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    妊娠期糖尿病對胎鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞的影響*

    2021-11-03 13:19:40李金艷楊根嶺錢冠華
    重慶醫(yī)學 2021年19期
    關鍵詞:胎鼠表面活性原代

    李金艷,楊根嶺,錢冠華

    (1.重慶市中醫(yī)院產科 400021;2.重慶醫(yī)科大學動物實驗中心 400016;3.重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院婦產科 400010)

    胚胎肺發(fā)育于前腸腹側內胚層周圍被間充質細胞包圍,在發(fā)育過程中腹側變成肺上皮細胞,而間充質細胞則變?yōu)榉螌嵸|。胎肺發(fā)育經歷3個時期:腺狀期、小管期和原始肺泡形成期[1]。宮內環(huán)境影響著胎肺發(fā)育并引起肺組織形態(tài)學改變[2]。肺組織中肺泡Ⅱ型上皮細胞 (alveolar epithelial type Ⅱ cells,AECⅡ)有極其重要的作用。肺泡表面活性物質相關蛋白 (surfactant-associated protein,SP),包括SP-A、SP-B、SP-C和SP-D。其中SP-A最為豐富,其表達水平的減少與哺乳動物的肺疾病密切相關。

    干擾胎兒肺發(fā)育的主要因素是妊娠期糖尿病(GDM)和早產[3]。GDM時,胎肺的發(fā)育受到影響,肺成熟延遲,肺泡表面積減少,肺泡表面活性物質減少,肺泡血管通透性增加。GDM母親分娩的新生兒容易出現(xiàn)巨大兒、低血糖、先天畸形、高膽紅素血癥、新生兒呼吸窘迫綜合征,疾病的發(fā)病率和病死率更高[4]。而目前GDM對胎肺發(fā)育的影響尚不清楚。本實驗旨在研究GDM對胎鼠AECⅡ細胞的影響及意義。

    1 材料與方法

    1.1 動物

    清潔級SD雌鼠30只、SD雄鼠10只,體重約250~350 g,約2月齡,于重慶醫(yī)科大學實驗動物中心無特定病原體(SPF)級環(huán)境中飼養(yǎng),適應性喂養(yǎng)1周。實驗涉及的操作方案均通過重慶醫(yī)科大學倫理委員會批準。

    1.2 主要試劑

    鏈脲佐菌素、油紅O粉劑、Ⅰ型膠原酶購自美國Sigma公司;安穩(wěn)免調血糖儀由三諾生物傳感公司生產;兔抗SP-C多克隆抗體、兔抗SP-A多克隆抗體、異硫氰酸熒光素(FITC)標記的羊抗兔IgG、辣根過氧化物酶(HRP)標記羊抗兔IgG、4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)購自美國Santa Cruz公司;即用型SABC免疫組織化學染色試劑盒、DAB顯色劑、0.25%胰蛋白酶溶液 (不含EDTA)、DMEM/F12 1∶1液體培養(yǎng)基(常規(guī)) 、DMEM/F12 1∶1液體培養(yǎng)基 (含胎牛血清、青霉素、鏈霉素)、D-Hanks緩沖液 (不含酚紅、不含鈣鎂) 購自武漢博士德公司;DnaseⅠ酶、大鼠IgG購自北京索萊寶科技有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1動物分組與處理

    將發(fā)情的SD雌鼠雌雄3∶1比例合籠,次日8:00取雌鼠陰道分泌物,顯微鏡下發(fā)現(xiàn)精子者記為妊娠第1天 (D1) 。將孕鼠分為對照組和GDM組,每組10只孕鼠。GDM組孕鼠給予1%鏈脲佐菌 (Streptozotozin,STZ) 新鮮溶液 (0.1 mol/L、pH 4.4檸檬酸緩沖液現(xiàn)配) 按40 mg/kg行腹腔注射。給藥72 h后測定尾靜脈血血糖值,血糖值大于15.0 mmol/L表明建模成功。對照組孕鼠腹腔注射等量檸檬酸緩沖液。每2天檢測SD大鼠血糖及體重變化情況。孕20.5 d后剖宮產。

    1.3.2孕鼠和胎鼠血葡萄糖的測定

    采集孕鼠眼眶靜脈血,抗凝、離心后取血漿,使用葡萄糖測定試劑盒,采用葡萄糖氧化酶法測定。胎鼠取腹主靜脈血,測定方法同孕鼠。

    1.3.3胎鼠AECⅡ的分離純化及原代培養(yǎng)

    SD孕鼠行剖宮產術,取出胎鼠肺組織,D-Hanks液洗滌后,將胎肺組織剪至細末,再次洗滌。加入消化液(0.25%胰蛋白酶+0.1%Ⅰ型膠原酶溶液+0.04 g/L DnaseⅠ酶溶液) ,37 ℃消化,不銹鋼網(wǎng)篩過濾,收集細胞,用含10%胎牛血清的培養(yǎng)基重懸后,離心,棄上清液,加入0.1%Ⅰ型膠原酶溶液和0.04 g/L DnaseⅠ酶溶液,37 ℃再次消化,然后接種在大鼠IgG包被的培養(yǎng)皿中貼壁(第一次貼壁)。未貼壁的細胞接種于6孔培養(yǎng)板,于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),48 h后換液,將貼附于培養(yǎng)皿或6孔培養(yǎng)板生長的細胞(第二次貼壁)采用免疫熒光染色方法進行鑒定。

    1.3.4臺盼藍染色

    取接種的AECⅡ細胞懸液100 μL,加入培養(yǎng)基稀釋至400 μL,再加入100 μL的0.4%臺盼藍溶液,用血球計數(shù)儀計數(shù)400個細胞,拒染的為活細胞,藍染的細胞為死細胞,計數(shù)活細胞所占百分比。

    1.3.5透射電鏡鑒定

    分別收集培養(yǎng)皿或6孔培養(yǎng)板的AECⅡ細胞,加入2.5%戊二醛固定液,沉淀2 h,用梯度乙醇脫水,用純丙酮加包埋液(1∶2) 包埋,37 ℃烘箱內固化,切片機切片 (50~60 nm),用3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色。HITACHI-600透射電鏡觀察細胞結構。

    1.3.6蘇木素-伊紅(HE)染色

    將胎鼠肺組織切片置烤箱烤至溶蠟,切片于二甲苯脫蠟;先后浸泡在100%、95%、70%梯度乙醇中;蘇木精染色,置于0.5%鹽酸乙醇數(shù)秒后取出,伊紅染色,依次在100%、95%梯度乙醇中脫水,吸干乙醇,二甲苯透明,室溫過夜,中性樹脂封片。

    1.3.7油紅O染色

    胎鼠肺組織冰凍切片(10 μm),10%多聚甲醛室溫固定30 min,60%異丙醇浸洗2 min;油紅O工作液染色15 min,60%異丙醇調色,蘇木素復染,鹽酸乙醇分化,中性樹脂封片。

    1.3.8免疫熒光技術檢測

    第1次貼壁和第2次貼壁細胞爬片后用4%多聚甲醛固定,并固定于載玻片上。加入含0.5% TritonX-100的0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液洗滌,加入一抗SP-C(1∶50稀釋) ,4 ℃孵育過夜。洗滌后加入FITC標記的羊抗兔IgG(1∶100稀釋),避光37 ℃下孵育30 min。洗滌后加入DAPI染色細胞核(1∶50稀釋),避光室溫下孵育30 min。洗滌后在熒光顯微鏡下觀察。

    1.3.9免疫細胞化學檢測

    細胞爬后片用4%多聚甲醛固定,并固定于載玻片上。加入0.5% TritonX-100,0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液洗滌,加入一抗SP-A (1∶50稀釋),4 ℃過夜。洗滌后加入辣可忍受過氧化物酶(HRP)標記羊抗兔IgG(1∶100稀釋),37 ℃下孵育30 min。DAB顯色后,經復染、分化、脫水、封片后在顯微鏡下觀察。

    1.4 統(tǒng)計學處理

    2 結 果

    2.1 動物模型建立成功

    對照組、GDM組、GDM組胎鼠、GDM組胎鼠血糖分別為(4.68±0.45)、(21.68±3.51)、(4.26±0.51)、(17.49±2.63)mmol/L,GDM組及GDM組胎鼠血糖較相應的對照組顯著升高(P=0.001),妊娠期尿病大鼠模型成功建立。

    2.2 原代培養(yǎng)胎鼠AECⅡ及鑒定

    2.2.1原代培養(yǎng)的胎鼠AECⅡ形態(tài)及純度檢測

    AECⅡ形態(tài)為多邊形或立方形,細胞質內有較多粗大黑色顆粒,細胞核大,部分細胞核為雙核。細胞開始生長呈島狀分布,后細胞融合為片狀生長 (圖1A) 。每6只20.5 d胎齡的胎鼠肺組織可獲得 (15±3)×106個AECⅡ細胞。通過臺盼藍染色方法檢測到接種細胞活力為(95±3)%,細胞的純度為(98±2)%。透射電鏡觀察原代培養(yǎng)的AECⅡ細胞,細胞質內見到同心圓狀、多層的板層小體,板層小體為黑色,在細胞膜上可見較多微絨毛(圖1B)。

    A:AECⅡ細胞普通光鏡下形態(tài)(×400);B:AECⅡ細胞透射電鏡下形態(tài)(×8 000)。

    2.2.2免疫熒光檢測SP-C在原代培養(yǎng)的AECⅡ中的表達

    因SP-C蛋白在AECⅡ細胞中為特異性表達,當細胞表達SP-C時,可確定該細胞即為AECⅡ。第1次貼壁細胞未見綠色的熒光(圖2A),細胞核見藍色熒光 (圖2B),圖像合并后未見表達綠色熒光的細胞 (圖2C)。第2次貼壁細胞細胞質中見綠色的熒光 (圖2D),細胞核見藍色熒光 (圖2E),圖像合并后見表達綠色熒光的細胞占全部細胞的98% (圖2F),可見SP-C在該細胞有表達,細胞為AECⅡ細胞。

    A~C:為第1次貼壁細胞;D~F:為第2次貼壁細胞。

    2.3 對照組和GDM組胎鼠AECⅡ細胞改變

    2.3.1透射電鏡觀察胎鼠AECⅡ細胞形態(tài)改變

    透射電鏡下可見從對照組胎鼠肺原代培養(yǎng)的AECⅡ表面有豐富微絨毛,細胞內有較多板層小體,而GDM組胎鼠肺原代培養(yǎng)的AECⅡ表面微絨毛減少,細胞內板層小體明顯減少,見圖3。

    A: 對照組(×10 000);B:GDM組(×5 000)。

    2.3.2AECⅡ和AECⅠ細胞數(shù)量變化

    油鏡下見AECⅠ細胞是扁平細胞,其細胞核向表面邊緣突起并隔膜。AECⅡ細胞由立方體細胞組成,細胞核大,有血管。GDM組胎鼠肺組織中AECⅡ和AECⅠ細胞數(shù)量較對照組胎鼠肺組織降低。AECⅡ和AECⅠ細胞數(shù)量的比例在對照組胎鼠肺組織和GDM組胎鼠肺組織均約為2∶1,見圖4。

    A: 對照組胎鼠;B: GDM組胎鼠;C:AECⅡ和AECⅠ數(shù)量;a:與對照組比較。

    2.3.3AECⅡ細胞中脂滴變化

    油紅O染色AECⅡ細胞,對照組胎鼠肺組織原代培養(yǎng)的AECⅡ細胞中見大量紅色脂滴,部分為團狀堆積;而從GDM組胎鼠肺組織原代培養(yǎng)的AECⅡ細胞中脂滴明顯減少,見圖5。

    A:對照組胎鼠;B:GDM組胎鼠;C:AECⅡ脂滴吸光度(A);a:P<0.05,與對照組胎鼠比較。

    2.3.4SP-A在AECⅡ中的表達

    對照組胎鼠肺組織原代培養(yǎng)的AECⅡ中SP-A表達于細胞質,呈棕黃色,表達水平為0.85±0.11,GDM組胎鼠肺組織原代培養(yǎng)的AECⅡ中SP-A表達于細胞質,著色較淺,表達水平為0.37±0.05(圖6),對照組胎鼠高于GDM組胎鼠,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。

    3 討 論

    本研究改進了AECⅡ細胞的原代培養(yǎng)方法,采用了兩步消化法消化細胞:第1次消化時,采用胰蛋白酶、Ⅰ型膠原酶、DnaseⅠ酶對胎肺組織進行消化[5-6]。第2次消化時,僅僅采用Ⅰ型膠原酶和DnaseⅠ酶對已收集到的細胞進行再次消化[7]。該方法減少了對細胞損傷的同時又提高了細胞的產量。純化過程中,采用IgG免疫黏附純化法的同時,對細胞進行反復貼壁,得到了高產量、高純度的AECⅡ細胞[8-9]。

    AECⅡ是成人干細胞,在慢性炎癥情況下,AECⅡ能分化成AECⅠ[10]。GDM胎鼠肺組織中AECⅠ細胞和AECⅡ細胞的總數(shù)明顯下降,而兩者之間的比例未發(fā)生改變[11]。其原因是高血糖可導致大量的ROS產生,使胚胎和胎兒中大量的細胞受損[12-13],使肺泡間質組織和 (或) 肺泡組織增殖和凋亡出現(xiàn)異常[14],增加肺泡成纖維細胞的增殖,減少成纖維細胞凋亡,促進肺纖維化,同時限制AECⅠ和AECⅡ發(fā)育。研究表明高血糖只會增加肺泡間質細胞的存活率,細胞分化處于紊亂狀態(tài),大多數(shù)細胞處于分化狀態(tài),不成熟細胞不能形成典型的結構,例如已分化肺泡的囊狀結構[15]。

    AECⅡ細胞最重要的功能是產生和分泌肺泡表面活性物質。肺泡表面活性物質是復雜的脂類蛋白混合物,其中甘油磷脂約占80%,膽固醇約占10%,蛋白約占10%[16]。肺泡活性物質主要儲存在板層小體內。從GDM組胎鼠肺組織中提取的AECⅡ細胞,可見板層小體體積變小、數(shù)量減少,細胞表面微絨毛減少、消失,該結果表明GDM時胎肺的發(fā)育出現(xiàn)了延遲,其原因可能是肺糖原磷酸化酶A活性在異常增高的血糖環(huán)境中受到抑制,進一步阻礙了糖原的降解,胎肺不能利用糖原,最終導致肺泡表面活性物質生產減少。另一方面,肺泡表面活性物質中磷脂主要是由脂質轉化而來,油紅O染色顯示GDM組胎鼠肺組織AECⅡ中脂滴明顯減少,這表明妊娠期糖尿病能抑制脂質的合成,進而影響肺泡表面活性物質的產生。免疫細胞化學顯示GDM組胎鼠肺組織AECⅡ中SP-A表達明顯低于對照組。表明GDM組胎鼠肺組織AECⅡ因高血糖導致其功能受到抑制,肺泡表面活性物質生成明顯減少,從而進一步導致肺泡表面張力增加,使肺泡不能充分擴張,影響新生兒肺氣體交換功能和肺功能,導致GDM孕婦分娩的新生兒容易出現(xiàn)呼吸窘迫癥。

    此研究提示在妊娠期將GDM患者的血糖控制在正常水平能減少新生兒呼吸窘迫癥的發(fā)生,所以在臨床工作中需要全面嚴格開展GDM的篩查工作及GDM的臨床治療指導工作。對孕早期空腹血糖大于或等于6.1 mmol/L的孕婦,因按照GDM進行管理和治療。對確診GDM的患者需要進行規(guī)范化的治療,包括控制體重、糖尿病飲食、進行連續(xù)低強度的運動及使用胰島素將血糖控制在合理范圍,同時在整個孕期加強對胎兒的監(jiān)測[17]。血糖控制滿意且不需要胰島素治療的GDM孕婦,可嚴密監(jiān)測血糖至預產期,未自然臨產者可積極終止妊娠。妊娠期間需要使用胰島素治療并血糖控制滿意的GDM孕婦,建議在妊娠38~39周終止妊娠。血糖控制不滿意的GDM孕婦,結合其他高危因素,適時終止妊娠,同時在分娩前可積極采取措施提早預防新生兒呼吸窘迫綜合征的發(fā)生。在分娩時應密切監(jiān)測胎心的變化情況;在分娩后密切觀察新生兒生命體征并注意是否出現(xiàn)進行性呼吸困難加重。當臨床上一旦確診為新生兒呼吸窘迫綜合征應聯(lián)合機械通氣與肺泡表面活性物質治療,從而減少新生兒并發(fā)癥的發(fā)生[18]。

    本研究在細胞水平發(fā)現(xiàn),GDM胎鼠肺組織AECⅡ形態(tài)發(fā)生改變、功能受到抑制。肺泡表面活性物質生成明顯減少是GDM母親分娩的新生兒容易發(fā)生呼吸窘迫綜合征的重要原因,為臨床工作需要加強對GDM的篩查及規(guī)范化治療和管理,以降低新生兒呼吸窘迫綜合征的發(fā)生率提供了理論依據(jù)。

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