細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)平臺(tái)的管理經(jīng)驗(yàn)探討

馬 芳 ，錢(qián) 成 ，肖風(fēng)麗 ，2*

（1.安徽醫(yī)科大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心，安徽 合肥 230032；2.安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚研究所和皮膚科，安徽 合肥 230032）

細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是現(xiàn)代生物與醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域的基礎(chǔ)技術(shù)及基本技能，也是細(xì)胞工程、基因工程和生物醫(yī)學(xué)工程的重要研究手段[1]。細(xì)胞培養(yǎng)室是進(jìn)行細(xì)胞相關(guān)研究活動(dòng)的重要場(chǎng)所，是生物與醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域科研產(chǎn)出的重要平臺(tái)，高效和科學(xué)的管理是細(xì)胞培養(yǎng)室正常運(yùn)行的重要保障[2]。細(xì)胞培養(yǎng)室在生物與醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域具有重要的地位，但由于細(xì)胞培養(yǎng)需要無(wú)菌操作，有別于其他實(shí)驗(yàn)室[3-4]，這為制定統(tǒng)一的細(xì)胞培養(yǎng)室管理標(biāo)準(zhǔn)增加了難度。目前，各大細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)平臺(tái)按照無(wú)菌操作的要求并結(jié)合自身的實(shí)際情況與發(fā)展目標(biāo)實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)室的管理。安徽醫(yī)科大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)平臺(tái)對(duì)運(yùn)行中遇到的各種管理問(wèn)題進(jìn)行不斷探索、改善，從而積累了一些經(jīng)驗(yàn)。本文從其實(shí)際經(jīng)驗(yàn)出發(fā)主要探討細(xì)胞培養(yǎng)室制度建設(shè)、環(huán)境管理以及安全管理等問(wèn)題，并對(duì)制度建設(shè)以及環(huán)境管理進(jìn)行重點(diǎn)闡述。

1 制度建設(shè)

1.1 準(zhǔn)入制度

申請(qǐng)使用細(xì)胞培養(yǎng)室的學(xué)生不限專業(yè)和年級(jí)，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)技能的差異性較大，如一名學(xué)生操作不當(dāng)可能造成整個(gè)培養(yǎng)室環(huán)境污染，這是細(xì)胞培養(yǎng)室管理上的一個(gè)難題。為此，本平臺(tái)制訂了準(zhǔn)入制度及準(zhǔn)入流程，如圖1所示。所有申請(qǐng)使用細(xì)胞培養(yǎng)室的人員均要接受培訓(xùn)，培訓(xùn)內(nèi)容包括實(shí)驗(yàn)室安全、各項(xiàng)制度、細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)理論、細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)際操作和儀器使用。通過(guò)理論講解讓學(xué)生初步了解細(xì)胞培養(yǎng)的概念、原理及應(yīng)用；通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)的教學(xué)視頻讓學(xué)生充分了解細(xì)胞培養(yǎng)的操作步驟及注意事項(xiàng)；通過(guò)實(shí)際操作能夠讓學(xué)生掌握細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)；在學(xué)生培訓(xùn)過(guò)程中，強(qiáng)調(diào)無(wú)菌的重要性，幫助其樹(shù)立無(wú)菌觀念[5]，并注重人才培養(yǎng)，在培訓(xùn)學(xué)生掌握基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)的同時(shí)，注重培養(yǎng)學(xué)生嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目蒲兴季S和素養(yǎng)，有利于其實(shí)驗(yàn)的開(kāi)展[5]。培訓(xùn)結(jié)束后的考核分理論與實(shí)際操作，考核合格后進(jìn)入過(guò)渡間實(shí)習(xí)1個(gè)月，過(guò)渡間是僅用于實(shí)習(xí)的專用細(xì)胞培養(yǎng)室，主要目的是不影響其他人實(shí)驗(yàn)，并完成對(duì)考核合格者技術(shù)掌握程度的評(píng)價(jià)。實(shí)習(xí)期未違規(guī)違紀(jì)，未出現(xiàn)污染方能長(zhǎng)期使用細(xì)胞培養(yǎng)室。

圖1 細(xì)胞培養(yǎng)室準(zhǔn)入流程

1.2 預(yù)約制度

本細(xì)胞培養(yǎng)室內(nèi)的每臺(tái)生物安全柜均安裝有智能化預(yù)約終端，同時(shí)制定了預(yù)約制度：使用人員一般提前一天預(yù)約生物安全柜的使用時(shí)段，并簡(jiǎn)單描述實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，經(jīng)審核通過(guò)使用。如實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)間前后15 min未刷開(kāi)儀器或使用時(shí)間超過(guò)預(yù)約時(shí)長(zhǎng)，或使用時(shí)長(zhǎng)不超過(guò)預(yù)約時(shí)長(zhǎng)的一半，系統(tǒng)會(huì)自動(dòng)扣除個(gè)人的信用分，如能按預(yù)約完成一次實(shí)驗(yàn)，系統(tǒng)會(huì)自動(dòng)加分，信用分低于一定分值將不能預(yù)約。預(yù)約制度保證了每臺(tái)生物安全柜在每個(gè)時(shí)段僅一人使用，可以促使學(xué)生規(guī)劃好實(shí)驗(yàn)流程，保證細(xì)胞培養(yǎng)平臺(tái)高效運(yùn)行，同時(shí)系統(tǒng)也記錄學(xué)生的使用信息，以便于查詢和統(tǒng)計(jì)。

1.3 儀器使用制度

為實(shí)現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)室內(nèi)儀器規(guī)范化管理，保證儀器高效運(yùn)轉(zhuǎn)，本平臺(tái)制定了儀器使用制度，主要內(nèi)容包括以下幾點(diǎn)：（1）細(xì)胞培養(yǎng)箱和冰箱劃分區(qū)域，不允許擅自動(dòng)用他人細(xì)胞或物品；（2）培養(yǎng)箱與冰箱的門(mén)打開(kāi)時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)，必須及時(shí)關(guān)閉；（3）使用人員發(fā)現(xiàn)儀器故障，立即告知專責(zé)教師；（4）每天的值日生須查看氣瓶壓力表以及培養(yǎng)箱顯示屏，發(fā)現(xiàn)異常須告知專責(zé)教師；（5）所有儀器須嚴(yán)格按照使用說(shuō)明進(jìn)行操作，不能隨意更改參數(shù)；（6）實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，離心機(jī)、細(xì)胞計(jì)數(shù)儀、生物安全柜和顯微鏡等儀器須關(guān)閉開(kāi)關(guān)。

1.4 液氮罐的使用及細(xì)胞凍存制度

細(xì)胞凍存與細(xì)胞復(fù)蘇是細(xì)胞培養(yǎng)中的關(guān)鍵技術(shù)，液氮罐是用來(lái)長(zhǎng)期儲(chǔ)存細(xì)胞最常用的設(shè)備[6]。本平臺(tái)制定了液氮罐的使用及細(xì)胞凍存制度。主要內(nèi)容包括以下幾條：（1）液氮容量的查看以及訂購(gòu)由專責(zé)教師負(fù)責(zé)，保證液氮罐內(nèi)始終含有足夠的液氮維持細(xì)胞活力；（2）按照第幾桿—第幾層—第幾排—第幾列將液氮罐內(nèi)的每一個(gè)凍存位置進(jìn)行編號(hào)，同時(shí)凍存管上標(biāo)記細(xì)胞名稱以及時(shí)間，將凍存管放入液氮罐時(shí)一定要在存放記錄本上登記每個(gè)凍存管的細(xì)胞名稱、放入的具體位置、時(shí)間以及存放人等信息，方便復(fù)蘇細(xì)胞時(shí)查找；（3）存取細(xì)胞時(shí)須穿戴好液氮罐室配備的專用護(hù)目鏡和手套，并速存速取，防止凍存管爆炸給操作人員帶來(lái)的傷害，保障操作者的安全。

2 環(huán)境管理

細(xì)胞培養(yǎng)室的環(huán)境對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)有著非常關(guān)鍵性的影響，良好的環(huán)境對(duì)實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行具有促進(jìn)作用，不良的環(huán)境可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡或細(xì)胞污染等，不僅造成了科研資源的浪費(fèi)，而且會(huì)耽誤實(shí)驗(yàn)進(jìn)程[7]。因此，細(xì)胞培養(yǎng)室的環(huán)境如何管理是每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)室都必須重點(diǎn)考慮的問(wèn)題。細(xì)胞培養(yǎng)室的環(huán)境管理可分為細(xì)胞污染預(yù)防和細(xì)胞污染處理。

2.1 細(xì)胞污染預(yù)防

細(xì)胞污染預(yù)防主要通過(guò)環(huán)境衛(wèi)生管理和儀器設(shè)備維護(hù)來(lái)實(shí)現(xiàn)，環(huán)境衛(wèi)生管理主要是通過(guò)每日值日和定期大掃除來(lái)完成。每日值日是通過(guò)安排并監(jiān)督每日的值日生對(duì)桌面、生物安全柜的臺(tái)面以及各個(gè)儀器的表面進(jìn)行清理并殺菌消毒；定期大掃除是定期對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)室內(nèi)的桌面、柜子、儀器、地面以及各死角進(jìn)行清理并殺菌消毒。儀器設(shè)備維護(hù)主要是指定期檢查、更換細(xì)胞培養(yǎng)室高效過(guò)濾系統(tǒng)、生物安全柜的過(guò)濾器、紫外燈管等設(shè)備配件，以及定期檢查液氮罐和超低溫冰箱等細(xì)胞存儲(chǔ)設(shè)備，確保設(shè)備能夠正常運(yùn)行[3]。

2.2 細(xì)胞污染處理

細(xì)胞污染是指混入細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境中，對(duì)細(xì)胞生存有害的成分和造成細(xì)胞不純的異物[8]。學(xué)生在進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)時(shí)，可能因操作不規(guī)范或?qū)嶒?yàn)物品滅菌不徹底等造成細(xì)胞污染[9]。輕則導(dǎo)致污染細(xì)胞廢棄，重則連帶污染培養(yǎng)箱內(nèi)其他細(xì)胞甚至整個(gè)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境，給科研工作帶來(lái)嚴(yán)重的損失和威脅[10]。因此，了解細(xì)胞污染類型并及時(shí)進(jìn)行檢測(cè)鑒別，從而清除污染，是成功培養(yǎng)細(xì)胞的重要因素。本平臺(tái)針對(duì)細(xì)菌污染[11]、真菌污染[10]、支原體污染[12]、“黑膠蟲(chóng)”污染[13]這4類常見(jiàn)的細(xì)胞污染總結(jié)了較為實(shí)用的檢測(cè)鑒別方法和清除步驟，見(jiàn)表1。

表1 細(xì)胞污染鑒別與清除

3 安全管理

細(xì)胞培養(yǎng)室存在多種危險(xiǎn)因素，除常見(jiàn)的幾種（如消防水電、危險(xiǎn)化學(xué)品和有毒有害廢棄物）以外，還包括高壓滅菌鍋、紫外線、液氮、二氧化碳?xì)馄康?。這些危險(xiǎn)因素如若管理不當(dāng)可能造成人員傷亡、儀器設(shè)備損壞及環(huán)境污染。為了實(shí)驗(yàn)操作人員的人身安全、儀器設(shè)備安全以及環(huán)境保護(hù)，細(xì)胞培養(yǎng)室必須加強(qiáng)安全管理。針對(duì)以上危險(xiǎn)因素，細(xì)胞培養(yǎng)室的管理人員須定期檢查電路、水管及儀器狀態(tài)，及時(shí)消除安全隱患[14]；危險(xiǎn)化學(xué)品須儲(chǔ)存于?；裰?，其存取由專人管理，并做好相關(guān)登記；實(shí)驗(yàn)人員須及時(shí)按照相關(guān)的規(guī)定對(duì)實(shí)驗(yàn)廢棄物進(jìn)行無(wú)害化處理，避免造成人員感染和環(huán)境污染；高壓滅菌鍋的操作人員須通過(guò)特種設(shè)備培訓(xùn)，并持有相關(guān)證書(shū)；禁止使用年檢不合格的高壓滅菌鍋；紫外燈照射時(shí)間須控制在適當(dāng)范圍，既能殺菌消毒，也能避免產(chǎn)生過(guò)多臭氧而危害實(shí)驗(yàn)人員健康；細(xì)胞凍存和復(fù)蘇須遵守以上“液氮罐的使用及細(xì)胞凍存制度”，避免液氮給操作人員造成的傷害；二氧化碳?xì)馄宽氈糜跉馄抗潭?，并將安全鏈條扣好，防止氣瓶?jī)A倒、噴射以及爆炸等造成事故。