果顯示正?；蜓装Y21例、CINⅠ級(jí)34例、CINⅡ級(jí)18例、CINⅢ級(jí)11例。

2.2 HR-HPV DNA、HR-HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)與病理檢查結(jié)果比較 在病理檢查結(jié)果為CINⅠ級(jí)及正?；蜓装Y的女性中，HR-HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)陽(yáng)性率均低于HR-HPV DNA檢測(cè)陽(yáng)性率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；在病理檢查結(jié)果為CINⅡ級(jí)及CINⅢ級(jí)的女性中，HR-HPV DNA、HR-HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)陽(yáng)性率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表1。

表1 84名行病理檢查的妊娠期女性HR-HPV DNA、HR-HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)陽(yáng)性率比較〔n（%）〕Table 1 Comparison of HR-HPV DNA testing，HR-HPV E6/E7 mRNA detection and pathological examination results in 84 pregnant women

2.3 HR-HPV DNA、HR-HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)預(yù)測(cè)宮頸高級(jí)別病變的效能 McNemar配對(duì)χ2檢驗(yàn)結(jié)果顯示：HR-HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)預(yù)測(cè)宮頸高級(jí)別病變的靈敏度低于HR-HPV DNA檢測(cè)，特異度高于HR-HPV DNA檢測(cè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；Pearsonχ2檢驗(yàn)結(jié)果顯示：HR-HPV DNA、HR-HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)預(yù)測(cè)宮頸高級(jí)別病變的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表2～3。

表2 HR-HPV DNA、HR-HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)預(yù)測(cè)宮頸低級(jí)別病變及正常、高級(jí)別病變情況〔n（%）〕Table 2 Comparison of HR-HPV DNA testing，and HR-HPV E6/E7 mRNA detection in predicting low- and high-grade cervical lesions

表3 HR-HPV DNA、HR-HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)預(yù)測(cè)宮頸高級(jí)別病變的效能Table 3 Comparison of diagnostic efficacy of HR-HPV DNA testing and HR-HPV E6/E7 mRNA detection for high-grade cervical lesions

3 討論

2019 年美國(guó)陰道鏡和宮頸病理學(xué)會(huì)（ASCCP）宮頸癌篩查結(jié)果異常和癌前病變的管理共識(shí)提出基于HPV篩查、結(jié)合患者風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的精確管理模式，使診斷、治療和隨訪(fǎng)的建議更加個(gè)性化［7］。

關(guān)于妊娠期合并CIN的發(fā)生率國(guó)內(nèi)外報(bào)道并不一致（0.08%～5.00%）［8-9］。吳霞等［10］報(bào)道北京地區(qū)妊娠期宮頸上皮細(xì)胞異常發(fā)生率為3.95%，與非妊娠期3.22%的發(fā)生率相近。妊娠期由于宮頸柱狀上皮異位，局部組織被柱狀上皮覆蓋，組織菲薄，毛細(xì)血管豐富，在陰道鏡檢查中易引起出血，嚴(yán)重狀態(tài)下需宮頸局部縫扎止血，增加宮頸損傷。此外妊娠期女性常對(duì)陰道操作存在抵觸情緒，不愿進(jìn)行檢查，造成宮頸病變尤其是惡性宮頸病變的漏診，最終影響母嬰安全。最新研究提示，妊娠期HPV感染可經(jīng)由母體通過(guò)陰道傳播至子代，造成子代罹患肺癌的風(fēng)險(xiǎn)增加［11］。但由于目前HR-HPV DNA檢測(cè)的特異度尚不能令人滿(mǎn)意，單純HPV檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性反而給妊娠期女性造成一定的心理和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，誘發(fā)圍生期孕婦精神狀態(tài)異常，間接影響妊娠期母嬰安全?；谌焉锲趯m頸病變的特點(diǎn)，診療過(guò)程中既要避免過(guò)度診療，同時(shí)亦不能遺漏宮頸浸潤(rùn)癌的診斷。因而目前迫切需要一種具有良好的診斷效能，既能有效地診斷出宮頸高級(jí)別病變，又能使漏診率降到最低的檢測(cè)手段。

國(guó)外很多學(xué)者對(duì)HR-HPV檢測(cè)陽(yáng)性人群的分流方法進(jìn)行了大量相關(guān)試驗(yàn)，其中包括宮頸TCT、分型檢測(cè)HPV 16、18亞型，分型檢測(cè)HPV 16、18、31、33、45亞型高危病毒以及進(jìn)行p16或Ki67免疫組化等多種方法［12］。

機(jī)體宮頸組織發(fā)生HR-HPV持續(xù)感染后，在一定條件下，通過(guò)E6/E7癌基因轉(zhuǎn)錄形成E6/E7 mRNA，最后翻譯成E6/E7癌蛋白，作用于宿主細(xì)胞，最終發(fā)揮致癌作用。由此可見(jiàn)，E6/E7 mRNA的轉(zhuǎn)錄表達(dá)是宮頸惡性病變發(fā)生、發(fā)展的必由之路，也是HPV病毒致癌活性的一個(gè)標(biāo)志，因而可以通過(guò)對(duì)其復(fù)制轉(zhuǎn)錄檢測(cè)，達(dá)到預(yù)測(cè)病變進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)的目的。

國(guó)外研究顯示，非妊娠期HR-HPV DNA檢測(cè)對(duì)診斷CINⅡ級(jí)及以上病變的靈敏度優(yōu)于HR-HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)，為70%～100%，而HR-HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)的靈敏度一般在60%～90%，但HR-HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)在特異度上要高于HR-HPV DNA檢測(cè)［13-14］，尤其對(duì)于預(yù)測(cè)宮頸病變進(jìn)展方面優(yōu)于HR-HPV DNA檢測(cè)［15-16］，因而考慮可將其應(yīng)用于HR-HPV檢測(cè)陽(yáng)性人群的分流。但目前將HR-HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)應(yīng)用于妊娠期宮頸病變?cè)\斷的研究相對(duì)較少。故而本研究將其應(yīng)用于妊娠期宮頸高級(jí)別病變的診斷，以期為妊娠期宮頸病變，尤其HPV陽(yáng)性人群的診斷分流提供相關(guān)思路。

由于CINⅡ級(jí)及以上病變進(jìn)展為宮頸浸潤(rùn)癌的發(fā)生率極大增加，因而本研究將宮頸高級(jí)別病變作為重點(diǎn)觀察指標(biāo)，評(píng)價(jià)HR-HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)對(duì)于CINⅡ級(jí)及以上宮頸病變的診斷效能。在CINⅠ級(jí)及正?；蜓装Y結(jié)果中，HR-HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)的陽(yáng)性率低于HR-HPV DNA檢測(cè)，而在CINⅡ級(jí)及CINⅢ級(jí)檢測(cè)結(jié)果中，兩者陽(yáng)性率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；考慮造成HR-HPV E6/E7 mRNA 檢測(cè)在早期宮頸病變中陽(yáng)性率低的原因?yàn)椴《咎幱谙鄬?duì)靜默期，由于絕大部分CINⅠ級(jí)可自行消退，因而很可能僅停留在HPV感染整合期，而未進(jìn)展到 E6/E7癌基因大量轉(zhuǎn)錄復(fù)制的地步，因而其陽(yáng)性檢測(cè)率較低。將HR-HPV E6/E7 mRNA 檢測(cè)對(duì)宮頸高級(jí)別病變的檢測(cè)靈敏度與特異度和HR-HPV DNA檢測(cè)比較，發(fā)現(xiàn)HR-HPV E6/E7 mRNA 檢測(cè)的特異度較高，而靈敏度較低。

綜上所述，HR-HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)可以在一定程度上提高CINⅡ級(jí)及以上宮頸高級(jí)別病變的診斷特異度，但存在靈敏度稍低的可能。因而考慮是否將HR-HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)應(yīng)用在TCT結(jié)果為正常或ASCUS及低度鱗狀上皮內(nèi)病變（LSIL），而HR-HPV DNA檢測(cè)陽(yáng)性（尤其HPV 16、18亞型）結(jié)果的基礎(chǔ)之上，作為風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的一部分，進(jìn)行陰道鏡檢查的分流指導(dǎo)，避免妊娠期非必要有創(chuàng)檢查，做到更為精準(zhǔn)的個(gè)體化診療。

作者貢獻(xiàn)：王鳳英、廖秦平負(fù)責(zé)文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)，研究的實(shí)施與可行性分析；楊詠梅、肖群、康寧、吳潔負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)收集；楊詠梅負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)整理、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理、結(jié)果分析與解釋、撰寫(xiě)論文；楊詠梅、王鳳英負(fù)責(zé)論文修訂；王鳳英對(duì)文章整體負(fù)責(zé)，監(jiān)督管理。

本文無(wú)利益沖突。

本研究局限性：

妊娠期是女性極為特殊的生理時(shí)期，此時(shí)期的相關(guān)檢查尤其有創(chuàng)檢查需考慮母嬰兩方面，盡量保證雙方安全最大化，因而所采取的診斷方法需慎之又慎。因客觀條件所限，本研究薄層液基細(xì)胞學(xué)檢查（TCT）結(jié)果異常和/或高危型人乳頭瘤病毒（HR-HPV）檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性標(biāo)本例數(shù)較少，故而所得結(jié)論尚需進(jìn)一步隨機(jī)大樣本試驗(yàn)支持，同時(shí)研究時(shí)限較短，未能監(jiān)測(cè)陽(yáng)性病例遠(yuǎn)期宮頸惡性腫瘤發(fā)生情況及子代HR-HPV相關(guān)性疾病發(fā)生情況。未來(lái)研究需擴(kuò)大樣本量，以論證本研究所得結(jié)果。